國 立 中 興 大 學 植 物 病 理 學 系 Department of Plant Pathology National Chung-Hsing University 碩 士 學 位 論 文 Master Thesis 評 估 柚 子 精 油 及 檸 檬 桉 精 油 抑 制 植 物 病 原 菌 生 長 與 防 治 植 物 病 害 之 效 果 Evaluation of essential oil from pomelo (Citrus maxima Burm.) and lemon eucalyptus (Eucalyptus citriodora Hook.) on inhibition of plant pathogens and control of plant diseases 指 導 教 授.. 鍾 文 鑫 博 士 Dr. Wen-Hsin Chung 研 究 生.. 黃 建 睿 Chien-Jui Huang 中 華 民 國 一 百 零 四 年 四 月 Apr. 2015

國 立 中 興 大 學 植 物 病 理 學 系 Department of Plant Pathology National Chung-Hsing University 碩 士 學 位 論 文 Master Thesis 評 估 柚 子 精 油 及 檸 檬 桉 精 油 抑 制 植 物 病 原 菌 生 長 與 防 治 植 物 病 害 之 效 果 Evaluation of essential oil from pomelo (Citrus maxima Burm.) and lemon eucalyptus (Eucalyptus citriodora Hook.) on inhibition of plant pathogens and control of plant diseases 指 導 教 授.. 鍾 文 鑫 博 士 (Dr. Wen-Hsin Chung) 研 究 生.. 黃 建 睿 (Chien-Jui Huang) 中 華 民 國 一 百 零 四 年 四 月 Apr. 2015

致 謝 首 先, 還 是 要 感 謝 鍾 文 鑫 老 師 多 年 來 的 指 導, 在 實 驗 不 順 利 時 仍 持 續 幫 助 我, 讓 我 得 以 完 成 學 業, 繼 續 往 前 走, 謝 謝 老 師! 回 頭 想 想, 從 我 大 學 進 實 驗 室 到 現 在 已 經 過 了 7 年, 途 中 經 歷 了 許 多 的 變 化, 許 多 的 相 識 與 離 別, 如 今 輪 到 我 要 離 開 了, 心 中 也 是 有 些 不 捨, 想 必 未 來 我 會 十 分 懷 念 這 些 時 光 吧! 這 一 路 走 來, 總 共 換 了 3 個 題 目, 換 了 兩 次 方 向, 在 每 個 題 目 當 中 都 有 學 到 一 些 新 的 東 西, 有 一 些 新 的 想 法, 而 最 後 的 這 個 題 目, 縱 然 是 完 成 得 有 點 倉 促, 但 也 真 的 在 過 程 中 學 到 很 多, 甚 至 在 未 來, 這 個 實 驗 可 能 會 變 成 我 生 活 的 一 部 分 也 說 不 定 做 實 驗 的 過 程 中, 總 是 會 觀 察 到 一 些 有 趣 的 現 象, 其 中 有 些 有 是 從 許 多 次 的 失 敗 中 發 現, 但 在 我 所 參 考 的 過 去 文 獻 中 沒 看 到 的, 舉 例 而 言, 有 些 真 菌 ( 如 :PA01 Cmep1-3 等 ) 的 孢 子 發 芽 是 非 常 需 氧 的, 如 果 用 蓋 著 的 1.5ml 微 量 離 心 管 或 凹 底 玻 片 作 實 驗, 會 發 現 管 底 和 玻 片 中 間 的 孢 子 發 芽 率 很 低 之 類 的, 有 時 真 的 只 要 改 一 個 器 材 或 換 一 個 步 驟, 實 驗 就 可 以 有 很 大 的 改 善 相 信 在 未 來, 這 些 經 驗 也 會 對 我 的 工 作 有 所 幫 助, 所 以 我 也 要 感 謝 這 些 考 驗, 不 斷 給 我 激 勵, 帶 給 我 新 的 想 法 感 謝 實 驗 室 的 各 位 在 我 求 學 過 程 中 對 我 的 建 議 以 及 幫 助, 感 謝 系 上 老 師 們 這 7 年 來 的 指 導 與 協 助, 感 謝 王 智 立 老 師 與 鍾 文 全 老 師 的 改 正, 使 這 篇 論 文 更 加 完 整, 也 謝 謝 王 昇 陽 老 師 實 驗 室 的 人 們 在 分 析 樣 本 時 給 我 的 建 議 與 幫 助, 以 及 至 今 幫 助 支 持 我 求 學 的 家 人 們, 感 謝 一 路 陪 我 走 到 這 裡 的 元 婷, 以 及 所 有 在 這 些 年 來 幫 助 過 我 的 所 有 人 們, 謝 謝 你 們!

摘 要 本 研 究 以 臺 灣 常 見 農 產 廢 棄 物 柚 子 皮 與 常 綠 樹 木 檸 檬 桉 落 葉 為 精 油 萃 取 材 料, 並 透 過 蒸 餾 法 萃 取 柚 子 皮 和 檸 檬 桉 落 葉 中 的 精 油, 得 知 其 精 油 含 量 分 別 為 7.2% 與 0.74% 本 研 究 分 析 兩 種 精 油 之 主 要 有 效 成 份, 指 出 柚 子 精 油 中 的 主 要 成 分 為 檸 檬 烯, 約 含 96.27%; 而 檸 檬 桉 精 油 之 主 要 成 分 為 香 茅 醛 與 香 茅 醇, 含 量 分 別 約 為 43.69% 與 17.06% 由 於 精 油 具 揮 發 特 性, 本 研 究 測 試 精 油 以 薰 蒸 的 方 式 對 9 種 植 物 病 原 真 菌 抑 制 的 效 果, 得 知 未 稀 釋 之 柚 子 精 油 可 抑 制 草 莓 灰 黴 病 菌 GBS3-93 與 GBS1-104 菌 株 菌 絲 生 長 達 92.7% 與 100.0%, 然 對 綠 黴 病 菌 Cmep1-3 菌 株 則 有 促 進 生 長 效 果 於 檸 檬 桉 精 油 測 試 結 果 得 知, 當 稀 釋 10 倍 以 下 時, 可 抑 制 所 有 供 試 病 原 菌 達 96.6%-100.0% 本 研 究 亦 測 試 含 精 油 之 PDA 培 養 基 對 供 試 病 原 菌 的 抑 制 效 果, 顯 示 含 稀 釋 100 倍 柚 子 精 油 的 培 養 基 對 小 白 菜 炭 疽 病 菌 PA01 菌 株 與 草 莓 灰 黴 病 菌 GBS1-104 和 GBS3-93 菌 株 之 生 長 抑 制 率 較 佳, 分 別 有 89.8% 81.1% 及 73.4%, 然 對 Cmep1-3 菌 株 有 促 進 生 長 現 象 另 於 PDA 培 養 基 添 加 檸 檬 桉 精 油 測 試 結 果, 得 知 添 加 稀 釋 1,000 倍 檸 檬 桉 精 油 時, 即 可 抑 制 多 數 供 試 植 物 病 原 菌 株 生 長 孢 子 發 芽 的 抑 制 測 試 方 面, 針 對 6 種 供 試 病 原 菌 菌 株 為 對 象, 結 果 顯 示 稀 釋 50 倍 以 下 的 柚 子 精 油, 對 其 中 5 種 病 原 真 菌 抑 制 效 果 達 92.6% 以 上, 然 對 Cmep1-3 菌 株 則 具 促 進 孢 子 發 芽 效 果 (>65.4%) 而 檸 檬 桉 精 油 稀 釋 至 500 倍 時, 仍 對 所 有 供 試 病 原 菌 菌 株 孢 子 發 芽 具 有 80.1% 以 上 的 抑 制 效 果 本 研 究 進 一 步 將 精 油 以 不 同 濃 度 加 入 含 1,000 mg a. i./l 亞 托 敏 之 PDA 培 養 基 中, 得 知 添 加 稀 釋 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 後, 可 提 升 抑 制 抗 藥 性 GBS1-104 菌 株 與 非 抗 藥 性 GBS3-93 菌 株 生 長 達 100%; 而 添 加 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油, 則 可 提 升 抑 制 GBS1-104 菌 株 與 GBS3-93 菌 株 生 長 達 71.0% 與 100.0% 進 一 步 測 試 添 加 精 油 對 亞 托 敏 之 藥 效 增 加 效 果, 顯 示 稀 釋 1,000 倍 與 10,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 和 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油 對 亞 托 敏 之 藥 效 皆 有 提 升 效 果, 而 以 稀 釋 1,000 i

倍 之 檸 檬 桉 精 油 最 佳 本 研 究 測 試 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 對 胡 瓜 小 白 菜 生 長 及 草 莓 植 株 之 影 響, 指 出 稀 釋 20 倍 以 上 的 柚 子 精 油 對 小 白 菜 生 長 無 明 顯 影 響, 然 稀 釋 100 倍 以 下 之 檸 檬 桉 精 油, 則 會 對 所 有 供 試 植 株 造 成 白 灰 色 斑 點 之 藥 害 本 研 究 測 試 兩 種 精 油 小 白 菜 炭 疽 病 胡 瓜 炭 疽 病 及 草 莓 灰 黴 病 的 防 治 效 果, 處 理 方 式 為 接 種 病 原 菌 前 1 小 時 與 後 1 小 時 噴 施 精 油, 結 果 得 知 於 接 種 後 1 小 時 施 用 檸 檬 桉 精 油 之 效 果 最 佳, 而 草 莓 果 實 灰 黴 病 若 於 接 種 前 處 理 稀 釋 50 倍 之 柚 子 精 油 與 稀 釋 500 倍 之 檸 檬 桉 精 油 時, 有 促 進 發 病 的 現 象 本 研 究 證 實 柚 子 與 檸 檬 桉 精 油 具 防 治 植 物 病 害 與 降 低 抗 藥 性 發 生 之 潛 力, 未 來 可 進 一 步 測 試 精 油 於 溫 室 與 田 間 提 升 亞 托 敏 藥 效 之 效 果, 以 及 篩 選 適 當 的 施 用 方 法 或 劑 型, 將 精 油 開 發 為 可 實 際 應 用 之 防 治 資 材 關 鍵 字 : 精 油 柚 子 檸 檬 桉 抗 藥 性 農 業 廢 棄 物 ii

Abstract The essential oils of pomelo peel and lemon eucalyptus fallen leaves extracted by steam-distillation revealed that the essential oil content of pomelo peel and lemon eucalyptus fallen leaves was 7.2% and 0.74%, respectively. The chemical composition of the two essential oils analyzed by GC-MS showed that the major component of pomelo essential oil was limonene (96.27%) while the major components of lemon eucalyptus essential oil were citronellal (43.69%) and citronellol (17.06%). The antifungal activity of essential oils against 9 plant pathogens was tested by the volatile activity assay. The results of volatile activity assay showed that, 1X pomelo could decrease the growth of Botrytis cinerea GBS3-93 and GBS1-104 to 92.7% and 100.0%, respectively; however, it enhanced the growth of Penicillium digitatum Cmep1-3. Moreover, 10X lemon eucalyptus essential oil could decrease the growth of all tested pathogen at the rate of 96.6%-100.0%. Based on the results of poisoned food assay, which showed that PDA containing 100X pomelo essential oil could decrease the growth of Colletotrichum higginsianum PA01, B. cinerea GBS3-93 and GBS1-104 at the rate of 89.8%, 81.1% and 73.4%, but enhanced the growth of P. digitatum Cmep1-3. In contrast, PDA containing 1,000X lemon eucalyptus essential oil could completely inhibit the growth of most tested pathogens. Furthermore, the spore germination inhibiting tests showed that 50X pomelo essential oil could inhibit over 92.6% spore germination of 5 tested pathogens while facilitate spore germination of P. digitatum Cmep1-3(>65.4%). In contrast, 500X lemon eucalyptus essential oil could inhibit over 80.1% spore germination of all tested pathogens. In this study, adding 100X pomelo essential oil, or 1,000X and 10,000X lemon eucalyptus essential oil to PDA containing 1,000 mg a. i./l azoxystrobin showed enhanced efficacies on inhibiting azoxystrobin resistant and iii

sensitive B. cinerea isolates. This effect could also be observed in the experiment which added 100X pomelo essential oil or 1,000X and 10,000X lemon eucalyptus essential oil into PDA containing different concentrations of azoxystrobin. Phytotoxicity tests of essential oils on cucumber, Chinese cabbage and strawberry leaves showed that 20X pomelo and 100X lemon eucalyptus essential oil would damage the leaves of cucumber and strawberry. The control efficacies of anthracnose of Chinese cabbage and cucumber, and gray mold of strawberry indicated that spraying essential oils 1 hour after inoculation would reduce the disease severities of gray mold on strawberry fruit; however, spraying 50X pomelo and 500X lemon eucalyptus essential oils 1 hour before inoculation increased the disease severity. This study showed that pomelo and lemon eucalyptus essential oils are potential diseasecontrol agents to reduce the risk of fungicide-resistance. Keywords: essential oil, pomelo, lemon eucalyptus, fungicide-resistance, agriculture wastes iv

目 次 中 文 摘 要... i 英 文 摘 要... ⅲ 目 次... v 表 次 目 錄... ⅶ 圖 次 目 錄... ⅷ 前 言... 1 材 料 與 方 法... 5 一 供 試 菌 株 與 植 株... 5 二 精 油 萃 取... 5 三 利 用 氣 象 層 析 質 譜 聯 用 技 術 (Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) 分 析 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 中 之 有 效 成 分... 6 四 測 試 柚 子 皮 與 檸 檬 桉 葉 片 精 油 對 病 原 菌 生 長 抑 制 效 果... 6 ( 一 ) 薰 蒸 效 果 測 試... 6 ( 二 ) 精 油 培 養 基 對 菌 絲 生 長 抑 制 效 果 測 試... 6 ( 三 ) 精 油 對 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果 測 試... 7 五 於 農 藥 中 添 加 精 油 對 具 抗 藥 性 草 莓 灰 徽 病 菌 菌 株 生 長 抑 制 效 果 測 試... 7 六 農 藥 添 加 精 油 對 於 藥 效 的 提 升 效 果 測 試... 8 七 精 油 對 植 物 生 長 的 影 響 測 試... 8 八 評 估 精 油 防 治 植 物 病 害 之 效 果... 8 ( 一 ) 於 定 溫 生 長 箱 中 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 之 效 果 評 估... 8 ( 二 ) 於 定 溫 生 長 箱 中 精 油 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 之 效 果 評 估... 9 ( 三 ) 於 保 濕 環 境 中 精 油 防 治 草 莓 灰 黴 病 之 效 果 評 估... 9 ( 四 ) 於 保 濕 環 境 下 精 油 防 治 草 莓 果 實 灰 黴 病 之 效 果 評 估... 10 v

九 統 計 分 析... 11 結 果... 12 一 精 油 之 萃 取... 12 二 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 中 之 有 效 成 分 分 析... 12 三 測 試 柚 子 皮 與 檸 檬 桉 葉 片 精 油 對 病 原 菌 的 抑 制 效 果... 12 ( 一 ) 測 試 薰 蒸 效 果... 12 ( 二 ) 測 試 精 油 培 養 基 對 菌 絲 生 長 抑 制 效 果... 13 ( 三 ) 測 試 精 油 對 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果... 14 四 測 試 農 藥 添 加 精 油 對 具 抗 藥 性 草 莓 灰 徽 病 菌 生 長 抑 制 效 果... 15 五 測 試 農 藥 添 加 精 油 對 藥 效 提 升 效 果... 15 六 測 試 精 油 對 植 物 的 影 響... 16 七 評 估 精 油 防 治 植 物 病 害 之 效 果... 16 ( 一 ) 定 溫 生 長 箱 中 測 試 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 之 效 果... 16 ( 二 ) 定 溫 生 長 箱 中 精 油 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 之 效 果... 16 ( 三 ) 保 濕 環 境 中 精 油 防 治 草 莓 葉 部 灰 黴 病 之 效 果... 17 ( 四 ) 於 保 濕 環 境 下 精 油 防 治 草 莓 果 實 灰 黴 病 之 效 果... 17 討 論... 19 參 考 文 獻... 25 vi

表 次 目 錄 表 一 本 試 驗 中 使 用 之 菌 株... 29 表 二 以 柚 子 精 油 薰 蒸 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 之 生 長 抑 制 效 果... 30 表 三 以 檸 檬 桉 精 油 薰 蒸 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 之 生 長 抑 制 效 果... 31 表 四 柚 子 精 油 培 養 基 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 菌 絲 生 長 抑 制 效 果... 32 表 五 檸 檬 桉 精 油 培 養 基 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 菌 絲 生 長 抑 制 效 果... 33 表 六 柚 子 精 油 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果... 34 表 七 檸 檬 桉 精 油 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果... 35 表 八 1,000 mg a.i./l 亞 托 敏 添 加 於 不 同 濃 度 精 油 對 草 莓 灰 徽 病 菌 菌 株 生 長 抑 制 效 果... 36 表 九 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 的 效 果... 37 表 十 精 油 對 胡 瓜 炭 疽 病 的 防 治 效 果... 38 表 十 一 精 油 防 治 草 莓 葉 部 灰 黴 病 的 效 果... 39 表 十 二 精 油 防 治 草 莓 果 實 灰 黴 病 的 效 果... 40 vii

圖 次 目 錄 圖 一 柚 子 皮 為 台 灣 主 要 的 農 業 廢 棄 物 之 一... 41 圖 二 精 油 蒸 餾 萃 取 裝 置 示 意 圖... 42 圖 三 柚 子 精 油 之 氣 相 層 析 圖... 43 圖 四 柚 子 精 油 主 成 分 與 檸 檬 烯 之 質 譜 圖... 44 圖 五 檸 檬 桉 精 油 之 氣 相 層 析 圖... 45 圖 六 化 合 物 B 與 香 茅 醛 之 質 譜 圖... 46 圖 七 化 合 物 D 與 香 茅 醇 之 質 譜 圖... 47 圖 八 化 合 物 E 與 乙 酸 香 葉 酯 之 質 譜 圖... 48 圖 九 化 合 物 F 與 丁 香 烯 之 質 譜 圖... 49 圖 十 於 不 同 濃 度 亞 托 敏 添 加 柚 子 或 檸 檬 桉 精 油 對 抗 亞 托 敏 草 莓 灰 徽 病 菌 菌 株 (GBS1-104) 生 長 抑 制 效 果 測 試... 50 圖 十 一 精 油 對 胡 瓜 葉 片 的 影 響... 51 圖 十 二 精 油 對 小 白 菜 葉 片 的 影 響... 52 圖 十 三 精 油 對 草 莓 葉 片 的 影 響... 53 viii

前 言 近 年 來 由 於 安 全 農 業 的 概 念 逐 漸 受 到 重 視, 有 機 農 業 開 始 迅 速 發 展, 許 多 化 學 農 藥 的 替 代 品 開 始 被 開 發 與 推 廣 使 用, 如 天 然 植 物 資 材 拮 抗 微 生 物 油 劑 亞 磷 酸 等, 其 中 植 物 萃 取 液 被 認 為 是 具 有 發 展 成 防 治 試 劑 潛 力 的 一 類 天 然 植 物 資 材 (Hsieh et al., 2005) 由 於 植 物 不 具 有 自 由 移 動 的 能 力, 為 了 抵 抗 外 來 的 威 脅 與 各 種 環 境 逆 境, 許 多 植 物 演 化 出 可 產 生 多 種 具 生 物 活 性 之 二 次 代 謝 物 的 能 力 (Chiang, 2011), 而 這 些 植 物 常 被 人 們 當 作 藥 材 香 料 或 飲 料, 如 枸 杞 (Chinese wolfberry, Lycium barbarum L.) 人 參 (ginseng, Panax ginseng C.A. Meyer) 蔥 (welsh onion, Allium fistulosum L.), 蒜 (garlic, Allium sativum L.) 茶 葉 (tea tree, Camellia sinensis L.) 等 (Yeh, 1998) 植 物 萃 取 液 (plant extracts) 是 透 過 水 乙 醇 甲 醇 乙 酸 乙 酯 或 正 己 烷 等 溶 劑 將 有 效 成 分 萃 取 出 來, 在 植 物 病 害 防 治 上 的 應 用 非 常 廣 泛 (Fan, 2008) Hsieh 氏 等 人 (2005) 曾 報 導 67 種 植 物 的 水 或 50% 乙 醇 萃 取 液 對 4 種 常 見 病 原 菌 生 長 具 抑 制 效 果, 其 中 4 種 萃 取 液 對 蕙 蘭 細 斑 病 菌 (Fusarium proliferatum (Matsushima) Nirenberg ex Gerlach et Nirenberg F801) 19 種 萃 取 液 對 小 白 菜 炭 疽 病 菌 (Colletotrichum higginsianum Saccardo PA01) 7 種 萃 取 液 對 十 字 花 科 黑 斑 病 菌 (Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire ABA31) 5 種 萃 取 液 對 百 合 灰 黴 病 菌 (Botrytis elliptica (Berkeley) Cooke B066) 之 孢 子 發 芽 有 顯 著 抑 制 效 果 Fan 氏 等 人 (2008) 的 報 告 中 亦 指 出, 龍 葵 (garden nightshade, Solanum nigrum Linn.) 粗 萃 取 液 可 抑 制 A. brassicicola (ABA31 與 ABB 16) 菌 株 之 孢 子 發 芽 率 達 33-42% 另 植 物 萃 取 液 中, 有 部 分 成 分 由 於 沸 點 較 低, 易 揮 發, 因 此 可 以 用 成 本 低, 操 作 簡 易 的 水 蒸 氣 蒸 餾 法 加 以 萃 取, 而 這 類 的 物 質, 被 稱 為 植 物 精 油 (essential oil) (Lin et al., 2007) 1

植 物 精 油 為 一 類 由 植 物 本 身 製 造 的 揮 發 性 化 合 物, 具 有 特 殊 的 氣 味, 目 前 已 有 報 導 指 出, 精 油 在 植 物 的 防 禦 反 應 過 程 中 可 能 扮 演 重 要 角 色 (Bakkali et al., 2008), 且 某 些 精 油 具 有 殺 真 菌 (Sharma and Tripathi, 2006; Vitoratos et al., 2013; Jing et al., 2014) 殺 細 菌 (Kim et al., 1995) 及 抗 蟲 (Choi et al., 2006) 等 功 效 此 外, 精 油 也 常 被 應 用 在 日 常 生 活 中, 如 食 品 保 鮮 劑 驅 蟲 劑 及 抗 菌 劑 等 (Fisher and Phillips, 2008); 而 在 醫 學 上 亦 可 被 用 作 止 痛 劑 鎮 靜 劑 (Bakkali et al., 2008) 消 炎 藥 (Silva et al., 2003) 及 抗 氧 化 劑 (Singh et al., 2012) 目 前 大 部 分 被 使 用 的 精 油 皆 來 自 於 香 草 植 物, 這 些 植 物 由 於 葉 片 枝 條 樹 皮 等, 經 過 搓 揉 後 會 散 發 出 特 別 的 氣 味, 如 : 脣 形 花 科 的 迷 迭 香 (rosemary, Rosmarinus officinalis L.) 薰 衣 草 (lavender, Lavandula stoechas subsp. stoechas L.) 牛 至 (origanum, Origanum syriacum var. bevanii L.) (Soylu et al., 2010) 菊 科 的 洋 甘 菊 (Chamomile, Matricaria chamomilla L.) 桃 金 孃 科 的 檸 檬 桉 (lemon eucalyptus, Eucalyptus citriodora Hook.) 及 芸 香 科 的 芸 香 (ruta, Ruta graveolens Linn.) 與 柚 子 (pomelo, Citrus maxima Burm.) (Jing et al., 2014) 等 其 中, 芸 香 科 柑 橘 屬 與 桃 金 孃 科 桉 屬 植 物 的 精 油, 近 年 來 在 植 物 保 護 上 的 應 用 逐 漸 被 重 視, 且 部 分 精 油 已 被 開 發 成 保 護 製 劑 (Ramezani et al., 2002; Batish et al., 2006; Batish et al., 2008; Fisher and Phillips, 2008; Jing et al., 2014) 芸 香 科 柑 橘 屬 植 物 中 有 許 多 重 要 的 水 果, 如 橙 (orange, Citrus sinensis L.) 柚 子 葡 萄 柚 (grapefruit, Citrus paradisi MacFad.) 檸 檬 (lemon, Citrus limon L.) 等, 主 要 作 為 鮮 食 調 味 料 或 果 汁 原 料 使 用, 其 主 要 食 用 部 位 為 富 含 水 分 的 果 肉, 而 少 數 種 類 的 果 皮 可 作 為 中 藥 材 或 香 料 使 用, 然 大 部 分 仍 會 被 視 為 農 業 廢 棄 物 丟 棄 ( 圖 一 ) 事 實 上, 柑 橘 類 外 果 皮 含 有 大 量 的 糖 與 果 膠, 可 作 為 生 質 燃 料 與 果 膠 萃 取 的 原 料 ; 此 外, 果 皮 中 的 油 囊 細 胞 (oil glands) 內 含 有 大 量 精 油, 可 作 為 萃 取 精 油 的 材 料 (Ladaniya, 2008) 目 前, 柑 橘 精 油 已 被 報 導 具 有 抑 制 細 菌 生 長 (Fisher and Phillips, 2006), 並 作 為 食 物 保 鮮 劑 的 潛 力 (Fisher and 2

Phillips, 2008; Jing et al., 2014); 而 柑 橘 精 油 的 主 要 成 分 為 檸 檬 烯 (limonene), 具 抗 癌 能 力, 被 報 導 可 抑 制 大 鼠 體 內 腫 瘤 的 增 長 (Elegbede et al., 1984), 且 具 有 治 療 乳 癌 的 潛 力 (Miller et al., 2013) 於 農 業 應 用 上,Neeta 與 Abhishek 兩 氏 (2006) 曾 指 出,700 mg a.i./l 的 柳 橙 精 油 可 用 於 防 治 10 種 病 原 菌 所 引 起 的 儲 藏 期 病 害, 且 透 過 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 的 觀 察, 證 實 柳 橙 精 油 可 造 成 Aspergillus niger 的 菌 絲 縊 縮 與 破 壞 細 胞 壁 Kuate 氏 等 人 (2006) 的 研 究 亦 得 知, 萃 取 自 抗 柑 橘 斑 點 病 (citrus leaf and fruit spot disease) 之 柑 橘 品 種 的 精 油 可 抑 制 引 起 該 病 害 之 病 原 菌 (Phaeoramularia angolensis (T. Carvalho & O. Mendes) P.M. Kirk) 菌 絲 生 長 超 過 87%, 且 降 低 孢 子 發 芽 率 達 100% 此 外, 檸 檬 精 油 可 利 用 薰 蒸 方 式, 降 低 由 B. cinerea 所 引 起 胡 瓜 儲 藏 期 病 害 的 嚴 重 度 (Vitoratos et al., 2013) 另 依 Jing 氏 等 人 (2014) 綜 述, 柑 橘 屬 的 精 油 對 34 種 以 上 的 植 物 病 原 菌 生 長 有 抑 制 效 果, 主 要 的 抑 菌 成 分 為 檸 檬 烯, 且 依 柑 橘 種 類 的 不 同, 含 量 介 於 31% 至 97% 之 間, 而 以 柚 子 精 油 中 的 檸 檬 烯 含 量 最 高, 可 達 96.62% 柚 子 是 熱 帶 地 區 常 見 水 果, 全 球 每 年 平 均 產 量 超 過 6,000,000 公 噸, 特 別 是 在 華 人 地 區, 柚 子 是 中 秋 節 慶 的 象 徵 性 水 果,2013 年 東 亞 地 區 柚 子 產 量 高 達 3,800,000 公 噸 (Food and agriculture organization of the united nations statistics division, http://faostat3.fao.org ) 在 台 灣, 柚 子 種 植 面 積 約 有 4,271 公 頃, 每 年 產 量 可 達 60,000 70,000 公 噸 (102 年 農 業 統 計 年 報,http://agrstat.coa.gov.tw/sdweb/public/book/Book.aspx), 且 柚 子 精 油 已 被 報 導 對 11 種 植 物 病 原 菌 有 抑 制 效 果 (Jing et al., 2014) 檸 檬 桉 (Eucalyptus citriodora Hook.) 為 桃 金 孃 科 桉 屬 的 植 物, 因 其 枝 葉 會 散 發 檸 檬 般 的 香 氣 而 得 名, 且 樹 勢 高 大, 葉 多, 枝 幹 光 滑, 生 長 快 速, 具 有 脫 落 性 的 樹 皮 為 其 重 要 特 徵 (Batish et al., 2006); 而 在 世 界 各 地 亦 常 被 作 為 紙 漿 與 香 水 的 原 料 使 用 (Akhtar et al., 2014) 於 應 用 方 面, 檸 檬 桉 精 油 被 報 導 可 用 於 輔 助 治 療 人 類 後 天 免 疫 缺 乏 症 候 群 (AIDS) 所 併 發 的 結 核 菌 (tuberculosis) 感 染 (Ramos Alvarenga et al., 2014); 在 動 物 醫 學 上 可 利 用 微 膠 囊 的 形 式, 作 為 治 療 綿 羊 腸 胃 3

線 蟲 (sheep gastrointestinal nematodes) 感 染 的 藥 劑 (Ribeiro et al., 2014) 農 業 應 用 方 面, 亦 證 實 檸 檬 桉 精 油 可 當 作 殺 真 菌 劑 (Ramezani et al., 2002) 或 殺 蟲 劑 (Batish et al., 2008) Tripathi 氏 等 人 (2008) 曾 指 出,500 mg /L 檸 檬 桉 精 油 可 完 全 抑 制 葡 萄 灰 黴 病 菌 (Botrytis cinerea Persoon) 的 生 長 達 100%;Javed 氏 等 人 (2012) 亦 指 出, 檸 檬 桉 精 油 對 Aspergillus terreus Thom A. nidulans (Eidam) G.Winter A. fumigatus Fresenius 及 A. flavus Link 等 四 種 Aspergillus 屬 的 真 菌 生 長 有 抑 制 的 效 果, 被 認 為 具 防 治 儲 藏 期 病 害 的 潛 力 此 外, 由 於 檸 檬 桉 具 有 明 顯 的 毒 他 效 應 (allelopathy), 而 此 效 應 被 認 為 與 其 精 油 成 分 有 明 顯 關 係, 故 檸 檬 桉 精 油 也 被 認 為 是 一 類 有 潛 力 的 天 然 殺 草 劑 (Batish et al., 2006) 檸 檬 桉 精 油 的 主 成 分 為 香 茅 醛 (Citronellal), 可 作 為 防 蚊 液 的 成 分 使 用 (Kim et al., 2005), 且 具 抗 真 菌 的 效 果 (Nakahara et al., 2003), 被 認 為 是 檸 檬 桉 精 油 中 主 要 具 有 殺 草 效 果 的 成 分 (Batish et al., 2006) 由 於 史 托 比 類 (strobilurin) 殺 菌 劑 的 作 用 位 置 專 一, 且 被 長 期 大 量 使 用, 其 抗 藥 性 問 題 日 趨 嚴 重 (http://www.frac.info/), 其 中 亞 托 敏 (azoxystrobin) 在 台 灣 被 用 於 多 種 植 物 病 害 的 防 治, 在 草 莓 上 可 用 來 防 治 果 腐 病 (phytophthora fruit rot) (http://pesticide.tactri.gov.tw/), 而 目 前 已 在 同 樣 屬 於 草 莓 果 實 病 原 菌 的 灰 黴 病 菌 (B. cinerea) 的 田 間 族 群 中 發 現 具 有 抗 藥 性 的 菌 株 (Chen, 2008) 故 尋 找 與 開 發 低 抗 藥 性 風 險 之 病 害 防 治 資 材 為 現 今 重 要 的 課 題 之 一 本 研 究 目 的 為,1 ) 蒐 集 柚 子 果 皮 與 檸 檬 桉 落 葉 等 農 業 廢 棄 物 作 為 萃 取 精 油 的 原 料, 測 試 其 對 六 種 常 見 植 物 病 原 真 菌 菌 絲 生 長 與 孢 子 發 芽 的 抑 制 效 果 ;2 ) 將 添 加 兩 種 精 油 後, 測 試 對 具 抗 史 托 比 類 藥 劑 草 莓 灰 黴 病 菌 株 生 長 之 抑 制 效 果,3 ) 進 一 步 評 估 其 對 草 莓 灰 黴 病 胡 瓜 炭 疽 病 及 小 白 菜 炭 疽 病 的 防 治 效 果 4

材 料 與 方 法 一 供 試 菌 株 與 植 株 本 研 究 供 試 菌 株 由 國 立 中 興 大 學 植 物 寄 生 菌 暨 菌 類 抗 藥 性 分 子 診 斷 研 究 室 與 中 興 大 學 植 物 害 管 理 研 究 室 提 供, 包 括 小 白 菜 炭 疽 病 菌 (Colletotrichum higginsianum) 菌 株 編 號 PA01 胡 瓜 炭 疽 病 菌 (C. orbiculare (Berk. & Mont.) Arx) 菌 珠 編 號 CO-51 草 莓 炭 疽 病 菌 (C. gloeosporioides (Penzig) Penzig et Saccardo) 菌 株 編 號 CSG 7-3 草 莓 灰 黴 病 菌 (Botrytis cinerea) 菌 株 編 號 GBS3-93 和 GBS1-104 茄 科 疫 病 菌 (Phytophthora capsici Leonian) 菌 株 編 號 PC 番 石 榴 瘡 痂 病 菌 (Pestalotiopsis sp.) 編 號 為 PG6-3 蘭 花 黃 葉 病 菌 (Fusarium solani f. sp. phalaenopsis (Mart.) Sacc.) 編 號 為 CPY-01A 及 香 水 檸 檬 (Citrus medica L. var. medica) 綠 黴 菌 (Penicillium digitatum (Pers.) Sacc.) 編 號 為 Cmep1-3 另 實 驗 中 供 試 植 株 為 農 友 公 司 的 三 鳳 二 號 小 白 菜 (Brassica campestris L. Chinese Group), 草 莓 (Fragaria ananassa Duchesne) 植 株 品 種 為 香 水, 果 實 品 種 為 豐 香, 胡 瓜 (Cucumis sativus L.) 品 種 為 彩 綠 二 號 本 研 究 中 精 油 萃 取 材 料 為 柚 子 果 皮 與 檸 檬 桉 葉 片, 柚 子 品 種 為 文 旦 (C. maxima Burm. f. buntan Hayata), 購 自 台 中 市 南 區 的 水 果 商 場 ; 而 檸 檬 桉 葉 片 則 蒐 集 自 國 立 中 興 大 學 校 園 內 種 植 之 檸 檬 桉 樹 二 精 油 萃 取 本 研 究 萃 取 精 油 之 方 法 修 改 自 Charles 與 Simon 兩 氏 (1990) 所 發 表 的 蒸 餾 萃 取 法, 使 用 裝 置 如 圖 二 將 100 g 的 材 料 以 磨 碎 機 打 碎, 裝 入 1 L 錐 形 瓶 中, 加 入 800 ml 的 一 次 逆 滲 透 過 濾 水 與 攪 拌 子, 將 裝 置 管 線 組 合 後 以 陶 瓷 加 熱 攪 拌 器 攪 拌 並 加 熱, 冷 卻 管 通 以 0 o C-4 o C 之 冷 水, 於 收 集 處 置 放 250 ml 錐 形 瓶, 並 置 於 冷 卻 槽 中 持 續 加 熱 2 小 時 後, 將 收 集 瓶 取 下, 置 於 4 o C 冰 箱 中 靜 置, 待 分 層 後 收 集 上 層 精 油 至 乾 淨 樣 本 瓶 中 秤 重, 並 計 算 回 收 率 5

三 利 用 氣 相 層 析 質 譜 聯 用 技 術 (Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) 分 析 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 中 之 有 效 成 分 精 油 的 成 分 是 於 中 興 大 學 森 林 系 林 木 代 謝 體 學 暨 天 然 藥 物 開 發 研 究 室 中 之 氣 相 層 析 質 譜 儀 (gas chromatograph mass spectrometer, GC-MS) ( 型 號 :TRACE GC ULTRA-ITQ 900) 進 行 分 析 使 用 的 管 柱 為 DB-5MS 長 度 30 m 內 徑 0.25 µm 載 送 氣 體 為 氦 氣 流 速 為 1 ml/min, 分 流 比 為 1:60, 起 始 溫 度 為 50 o C 維 持 1 min, 接 下 來 以 每 分 鐘 4 o C 的 速 率 加 溫 至 180 o C, 再 改 為 每 分 鐘 15 o C 的 速 率 加 熱 至 280 o C, 並 維 持 10 mins 將 成 分 分 析 結 果 與 National Institute of Standards and Technology (NIST) 資 料 庫 進 行 質 譜 比 對, 並 和 現 有 文 獻 比 較, 以 找 出 可 能 的 有 效 物 質 四 測 試 柚 子 皮 與 檸 檬 桉 葉 片 精 油 對 病 原 菌 生 長 抑 制 效 果 ( 一 ) 薰 蒸 效 果 測 試 將 供 試 病 原 菌 先 培 養 在 馬 鈴 薯 蔗 糖 瓊 脂 培 養 基 (potato sugar agar, PSA)1-2 天 後, 以 直 徑 3 mm 的 圓 形 打 孔 器 切 取 菌 落 邊 緣 菌 絲 塊, 移 至 新 的 PSA 培 養 基 中 央, 倒 置 培 養 基, 在 培 養 基 蓋 中 央 放 置 直 徑 8 mm 圓 形 濾 紙 片, 滴 上 100 µl 未 稀 釋 之 柚 子 精 油 ( 揮 發 後 濃 度 約 為 1,176 mg /L air), 或 以 tween 20 (0.01%) 乳 化 後, 稀 釋 10 20 50 及 100 倍 的 柚 子 精 油 ( 揮 發 後 濃 度 約 為 118 mg /L air 59 mg /L air 24 mg /L air 及 12 mg /L air), 與 稀 釋 10 50 及 100 倍 的 檸 檬 桉 精 油 ( 揮 發 後 濃 度 約 為 118 mg /L air 24 mg /L air 及 12 mg /L air), 本 研 究 之 對 照 組 為 水 和 tween 20 (0.01%), 完 成 後 以 封 口 蠟 膜 (parafilm) 將 培 養 基 密 封 灰 黴 病 菌 B. cinerea (GBS3-93 GBS1-104) 置 於 20 o C, 其 餘 病 原 菌 則 置 於 25 o C, 於 每 日 照 光 12 小 時 之 定 溫 生 長 箱 中 培 養, 於 2 天 後 測 量 其 菌 落 生 長 大 小 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 3 重 複, 試 驗 重 複 2 次 ( 二 ) 精 油 培 養 基 對 菌 絲 生 長 抑 制 效 果 測 試 6

柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 以 tween 20 (0.01%) 乳 化 後, 加 入 已 滅 菌 且 溫 度 約 為 40 o C 之 馬 鈴 薯 瓊 脂 葡 萄 醣 培 養 基 (potato dextrose agar, PDA) 中, 分 別 配 成 含 稀 釋 100 1,000 及 10,000 倍 柚 子 精 油 ( 濃 度 約 為 10,000 mg /L 1,000 mg /L 及 100 mg /L) 和 含 稀 釋 1,000 10,000 及 100,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 ( 濃 度 約 為 1,000 mg /L 100 mg /L 及 10 mg /L) 培 養 基 將 供 試 植 物 病 原 真 菌 之 3 mm 菌 絲 塊 接 種 至 培 養 基 上,B. cinerea (GBS3-93 GBS1-104) 菌 株 置 於 20 o C, 其 餘 菌 株 則 置 於 25 o C, 於 每 日 照 光 12 小 時 之 定 溫 生 長 箱 中 培 養,2 天 後 測 量 其 菌 落 生 長 大 小 本 試 驗 各 處 理 為 4 重 複, 試 驗 重 複 2 次 ( 三 ) 精 油 對 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果 測 試 將 培 養 7 天 之 C. higginsianum PA01 F. solani f. sp. phalaenopsis CPY-01A 及 P. digitatum Cmep1-3 菌 株, 與 培 養 14 天 C. gloeosporioides CSG 7-3 C. orbiculare CO-51 B. cinerea (GBS3-93 GBS1-104) 及 Pestalotiopsis sp. PG6-3 的 孢 子 分 別 以 含 6% (M/M) 蔗 糖 (sucrose) 之 無 菌 水 洗 下, 配 成 10 5-10 6 spores/ ml 的 孢 子 懸 浮 液, 於 1.5 ml 微 量 離 心 管 中 與 以 tween 20 (0.01%) 稀 釋 5 10 25 及 50 倍 的 柚 子 精 油 或 稀 釋 250 500 750 1,000 及 1,500 倍 的 檸 檬 桉 精 油 混 合 (V:V=1:1), 調 整 容 器 中 柚 子 精 油 的 最 終 濃 度 為 10 20 50 及 100 倍 ; 檸 檬 桉 精 油 最 終 濃 度 為 500 1,000 1,500 及 2,000 倍 均 勻 混 合 後 將 含 精 油 之 孢 子 懸 浮 液 滴 於 乾 淨 載 玻 片 上, 蓋 上 蓋 玻 片, 放 入 置 有 三 角 玻 棒 的 培 養 皿 中,B. cinerea (GBS3-93 GBS1-104) 置 於 20 o C, 其 餘 則 置 於 25 o C, 於 每 日 照 光 12 小 時 之 定 溫 生 長 箱 中, 於 24 小 時 後 記 錄 孢 子 的 發 芽 率, 並 計 算 抑 制 率 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 3 重 複, 試 驗 重 複 2 次 五 於 農 藥 中 添 加 精 油 對 具 抗 藥 性 草 莓 灰 徽 病 菌 菌 株 生 長 抑 制 效 果 測 試 參 考 Huang 氏 (2013) 的 方 法, 將 精 油 與 市 售 23% 亞 托 敏 水 懸 劑 ( 挺 力, 貝 士 得 開 發 企 業 有 限 公 司 ) 混 合, 添 加 於 已 滅 菌 且 溫 度 約 為 40 o C 的 PDA 中, 配 成 7

含 亞 托 敏 有 效 成 分 1,000 mg a.i./l 且 含 稀 釋 100 1,000 及 10,000 倍 柚 子 精 油 和 含 稀 釋 1,000 10,000 及 100,000 倍 檸 檬 桉 精 油 的 培 養 基 將 抗 藥 性 的 B. cinerea GBS1-104 菌 株 與 非 抗 藥 性 的 GBS3-93 菌 株 置 於 上 述 培 養 基, 於 20 o C 每 日 照 光 12 小 時 之 定 溫 生 長 箱 中 培 養 2 天 並 記 錄 菌 絲 生 長 情 形 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 4 重 複, 試 驗 重 複 2 次 六 農 藥 添 加 精 油 對 於 藥 效 的 提 升 效 果 測 試 將 精 油 與 市 售 23% 亞 托 敏 水 懸 劑 ( 挺 力, 貝 士 得 開 發 企 業 有 限 公 司 ) 混 合 後, 添 加 於 已 滅 菌 且 溫 度 約 為 40 o C 的 PDA 中, 配 製 成 含 亞 托 敏 有 效 成 分 0 50 100 500 及 1,000 mg a.i./l 且 含 稀 釋 100 倍 柚 子 精 油 或 含 稀 釋 1,000 及 10,000 倍 檸 檬 桉 精 油 的 培 養 基 將 抗 藥 性 的 B. cinerea GBS1-104 菌 株 接 種 於 上 述 培 養 基, 於 20 o C 每 日 照 光 12 小 時 之 定 溫 生 長 箱 中 培 養 2 天 並 記 錄 菌 絲 生 長 情 形 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 4 重 複, 試 驗 重 複 2 次 七 精 油 對 植 物 生 長 的 影 響 測 試 取 株 齡 14 天 的 小 白 菜 與 胡 瓜 植 株 和 已 有 3~4 片 真 葉 的 草 莓, 噴 灑 3 ml 稀 釋 20 50 及 100 倍 的 柚 子 精 油 與 100 500 及 1,000 倍 的 檸 檬 桉 精 油, 將 草 莓 植 株 置 於 20 o C, 胡 瓜 與 小 白 菜 置 於 28 o C 每 日 照 光 12 小 時 之 定 溫 生 長 箱 中 生 長,7 天 後 觀 察 其 生 長 情 形 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 3 株, 試 驗 重 複 2 次 八 評 估 精 油 防 治 植 物 病 害 之 效 果 ( 一 ) 於 定 溫 生 長 箱 中 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 之 效 果 評 估 參 考 Hsu (2012) 所 發 表 接 種 小 白 菜 炭 疽 病 的 方 法, 取 生 長 於 28 o C, 每 日 照 光 12 小 時, 株 齡 14 天 的 小 白 菜, 接 種 濃 度 10 6 spores/ ml 小 白 菜 炭 疽 病 菌 的 孢 子 懸 浮 液 3 m l 精 油 施 用 方 式 分 別 為 接 種 病 原 菌 前 1 小 時 與 後 1 小 時 噴 灑 3 ml; 而 精 油 施 用 濃 度 為 稀 釋 50 與 100 倍 的 柚 子 精 油, 或 稀 釋 500 與 1,000 倍 8

的 檸 檬 桉 精 油 接 種 小 白 菜 炭 疽 病 菌 後 全 程 將 植 株 置 於 相 對 濕 度 為 95%-100% 的 透 明 塑 膠 箱 中, 以 黑 色 塑 膠 袋 套 住 避 光 24 小 時 後 拆 袋 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 3 株, 試 驗 重 複 2 次, 接 種 第 4 天 後 記 錄 第 3 4 位 葉 的 發 病 情 形 將 發 病 程 度 分 為 0-4 級,0 級 為 無 可 見 病 斑 ;1 級 為 病 斑 面 積 佔 葉 面 積 1-10%;2 級 為 病 斑 面 積 介 於 11%-25%;3 級 為 病 斑 病 斑 面 積 介 於 25%-50%;4 級 為 病 斑 面 積 大 於 50%, 罹 病 度 之 計 算 如 下 : 第 3 位 罹 病 級 數 + 第 4 位 葉 罹 病 級 數 罹 病 度 (%) = 100 採 計 葉 片 總 數 4 ( 二 ) 於 定 溫 生 長 箱 中 精 油 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 之 效 果 評 估 參 考 Ishii 氏 等 人 (2007) 所 報 導 接 種 胡 瓜 炭 疽 病 的 方 法, 將 生 長 於 28 o C, 每 日 照 光 12 小 時 的 定 溫 生 長 箱 中, 株 齡 14 天, 第 二 片 真 葉 完 全 展 開 的 胡 瓜 植 株, 接 種 濃 度 10 5 spores/ml 胡 瓜 炭 疽 病 菌 的 孢 子 懸 浮 液 3 m l, 精 油 施 用 方 式 分 別 為 接 種 病 原 菌 前 1 小 時 與 後 1 小 時 噴 灑 3 ml; 而 精 油 施 用 濃 度 為 稀 釋 50 與 100 倍 的 柚 子 精 油, 或 稀 釋 500 與 1,000 倍 的 檸 檬 桉 精 油 接 種 胡 瓜 炭 疽 病 菌 後 全 程 將 植 株 置 於 相 對 濕 度 為 95%-100% 的 透 明 塑 膠 箱 中, 以 黑 色 塑 膠 袋 套 住 避 光 24 小 時 後 拆 袋 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 3 株, 試 驗 重 複 2 次, 並 於 接 種 後 第 7 天 記 錄 其 罹 病 度 將 葉 片 的 發 病 程 度 分 成 0-10 級,0.1 級 為 病 斑 面 積 小 於 1% 0.5 級 為 1-5% 1 級 為 6-10% 2 級 為 10-20% 3 級 為 21-30% 4 級 為 31-40% 5 級 為 41-50% 6 級 為 51-60% 7 級 為 61-70% 8 級 為 71-80% 9 級 為 81-90% 10 級 則 為 91% 以 上 (Ishii et al., 2007), 計 算 公 式 如 下 : 罹 病 度 (%) = ( 罹 病 級 數 該 罹 病 級 數 之 葉 片 數 ) 採 計 葉 片 總 數 10 100 ( 三 ) 於 保 濕 環 境 中 精 油 防 治 草 莓 灰 黴 病 之 效 果 評 估 9

草 莓 灰 黴 病 之 接 種 是 將 生 長 於 溫 室, 氣 溫 約 20-25 o C, 每 日 照 光 12 小 時, 已 有 4-5 片 真 葉 的 草 莓 植 株, 接 種 濃 度 10 6 spores/ml 草 莓 灰 黴 病 菌 B. cinerea GBS1-104 的 孢 子 懸 浮 液 3 m l 精 油 施 用 方 式 分 別 為 接 種 病 原 菌 前 1 小 時 與 後 1 小 時 噴 灑 3 ml; 而 精 油 施 用 濃 度 為 稀 釋 50 與 100 倍 的 柚 子 精 油, 或 稀 釋 500 與 1,000 倍 的 檸 檬 桉 精 油 接 種 後 將 植 株 置 於 透 明 塑 膠 箱 中, 以 黑 色 塑 膠 袋 套 住 避 光 48 小 時 並 拆 袋, 實 驗 進 行 時 氣 溫 約 20-25 o C, 塑 膠 箱 中 相 對 濕 度 保 持 在 95%-100% 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 3 株, 試 驗 重 複 2 次 並 於 第 14 天 觀 察 植 株 發 病 情 形, 將 發 病 程 度 分 為 0-4 級,0 級 為 無 可 見 病 斑 ;1 級 為 病 斑 面 積 佔 葉 面 積 1-5%;2 級 為 病 斑 面 積 介 於 5%-25%;3 級 為 病 斑 病 斑 面 積 介 於 25%-50%;4 級 為 病 斑 面 積 大 於 50% (Konishi et al., 2010), 計 算 公 式 如 下 ; 罹 病 度 (%) = ( 罹 病 級 數 該 罹 病 級 數 之 葉 片 數 ) 採 計 葉 片 總 數 4 100 ( 四 ) 於 保 濕 環 境 下 精 油 防 治 草 莓 果 實 灰 黴 病 之 效 果 評 估 參 考 Zhang 氏 等 人 (2007) 接 種 草 莓 果 實 灰 黴 病 之 方 法, 選 用 重 量 4-10 g, 果 直 徑 2-3 cm, 果 長 2.5-3.5 cm 之 草 莓 果 實, 以 3 mm 打 孔 器 於 果 實 側 面 製 造 2 mm 深 的 傷 口, 滴 入 10 6 spores/ml 的 草 莓 灰 黴 病 菌 B. cinerea GBS1-104 孢 子 懸 浮 液 15 µl 精 油 施 用 方 式 分 別 為 接 種 病 原 菌 前 1 小 時 與 後 1 小 時 對 果 實 傷 口 處 噴 灑 1 ml, 而 精 油 施 用 濃 度 為 稀 釋 50 與 100 倍 的 柚 子 精 油, 或 稀 釋 500 與 1,000 倍 的 檸 檬 桉 精 油 接 種 後 將 果 實 置 於 相 對 濕 度 為 95%-100% 的 透 明 塑 膠 袋 中, 置 於 20 o C 無 光 照 的 定 溫 生 長 箱 中 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 3 顆, 試 驗 重 複 2 次, 於 3 天 後 記 錄 發 病 情 形, 將 發 病 程 度 分 為 0-4 級,0 級 為 無 可 見 病 斑 ;1 級 為 病 斑 直 徑 小 於 0.5 cm;2 級 為 病 斑 直 徑 介 於 0.5-0.75 cm;3 級 為 病 斑 直 徑 介 於 0.75-1 cm;4 級 為 病 斑 直 徑 大 於 1 cm, 計 算 公 式 如 下 ; 罹 病 度 (%) = ( 罹 病 級 數 該 罹 病 級 數 之 果 數 ) 總 採 計 果 數 4 10 100

九 統 計 分 析 本 研 究 所 得 之 實 驗 數 據 以 SPSS Statistics 統 計 軟 體 進 行 分 析, 並 以 Tukey s HSD 法 分 析 比 較 各 處 理 間 之 差 異 11

結 果 一 精 油 之 萃 取 以 蒸 餾 萃 取 法 萃 取 柚 子 皮 與 檸 檬 桉 葉 片 之 精 油, 結 果 得 知, 市 售 文 旦 柚 子 皮 100 g 可 萃 取 出 約 7.20 g 柚 子 精 油 ; 另 外 自 100 g 檸 檬 桉 葉 片 中, 可 萃 取 到 約 0.74 g 的 檸 檬 桉 精 油 二 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 中 之 有 效 成 分 分 析 透 過 GC-MS 分 析 精 油 成 分 的 結 果, 證 實 於 柚 子 精 油 之 氣 相 層 析 圖 譜 的 流 洗 時 間 9.23 min 處 有 一 明 顯 的 訊 號, 占 總 積 分 面 積 約 96.27%( 圖 三 ), 比 對 其 質 譜 圖 與 分 子 量, 判 斷 該 化 合 物 為 檸 檬 烯 (limonene) ( 圖 四 ) 於 檸 檬 桉 精 油 之 氣 相 層 析 圖 譜 之 流 洗 時 間 14.07 14.21 14.42 16.78 20.91 及 23.18 min 處 有 6 個 明 顯 的 訊 號, 稱 之 化 合 物 A B C D E F, 分 別 占 總 積 分 面 積 約 8.91% 43.69% 6.25% 17.06% 12.56% 及 4.50%( 圖 五 ), 其 中 B D E 及 F 透 過 比 對 其 質 譜 圖 與 分 子 量, 判 斷 這 些 化 合 物 分 別 為 香 茅 醛 (citronellal) ( 圖 六 ) 香 茅 醇 (citronellol) ( 圖 七 ) 乙 酸 香 葉 酯 (citronellyl acetate) ( 圖 八 ) 及 石 竹 烯 (caryophyllene) ( 圖 九 ), 而 化 合 物 A 與 C 則 無 法 透 過 比 對 其 質 譜 圖 與 分 子 量 來 判 定 為 何 種 化 合 物 三 測 試 柚 子 皮 與 檸 檬 桉 葉 片 精 油 對 病 原 菌 的 抑 制 效 果 ( 一 ) 測 試 薰 蒸 效 果 於 培 養 基 蓋 內 側 滴 上 柚 子 精 油, 以 薰 蒸 方 式 測 試 精 油 對 供 試 病 原 真 菌 之 生 長 抑 制 效 果, 結 果 得 知, 除 對 Cmep1-3 菌 株 不 具 抑 制 能 力 外, 對 其 餘 供 試 菌 株 之 生 長 抑 制 效 果 與 處 理 濃 度 成 正 相 關 性 ( 表 二 ) 處 理 未 稀 釋 之 柚 子 精 油 100 µl 對 GBS3-93 與 GBS1-104 菌 株 菌 絲 生 長 抑 制 率, 分 別 為 92.7% 與 100.0%; 對 PA01 菌 株 菌 絲 生 長 抑 制 率 為 75.9%; 而 對 其 他 病 原 真 菌 生 長 抑 制 率 則 介 於 0%- 12

47.0% 稀 釋 10 倍 之 柚 子 精 油, 對 GBS3-93 GBS1-104 及 PA01 菌 株 菌 絲 生 長 抑 制 率 皆 明 顯 降 低, 分 別 為 53.0% 43.0% 及 30.9%; 而 對 其 他 病 原 真 菌 之 抑 制 率 則 介 於 0.0%-10.0% 稀 釋 20 倍 之 柚 子 精 油 對 所 有 供 試 病 原 菌 之 抑 制 率 介 於 0.0%-21.0%; 而 當 柚 子 精 油 稀 釋 50 倍 後, 對 所 有 供 試 病 原 真 菌 之 生 長 抑 制 皆 無 顯 著 效 果 本 研 究 得 知, 柚 子 精 油 對 Cmep1-3 菌 株 生 長 無 抑 制 效 果, 反 而 可 促 進 菌 株 生 長 於 檸 檬 桉 精 油 薰 蒸 測 試 結 果 得 知, 稀 釋 10 倍 之 檸 檬 桉 精 油, 對 所 有 供 試 植 物 病 原 真 菌 生 長 抑 制 效 果 佳 ( 表 三 ), 其 中 對 GBS3-93 GBS1-104 PA01 CO- 51 PC Cmep1-3 及 CPY-01A 菌 株 之 生 長 抑 制 率 達 100.0%, 而 對 CSG7-3 與 PG6-3 菌 株 生 長 抑 制 率 稍 低, 分 別 為 96.6% 與 96.8% 稀 釋 50 倍 之 檸 檬 桉 精 油 對 GBS1-104 菌 株 生 長 抑 制 率 仍 有 100.0%, 然 對 Cmep1-3 CPY-01A CO-51 PC PA01 及 GBS3-93 菌 株 生 長 抑 制 率 則 介 於 51.0%-93.3%; 另 對 CSG7-3 PG6-3 菌 株 生 長 抑 制 率 分 別 為 29.6% 與 45.0% 稀 釋 100 倍 之 檸 檬 桉 精 油, 對 GBS1-104 與 GBS3-93 菌 株 生 長 抑 制 率 仍 有 76.8% 與 89.0%, 然 對 其 他 病 原 菌 之 生 長 抑 制 率 則 介 於 0.0%-39.8%( 表 三 ) ( 二 ) 測 試 精 油 培 養 基 對 菌 絲 生 長 抑 制 效 果 測 試 柚 子 精 油 培 養 基 對 各 供 試 病 原 真 菌 之 生 長 抑 制 效 果, 結 果 如 表 四 所 示 含 稀 釋 100 倍 柚 子 精 油 培 養 基, 對 PA01 GBS1-104 GBS3-93 PC PG6-3 及 CSG7-3 等 菌 株 生 長 抑 制 效 果 較 佳, 分 別 為,89.8% 81.1% 73.4% 77.9% 69.1% 及 55.8%, 而 對 CPY-01A 與 CO-51 僅 有 35.5% 與 17.2% 的 抑 制 效 果 ; 當 柚 子 精 油 稀 釋 1,000 倍 及 10,000 倍 後, 對 所 有 供 試 病 原 真 菌 生 長 抑 制 率 介 於 0.0%-38.7%, 抑 制 效 果 不 顯 著 另 柚 子 精 油 培 養 基 對 來 自 香 水 檸 檬 之 綠 黴 菌 Cmep1-3 菌 株 之 生 長 抑 制 無 效 果, 且 可 促 進 其 生 長, 各 稀 釋 濃 度 之 促 進 率 介 於 17.5%-48.6% 13

於 檸 檬 桉 精 油 測 試 結 果 如 表 五 所 示 稀 釋 1,000 倍 檸 檬 桉 精 油 對 各 供 試 病 原 真 菌 之 生 長 抑 制 率 介 於 72.2%-100.0%, 對 GBS1-104 GBS3-93 CSG7-3 PA01 CO-51 PC 及 CPY-01A 菌 株 之 生 長 抑 制 率 可 達 100.0%; 然 稀 釋 10,000 倍 後 之 精 油 對 供 試 菌 株 生 長 抑 制 效 果 明 顯 降 低, 除 對 CSG7-3 與 PC 仍 有 82.5% 及 56.3% 外, 其 餘 菌 株 生 長 抑 制 率 介 於 0.0%-33.6%; 另 稀 釋 100,000 倍 後 之 精 油 則 對 所 有 供 試 病 原 真 菌 生 長 抑 制 率 介 於 0.0%-43.0%, 效 果 不 顯 著 ( 三 ) 測 試 精 油 對 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果 將 含 蔗 糖 之 孢 子 懸 浮 液 與 精 油 混 合 後 培 養 於 玻 片 上, 測 試 精 油 對 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果, 結 果 如 表 六 所 示 稀 釋 10 倍 之 柚 子 精 油 可 抑 制 PA01 GBS1-104 CSG7-3 CPY-01A 及 PG6-3 菌 株 孢 子 發 芽, 抑 制 率 介 於 98.2%-100.0% 稀 釋 20 倍 之 柚 子 精 油 可 抑 制 PA01 GBS1-104 CSG7-3 CPY-01A 及 PG6-3 菌 株 孢 子 發 芽, 抑 制 率 介 於 98.3%-100.0% 稀 釋 50 倍 之 柚 子 精 油 可 抑 制 PA01 GBS1-104 CSG7-3 CPY-01A 及 PG6-3 菌 株 孢 子 發 芽, 抑 制 率 介 於 92.6%-99.7% 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油 可 抑 制 PA01 GBS1-104 CSG7-3 及 PG6-3 菌 株 孢 子 發 芽, 抑 制 率 介 於 70.9%-98.6% 另 本 研 究 得 知, 柚 子 精 油 對 Cmep1-3 菌 株 孢 子 發 芽 無 抑 制 效 果, 反 而 有 促 進 發 芽 的 效 果 於 檸 檬 桉 精 油 測 試 結 果 如 表 七 所 示 稀 釋 500 倍 之 檸 檬 桉 精 油 可 抑 制 GBS1-104 CPY-01A PG6-3 及 CSG7-3 菌 株 孢 子 發 芽 達 98.2% 98.3% 99.0% 及 100.0%; 對 Cmep1-3 與 PA01 菌 株 孢 子 發 芽 抑 制 率 為 80.1% 與 82.7% 稀 釋 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 可 抑 制 GBS1-104 與 CSG7-3 菌 株 孢 子 發 芽 達 99.6% 與 100.0%; 對 CPY-01A Cmep1-3 PA01 及 PG6-3 菌 株 孢 子 發 芽 抑 制 率 則 為 83.5% 83.3% 68.2% 及 59.8% 稀 釋 1,500 倍 之 檸 檬 桉 精 油 可 抑 制 GBS1-104 與 CSG7-3 菌 株 孢 子 發 芽, 抑 制 率 達 98.6% 與 88.4%; 對 CPY-01A Cmep1-3 PA01 及 PG6-3 菌 株 孢 子 發 芽 抑 制 率 為 84.9% 74.5% 72.1% 及 59.0 稀 釋 2,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 可 抑 制 GBS1-104 CPY-01A 及 CSG7-3 菌 株 孢 子 發 芽 達 14

97.3% 78.5% 及 78.5%; 對 Cmep1-3 PA01 及 PG6-3 菌 株 孢 子 發 芽 抑 制 率 分 別 為 68.7% 51.8% 及 45.3% 四 測 試 農 藥 添 加 精 油 對 具 抗 藥 性 草 莓 灰 徽 病 菌 生 長 抑 制 效 果 於 1,000 mg a. i. /L 亞 托 敏 中 添 加 柚 子 精 油, 測 試 對 灰 黴 病 菌 抗 藥 性 菌 株 (GBS1-104) 生 長 效 果, 結 果 如 表 八 所 示 添 加 稀 釋 100 倍 1,000 倍 及 10,000 倍 之 柚 子 精 油 對 抗 藥 性 GBS1-104 菌 株 生 長 抑 制 率 分 別 為 71.0% 40.7% 及 39.0%; 而 對 非 抗 藥 性 菌 株 (GBS3-93) 生 長 之 抑 制 率 分 別 為 100.0% 66.0% 及 65.2% 於 檸 檬 桉 精 油 測 試 結 果 指 出, 添 加 稀 釋 1,000 倍 10,000 倍 及 100,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 對 抗 藥 性 GBS1-104 菌 株 生 長 抑 制 率, 分 別 為 100.0% 52.0% 及 44.6%; 對 GBS3-93 菌 株 生 長 之 抑 制 率 分 別 為 100.0% 75.7% 及 62.2%( 表 八 ) 將 上 述 結 果 與 只 含 亞 托 敏 之 處 理 組 比 較, 得 知 亞 托 敏 添 加 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油 後, 可 提 升 亞 托 敏 對 GBS1-104 與 GBS3-93 之 抑 制 率 達 29.9% 與 37.7% 稀 釋 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 可 提 升 亞 托 敏 對 GBS1-104 與 GBS3-93 之 抑 制 率 達 58.9% 與 37.7%; 而 稀 釋 10,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油, 則 可 提 升 亞 托 敏 對 GBS1-104 與 GBS3-93 之 抑 制 率 達 11.0% 與 13.4% 本 研 究 後 續 以 稀 釋 100 倍 柚 子 精 油 和 稀 釋 1,000 倍 與 10,000 倍 檸 檬 桉 精 油 進 行 藥 效 提 升 試 驗 五 測 試 農 藥 添 加 精 油 對 藥 效 提 升 效 果 將 濃 度 0 50 100 500 及 1,000 mg a. i. /L 之 亞 托 敏 與 稀 釋 100 倍 柚 子 精 油 或 稀 釋 1,000 倍 與 10,000 倍 檸 檬 桉 精 油 混 合 後, 添 加 至 PDA 培 養 基, 測 試 對 抗 藥 性 菌 株 GBS1-104 生 長 之 抑 制 效 果, 結 果 如 圖 十 所 示 添 加 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油 後, 亞 托 敏 藥 劑 對 GBS1-104 菌 株 之 生 長 抑 制 率 分 別 提 升 為 25.6% 21.6% 15.0% 33.2% 及 51.2%; 而 添 加 稀 釋 10,000 倍 檸 檬 桉 精 油 後, 亞 托 敏 藥 劑 對 GBS1-104 菌 株 之 生 長 抑 制 率 分 別 提 升 為 26.3% 25.8% 43.7% 42.6% 15

及 51.7% 另 添 加 稀 釋 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油, 於 所 有 測 試 濃 度 之 亞 托 敏 培 養 基 中, 皆 可 100% 抑 制 GBS1-104 菌 株 生 長 顯 示 稀 釋 100 倍 柚 子 精 油 和 稀 釋 1,000 倍 與 10,000 倍 檸 檬 桉 精 油 皆 有 提 升 藥 效 之 效 果 六 測 試 精 油 對 植 物 的 影 響 將 乳 化 後 之 精 油 噴 於 胡 瓜 小 白 菜 及 草 莓 植 株, 測 試 精 油 對 植 物 影 響, 結 果 分 別 如 圖 十 一 圖 十 二 及 圖 十 三 所 示 稀 釋 20 倍 之 柚 子 精 油 對 胡 瓜 與 草 莓 葉 片 有 明 顯 白 色 病 斑 之 藥 害 ; 而 稀 釋 50 倍 與 100 倍 之 精 油, 則 對 供 試 植 株 無 明 顯 藥 害 稀 釋 100 倍 之 檸 檬 桉 精 油, 對 所 有 供 試 植 物 葉 片 皆 可 引 起 白 化 病 斑 之 藥 害 ; 而 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 精 油, 則 對 各 供 試 植 株 無 明 顯 藥 害 故 後 續 植 物 病 害 防 治 實 驗 中, 以 稀 釋 50 倍 與 100 倍 之 柚 子 精 油 和 稀 釋 倍 數 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 作 為 防 治 濃 度 七 評 估 精 油 防 治 植 物 病 害 之 效 果 ( 一 ) 定 溫 生 長 箱 中 測 試 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 之 效 果 測 試 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 噴 灑 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 之 結 果, 得 知 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 小 白 菜 罹 病 度 分 別 為 33.3% 與 37.5%; 另 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 之 小 白 菜 罹 病 度 皆 為 37.5% ( 表 九 ) 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 處 理 0.01% tween 20 之 小 白 菜 罹 病 度 為 75.0% 於 接 種 病 原 菌 1 小 時 後 噴 灑 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 之 結 果, 得 知 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 小 白 菜 罹 病 度 分 別 為 50.0% 與 58.3%; 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 後, 小 白 菜 罹 病 度 分 別 為 25.0% 與 33.3% ( 表 九 ) 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 後 處 理 0.01% tween 20 之 小 白 菜 罹 病 度 為 70.8% ( 二 ) 定 溫 生 長 箱 中 精 油 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 之 效 果 16

測 試 於 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 噴 灑 精 油 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 的 結 果, 指 出 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 胡 瓜 植 株 罹 病 度 分 別 為 4.2% 與 3.7%; 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 後, 胡 瓜 植 株 罹 病 度 皆 為 9.3% ( 表 十 ) 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 處 理 0.01% tween 20 之 胡 瓜 植 株 罹 病 度 為 17.5% 於 接 種 病 原 菌 1 小 時 後 噴 灑 精 油 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 的 結 果, 指 出 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 胡 瓜 植 株 罹 病 度 分 別 為 5.0% 與 3.2%; 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 後, 胡 瓜 植 株 罹 病 度 分 別 為 6.3% 與 12.7% ( 表 十 ) 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 後 處 理 0.01% tween 20 之 胡 瓜 植 株 罹 病 度 為 10.0% ( 三 ) 保 濕 環 境 中 精 油 防 治 草 莓 葉 部 灰 黴 病 之 效 果 測 試 於 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 噴 灑 精 油 防 治 草 莓 葉 部 灰 黴 病 之 結 果, 得 知 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 草 莓 植 株 罹 病 度 分 別 為 72.2% 與 77.8%; 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 後, 草 莓 植 株 罹 病 度 分 別 為 66.7% 與 69.4% ( 表 十 一 ) 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 處 理 0.01% tween 20 之 草 莓 植 株 罹 病 度 為 72.2% 於 接 種 病 原 菌 前 或 後 1 小 時 噴 灑 精 油 防 治 草 莓 葉 部 灰 黴 病 之 結 果, 得 知 於 接 種 後 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 草 莓 植 株 罹 病 度 分 別 為 30.6% 與 50.0%; 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 檸 檬 桉 精 油 後, 草 莓 植 株 罹 病 度 分 別 為 25.0% 與 16.7% 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 後 處 理 0.01% tween 20 之 草 莓 植 株 罹 病 度 為 77.8% ( 表 十 一 ) ( 四 ) 於 保 濕 環 境 下 精 油 防 治 草 莓 果 實 灰 黴 病 之 效 果 測 試 於 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 噴 灑 精 油 防 治 草 莓 果 實 灰 黴 病 之 結 果, 得 知 於 接 種 1 小 時 前 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 草 莓 果 實 罹 病 度 分 別 為 79.2% 與 54.2%; 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 後, 草 莓 果 實 罹 病 度 17

分 別 為 83.3% 與 41.7% ( 表 十 二 ) 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 處 理 0.01% tween 20 之 草 莓 果 實 罹 病 度 罹 病 度 為 62.5% 於 接 種 病 原 菌 1 小 時 後 噴 灑 精 油 防 治 草 莓 果 實 灰 黴 病 之 結 果, 得 知 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 草 莓 果 實 罹 病 度 分 別 為 41.7% 與 33.3%; 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 後, 草 莓 果 實 罹 病 度 分 別 為 25.0% 與 29.2% ( 表 十 二 ) 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 後 處 理 0.01% tween 20 之 草 莓 果 實 罹 病 度 為 87.5% 18

討 論 本 研 究 利 用 蒸 餾 萃 取 法, 萃 取 新 鮮 文 旦 柚 皮 和 檸 檬 桉 落 葉 中 的 精 油, 得 知 文 旦 柚 皮 和 檸 檬 桉 落 葉 中 精 油 含 量 分 別 為 7.20% 與 0.74% Tsai 氏 (2005) 曾 報 導, 新 鮮 的 文 旦 柚 果 皮 以 蒸 餾 法 萃 取, 可 萃 得 1.62% 的 精 油, 較 本 研 究 之 回 收 率 低 比 較 本 研 究 所 使 用 的 方 法 與 Tsai 氏 (2005) 之 方 式, 得 知 Tsai 氏 未 將 材 料 打 碎, 且 使 用 常 溫 水 作 為 冷 卻 水 前 人 研 究 指 出, 精 油 屬 高 揮 發 性 的 化 合 物 (Lin et al., 2007), 且 儲 存 在 果 皮 中 的 油 囊 細 胞 內 (Ladaniya, 2008), 本 研 究 中 使 用 之 柚 子 皮 於 蒸 餾 前 先 以 均 質 機 打 碎, 可 破 壞 植 物 組 織, 使 精 油 釋 出 量 增 加 ; 且 研 究 中 之 萃 取 裝 置 使 用 0 o C-4 o C 冷 卻 水, 可 增 加 精 油 凝 結 效 率, 降 低 蒸 餾 時 的 逸 散, 導 致 精 油 之 萃 取 效 率 較 Tsai 氏 佳 檸 檬 桉 精 油 萃 取 方 面, 根 據 Batish 氏 等 人 (2006) 的 報 導,100 g 檸 檬 桉 枯 葉 所 含 精 油 量 約 2.36 ml, 較 本 研 究 中 所 萃 得 的 量 ( 約 0.82 ml) 高 ;Batish 氏 等 人 (2006) 所 使 用 之 落 葉 為 褐 色 且 尚 未 開 始 被 分 解 的 葉 片, 而 萃 取 方 法 亦 與 本 研 究 相 似 前 人 研 究 曾 指 出, 植 物 精 油 含 量 會 因 環 境 逆 境 而 增 加, 如 藿 香 薊 (Kong et al., 2002); 另 根 據 Jing 氏 等 人 (2014) 綜 述, 檸 檬 葉 與 果 皮 中 的 精 油 量 與 成 分, 會 隨 栽 培 區 域 與 氣 候 不 同 而 改 變, 指 出 環 境 會 影 響 植 物 精 油 含 量 比 較 Batish 氏 等 人 (2006) 所 萃 取 檸 檬 桉 精 油 量 與 本 研 究 萃 取 之 檸 檬 桉 精 油 量 之 差 異, 得 知 Batish 氏 等 人 (2006) 之 檸 檬 桉 葉 片 取 自 印 度 的 昌 迪 加 爾 (Chandigarh), 當 地 年 雨 量 約 為 979 mm/yr, 且 降 雨 之 76% 集 中 於 6-9 月, 其 餘 月 分 降 雨 皆 低 於 50 mm (http://sdwebx.worldbank.org/climateportal/), 而 台 灣 台 中 地 區 年 雨 量 約 為 1642 mm/yr, 於 2-9 月 降 雨 皆 高 於 80 mm (http://content.edu.tw/senior/earth/yl_ld/content/rain/4/41.htm), 顯 示 兩 地 區 之 氣 候 環 境 有 明 顯 差 異, 推 測 兩 地 區 檸 檬 桉 葉 片 中 的 精 油 含 量 與 成 分 可 能 因 此 產 生 差 異 性 此 外,Batish 氏 等 人 (2006) 之 研 究 亦 指 出,100 g 檸 檬 桉 成 熟 葉 所 含 精 油 量 約 4.80 ml, 為 落 葉 中 精 油 含 量 的 2 倍 以 上, 且 香 茅 醛 (citronellal) 含 量 為 落 葉 19

中 精 油 之 1.5 倍, 故 未 來 可 以 新 鮮 檸 檬 桉 葉 片 作 為 萃 取 材 料, 以 提 升 萃 取 效 率, 並 降 低 成 本 本 研 究 分 析 文 旦 柚 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 成 分, 得 知 文 旦 柚 精 油 含 96.27% 檸 檬 烯, 與 Tsai 氏 (2005) 報 導 文 旦 柚 精 油 含 95.85% 檸 檬 烯 相 似 根 據 Jing 氏 等 人 (2014) 綜 述, 柚 子 精 油 之 檸 檬 烯 含 量 會 隨 栽 培 環 境 不 同 而 改 變, 約 介 於 31%- 97%, 顯 示 植 物 中 精 油 的 成 分 比 例, 可 能 隨 著 作 物 栽 培 環 境 或 作 物 品 種 等 而 有 大 幅 度 的 差 異 另 檸 檬 桉 落 葉 中 精 油 主 要 成 分 為 香 茅 醛 與 香 茅 醇, 含 量 分 別 為 43.69% 與 17.06% Batish 氏 等 人 (2006) 曾 報 導, 檸 檬 桉 落 葉 中 精 油 含 香 茅 醛 與 香 茅 醇 含 量 分 別 為 53.87% 與 7.81%, 此 差 異 亦 可 能 是 因 栽 培 環 境 不 同 所 造 成 (Sharma and Tripathi, 2006; Jing et al., 2014) 本 研 究 將 柚 子 精 油 以 薰 蒸 方 式 處 理, 得 知 對 供 試 菌 株 的 生 長 抑 制 效 果 隨 使 用 濃 度 增 加 而 提 昇, 但 對 Penicillium digitatum Cmep1-3 菌 株 則 會 促 進 生 長, 證 實 在 高 濃 度 下, 精 油 對 抑 制 病 原 真 菌 生 長 有 較 佳 效 果, 且 效 果 會 因 菌 株 不 同 而 有 差 異 根 據 Kuate 氏 等 人 (2006) 的 報 導, 當 精 油 未 達 抑 制 濃 度 時, 可 能 會 有 促 進 部 分 病 原 菌 生 長 或 孢 子 發 芽 的 現 象, 此 現 象 於 本 研 究 中 以 稀 釋 50 倍 以 上 之 柚 子 精 油 薰 蒸 處 理 的 結 果 中 亦 可 觀 察 到 另 柚 子 精 油 對 卵 菌 綱 的 Phytophthora capsici PC 菌 株 無 抑 制 效 果, 顯 示 柚 子 精 油 對 卵 菌 類 病 原 的 抑 制 效 果 不 佳, 然 實 驗 中 只 針 對 單 一 菌 株, 未 來 需 測 試 更 多 卵 菌 類 病 原 以 確 定 其 有 效 性 柚 子 精 油 添 加 於 培 養 基 對 供 試 菌 株 的 生 長 抑 制 效 果 與 薰 蒸 效 果 類 似, 當 濃 度 增 加 時, 可 促 進 菌 株 生 長 抑 制 效 果, 但 效 果 會 因 菌 株 不 同 而 有 差 異 ; 而 當 培 養 基 添 加 稀 釋 1,000 倍 以 上 的 柚 子 精 油 後, 會 有 促 進 部 分 病 原 菌 生 長 的 效 果 比 較 精 油 以 薰 蒸 或 加 入 培 養 基 之 處 理 結 果, 本 研 究 使 用 之 塑 膠 培 養 皿 容 量 約 為 100 ml( 直 徑 8.925 cm 高 1.6cm), 各 皿 培 養 基 量 約 為 12.5 ml-15 ml, 若 精 油 於 培 養 皿 中 完 全 揮 發, 則 精 油 薰 蒸 試 驗 中 稀 釋 1 倍 至 100 倍 的 柚 子 精 油 於 培 養 皿 中 的 濃 度 約 為 1,176 mg /L 至 12 mg /L; 而 含 稀 釋 100 1,000 及 10,000 倍 柚 子 精 油 培 養 基 20

中 所 含 柚 子 精 油 濃 度 則 分 別 為 10,000 mg /L 1,000 mg /L 及 100 mg /L 將 薰 蒸 稀 釋 1 倍 之 柚 子 精 油 與 含 稀 釋 1,000 倍 柚 子 精 油 培 養 基 對 病 原 真 菌 生 長 抑 制 結 果 進 行 比 較, 顯 示 當 濃 度 接 近 1,000 mg /L 時, 柚 子 精 油 以 薰 蒸 的 方 式, 較 能 有 效 抑 制 病 原 真 菌 生 長 前 人 研 究 曾 比 較 薰 蒸 與 培 養 基 添 加 柳 橙 精 油, 對 Aspergillus 屬 植 物 病 原 菌 之 生 長 抑 制 效 果, 亦 顯 示 當 柳 橙 精 油 以 薰 蒸 的 方 式 較 能 有 效 抑 制 病 原 真 菌 生 長 (Sharma and Tripathi, 2006; Jing et al., 2014), 指 出 使 用 方 法 的 不 同, 會 影 響 精 油 的 效 果 另 Fisher 與 Phillips 兩 氏 (2008) 亦 指 出, 培 養 基 之 結 構 會 影 響 培 養 基 中 揮 發 性 物 質 的 釋 放, 導 致 精 油 對 病 原 真 菌 的 抑 制 效 果 降 低 在 孢 子 發 芽 的 抑 制 效 果 上, 得 知 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油 ( 約 10,000 mg /L), 能 夠 抑 制 CSG7-3 與 PG6-3 孢 子 發 芽 達 約 100%, 然 對 菌 絲 生 長 抑 制 率 低 於 80%, 顯 示 柚 子 精 油 對 孢 子 之 毒 性 可 能 較 高 Sharma 與 Tripathi 兩 氏 (2006) 指 出,100% 抑 制 病 原 真 菌 孢 子 發 芽 所 需 之 柳 橙 精 油 濃 度 較 100% 抑 制 病 原 菌 生 長 之 濃 度 低, 應 顯 示 柳 橙 精 油 對 真 菌 孢 子 之 毒 性 亦 較 高 ; 比 較 兩 精 油 之 差 異 後 得 知, 柳 橙 精 油 之 主 成 分 為 檸 檬 烯 ( 約 84.2%), 證 實 檸 檬 烯 對 真 菌 孢 子 之 毒 性 可 能 較 強, 未 來 可 進 一 步 了 解 檸 檬 烯 影 響 孢 子 發 芽 之 作 用 機 制 於 檸 檬 桉 精 油 測 試 結 果 指 出, 檸 檬 桉 精 油 抑 制 供 試 菌 株 生 長 效 果 的 情 形 與 柚 子 精 油 相 似, 抑 制 效 果 隨 使 用 濃 度 增 加 而 提 昇, 於 高 濃 度 時 對 真 菌 之 生 長 抑 制 效 果 較 佳, 且 效 果 會 因 菌 株 不 同 而 有 差 異 ; 此 外, 當 精 油 未 達 抑 制 濃 度 時, 可 能 會 有 促 進 部 分 病 原 菌 生 長 或 孢 子 發 芽 的 現 象 比 較 檸 檬 桉 精 油 與 柚 子 精 油 之 抑 制 效 果, 顯 示 檸 檬 桉 精 油 抑 制 供 試 病 原 真 菌 菌 株 之 生 長 效 果 較 柚 子 精 油 佳, 推 測 其 原 因 應 與 所 含 成 分 有 關 檸 檬 桉 精 油 之 主 要 有 效 成 分 則 為 香 茅 醛 與 香 茅 醇, 而 柚 子 精 油 之 主 要 成 分 為 檸 檬 烯 比 較 三 種 物 質 之 毒 性 資 料, 指 出 香 茅 醛 與 香 茅 醇 對 大 鼠 之 LD50 分 別 為 2420 mg/kg (http://www.sciencelab.com/) 與 3,450 mg/kg (https://www.sigmaaldrich.com/), 而 檸 檬 烯 對 大 鼠 之 半 數 致 死 濃 度 (LD50) 為 4,400 mg/kg (https://www.sigmaaldrich.com/), 顯 示 檸 檬 桉 精 油 中 的 香 茅 21

醛 與 香 茅 醇 之 毒 性 皆 較 文 旦 柚 精 油 中 的 檸 檬 烯 高 比 較 檸 檬 桉 精 油 以 薰 蒸 或 加 入 培 養 基 之 處 理 結 果, 將 薰 蒸 試 驗 中 稀 釋 10 倍 ( 濃 度 約 118 mg/l) 之 檸 檬 桉 精 油, 與 含 稀 釋 10,000 倍 檸 檬 桉 精 油 培 養 基 ( 濃 度 約 100 mg /L) 對 供 試 菌 株 的 生 長 抑 制 效 果 進 行 比 較, 可 知 於 同 樣 濃 度 下, 檸 檬 桉 精 油 與 柚 子 精 油 相 同, 以 薰 蒸 的 方 式 較 能 抑 制 病 原 菌 之 生 長 比 較 檸 檬 桉 精 油 抑 制 菌 絲 生 長 與 孢 子 發 芽 的 結 果, 顯 示 1,000 mg/l 檸 檬 桉 精 油 對 9 種 供 試 病 原 菌 中 7 種 菌 株 之 菌 絲 生 長 抑 制 率 可 達 100%, 然 對 孢 子 發 芽 抑 制 率 則 不 佳, 僅 對 其 中 2 種 孢 子 發 芽 抑 制 率 有 較 明 顯 效 果 約 100%, 顯 示 檸 檬 桉 精 油 對 真 菌 菌 絲 之 毒 性 較 強, 此 結 果 與 柚 子 精 油 處 理 不 同 ; 由 於 兩 種 精 油 的 成 分 相 異, 推 測 此 現 象 可 能 是 因 作 用 機 制 不 同 造 成, 未 來 可 比 較 處 理 兩 種 精 油 後 之 孢 子 與 菌 絲 之 細 胞 結 構 破 壞 性 本 研 究 得 知, 柚 子 精 油 對 自 香 水 檸 檬 分 得 的 P. digitatum Cmep1-3 菌 株 有 促 進 菌 絲 生 長 與 孢 子 發 芽 之 效 果 前 人 研 究 曾 分 析 各 種 柑 橘 屬 精 油 之 主 要 成 分, 並 測 試 對 P. digitatum 與 P. italicum 病 原 真 菌 的 生 長 抑 制 效 果, 得 知 各 種 柑 橘 精 油 中 非 檸 檬 烯 的 單 萜 類 (monoterpene) 與 倍 半 萜 類 (sesquiterpene) 含 量 與 抑 制 P. digitatum 和 P. italicum 生 長 能 力 成 正 相 關 (Caccioni et al., 1998) 本 研 究 萃 取 之 柚 子 精 油 含 約 96.27% 的 檸 檬 烯, 非 檸 檬 烯 的 單 萜 類 與 倍 半 萜 類 含 量 低, 故 可 能 導 致 無 法 有 效 抑 制 P. digitatum 另 Tan 氏 等 人 (1998) 亦 報 導 P. digitatum NRRL1202 菌 株 具 有 將 檸 檬 烯 轉 化 為 α-terpineol 的 能 力, 顯 示 某 些 P. digitatum 菌 株 對 檸 檬 烯 之 感 受 性 低, 且 能 夠 將 其 代 謝, 本 實 驗 所 使 用 的 P. digitatum Cmep1-3 是 否 屬 於 此 類 菌 株, 未 來 需 進 一 步 測 定 對 檸 檬 烯 的 代 謝 能 力 本 研 究 將 亞 托 敏 與 精 油 混 合, 可 提 升 抑 制 抗 藥 性 菌 株 生 長 的 效 果 根 據 殺 菌 劑 抗 藥 性 行 動 委 員 會 (FRAC, http://www.frac.info/) 之 敘 述, 亞 托 敏 屬 於 史 托 比 系 藥 劑, 其 作 用 機 制 為 抑 制 粒 線 體 膜 上 的 細 胞 色 素 複 合 體 bc1 之 Qo 處, 影 響 電 子 傳 遞 鏈, 導 致 呼 吸 作 用 無 法 正 常 進 行 Carson 氏 等 人 (2002) 指 出, 精 油 屬 多 成 分 的 複 合 化 合 物, 目 前 被 認 為 不 具 特 定 的 作 用 機 制 與 作 用 標 的 ;Bakkali 氏 22

等 人 (2008) 的 綜 述 亦 指 出, 精 油 具 脂 溶 性, 能 夠 穿 過 細 胞 壁, 影 響 細 胞 膜 之 通 透 性, 並 會 破 壞 真 核 生 物 細 胞 內 之 粒 線 體 膜, 導 致 細 胞 凋 亡 的 發 生 探 討 本 研 究 亞 托 敏 與 精 油 混 合 後 之 加 成 效 果, 應 是 由 於 兩 者 作 用 機 制 不 同 所 致 然 本 研 究 亦 發 現, 當 精 油 與 低 濃 度 亞 托 敏 混 合 時, 會 有 抑 制 效 果 降 低 的 情 形 推 測 可 能 原 因 為, 精 油 與 低 濃 度 亞 托 敏 混 合 時 無 法 有 效 乳 化 而 浮 至 培 養 基 表 面, 增 加 了 精 油 散 失 量 所 致 由 於 史 托 比 系 藥 劑 作 用 標 的 專 一, 且 使 用 量 大, 此 類 藥 劑 的 抗 藥 性 已 成 為 世 界 上 嚴 重 的 問 題, 未 來 若 能 將 柚 子 精 油 或 檸 檬 桉 精 油 適 量 添 加 於 該 藥 劑 中, 應 可 延 緩 田 間 抗 藥 性 菌 株 的 產 生, 提 升 藥 效 測 試 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 對 胡 瓜 小 白 菜 及 草 莓 的 影 響, 顯 示 柚 子 精 油 要 稀 釋 至 20 倍 以 下, 才 會 造 成 胡 瓜 與 草 莓 的 藥 害 ; 而 稀 釋 100 倍 以 下 之 檸 檬 桉 精 油 會 引 起 胡 瓜 小 白 菜 及 草 莓 之 生 理 障 礙 根 據 Batish 氏 等 人 (2008) 之 報 告,125 mg/l 之 檸 檬 桉 精 油 對 植 物 有 明 顯 的 生 長 抑 制 效 果, 且 效 果 取 決 於 香 茅 醛 之 含 量, 顯 示 香 茅 醛 為 主 要 影 響 植 株 生 長 的 因 子 ; 而 柚 子 精 油 的 主 成 份 檸 檬 烯 對 於 植 物 的 毒 性 則 可 能 較 低 利 用 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 小 白 菜 炭 疽 病 及 草 莓 灰 黴 病, 結 果 顯 示 除 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 效 果 不 明 顯 外, 對 小 白 菜 炭 疽 病 與 草 莓 灰 黴 病 皆 有 防 治 效 果 本 研 究 中 所 使 用 之 胡 瓜 炭 疽 病 苗 於 接 種 後, 無 明 顯 發 病 情 形, 推 測 原 因 可 能 是 菌 株 保 存 過 久 造 成 毒 力 下 降 所 致 另 一 方 面, 從 小 白 菜 炭 疽 病 與 草 莓 灰 黴 病 的 結 果 得 知, 精 油 於 接 種 病 原 菌 後 1 小 時 施 用, 對 病 害 發 生 的 防 治 效 果 較 佳, 推 測 此 差 異 可 能 是 由 於 精 油 本 身 屬 高 揮 發 性 物 質 (Lin et al., 2007), 於 植 物 表 面 無 法 長 時 間 穩 定 存 在 所 致 防 治 草 莓 植 株 灰 黴 病 與 果 實 灰 黴 病 之 結 果 中 顯 示, 施 用 稀 釋 50 倍 之 柚 子 精 油 與 稀 釋 500 倍 之 檸 檬 桉 精 油 時, 可 能 會 有 促 進 病 害 發 展 的 現 象, 且 於 接 種 前 1 小 時 施 用 的 處 理 中 特 別 顯 著 Hsieh 氏 等 人 (2014) 曾 指 出, 丁 香 精 油 可 能 會 對 植 物 表 面 造 成 傷 害, 加 重 香 蕉 炭 疽 病 之 發 病 嚴 重 度, 推 論 本 研 究 所 使 用 兩 種 精 油 對 草 莓 果 實 與 幼 葉 等 脆 弱 的 組 織 仍 23

可 能 造 成 傷 害, 若 於 病 原 菌 接 種 前 施 用 過 高 濃 度 的 精 油, 可 能 會 造 成 植 物 表 面 蠟 質 的 減 損 或 細 微 的 傷 口, 增 加 病 原 菌 侵 染 的 機 率, 然 未 來 仍 需 進 一 步 透 過 顯 微 觀 察, 確 定 果 表 或 葉 表 是 否 有 傷 害 現 象 本 研 究 亦 發 現 tween 20 會 影 響 供 試 病 原 菌 的 生 長 與 病 害 的 嚴 重 度 Tween 20 為 界 面 活 性 劑 (surfactant), 其 分 子 同 時 具 有 親 水 性 及 親 油 性, 可 用 於 油 與 水 的 乳 化 反 應 (Woertz, 2004), 前 人 報 導 中 曾 指 出, 低 濃 度 (0.05 mg /L) 的 界 面 活 性 劑 即 可 能 會 干 擾 膜 的 穩 定 性 進 而 影 響 微 生 物 的 生 長 (Laha, 1991) 植 物 方 面, 也 有 報 導 指 出 界 面 活 性 劑 會 破 壞 植 物 表 面 蠟 質 的 完 整 而 增 加 其 透 水 性 (Riederer, 1990), 顯 示 介 面 活 性 劑 的 使 用 可 能 使 病 原 菌 較 易 入 侵 而 加 重 病 害 的 嚴 重 度, 亦 可 能 影 響 微 生 物 生 長 而 減 經 病 害 的 發 生, 此 效 果 隨 植 物 種 類 與 病 害 的 不 同 而 有 所 差 異, 未 來 可 透 過 進 一 步 的 試 驗 來 確 定 tween 20 對 病 害 發 生 的 影 響 文 旦 柚 皮 與 檸 檬 桉 落 葉 分 別 為 台 灣 本 土 與 國 外 造 紙 業 於 農 業 和 工 業 生 產 時 製 造 的 農 業 廢 棄 物, 本 研 究 結 果 顯 示, 此 兩 種 材 料 皆 可 作 為 精 油 萃 取 來 源, 並 具 有 應 用 於 防 治 植 物 病 害 與 提 升 亞 托 敏 藥 效 的 潛 力 未 來 仍 可 繼 續 測 試 精 油 於 溫 室 或 田 間 是 否 也 有 提 升 亞 托 敏 藥 效 的 能 力, 並 篩 選 適 當 的 施 用 方 法 或 劑 型, 來 降 低 精 油 可 能 造 成 的 藥 害 和 其 於 開 放 空 間 的 散 失, 開 發 成 更 具 植 物 病 害 防 治 效 果 的 資 材 24

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表 一 本 試 驗 中 使 用 之 菌 株 Table 1. Plant pathogens used in this study Isolate Scientific name Common name Host Azoxystrobinresistance isolate 1 GBS3-93 Botrytis cinerea gray mold strawberry - GBS1-104 Botrytis cinerea gray mold strawberry + PA01 Colletotrichum higginsianum anthracnose Chinese cabbage N/D CO-51 Colletotrichum orbiculare anthracnose cucumber - CSG7-3 Colletotrichum gloeosporioides anthracnose strawberry N/D CPY-01A Fusarium solani f. sp. phalaenopsis yellow leaf disease orchid N/D Cmep1-3 Penicillium digitatum green mold citron N/D PG6-3 Pestalotiopsis sp. scab guava N/D PC Phytophthora capsici blight pimento N/D 1 The azoxystrobin resistance of tested plant pathogens. + : azoxystrobin-resistance isolate, - : azoxystrobin-sensitive isolate, N/D : untested. 29

表 二 以 柚 子 精 油 薰 蒸 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 之 生 長 抑 制 效 果 Table 2. Effect of Citrus maxima essential oil with volatile treatment on inhibiting the growth of plant pathogens Diluted folds of essential oil 1 Inhibition rate of mycelial growth (%) 2 GBS1-104 3 GBS3-93 3 CSG7-3 3 PA01 3 CO-51 3 PC 3 PG6-3 3 Cmep1-3 3 CPY-01A 3 1 100.0±0.0d 92.7±6.4d 28.7±2.7a 75.9±4.4d 28.3±19.3a 37.7±3.9a 25.2±1.7a -32.8±24.6a 46.9±3.8b 10 43.0±8.0c 53.0±9.7c 8.4±2.5ab 30.9±5.7c 0.8±3.2ab -10.0±3.1d 8.9±2.5bc -6.9±20.8a 5.7±4.4a 20 20.3±6.0b 20.0±3.0b 6.5±0.4c 20.7±3.0b 7.7±4.0ab -3.3±1.0cd 10.0±5.0b 0.3±5.0a 8.8±8.7a 50-0.1±4.4a -2.3±3.7ab -2.1±3.2c -10.4±4.4a -9.7±22.5b -5.4±2.2cd -5.3±3.8d -8.3±8.2a -2.6±2.8a 100 4.4±3.2a -1.8±4.8ab 2.5±10.8c -3.2±3.1a -8.0±5.7b -17.3±1.1c 0.1±1.7bc -5.9±4.6a 4.6±3.9a Tween 20 (0.01)% 4.2±1.4a -11.4±2.4a -1.5±2.8c -3.2±3.1a -5.5±4.5b -1.1±3.0b 0.6±1.7bc -17.3±12.5a 0.9±1.8a 1 The essential oils were diluted with tween 20 (0.01%) 2 Inhibition rate (%) = (CK-Treatment) / CK 100 3 Plant pathogen isolates used in this experiment. GBS1-104, GBS3-93 : Botrytis cinerea ; CSG7-3 : Colletotrichum gloeosporioides; PA01: Colletotrichum higginsianum; CO- 51 : Colletotrichum orbiculare ; PC : Phytophthora capsici ; PG6-3 Pestalotiopsis sp. ; Cmep1-3 : Penicillium digitatum ; CPY-01A : Fusarium solani. 30

表 三 以 檸 檬 桉 精 油 薰 蒸 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 之 生 長 抑 制 效 果 Table 3. Effect of Eucalyptus citriodora essential oil with volatile treatment on inhibiting the growth of plant pathogens Diluted folds of essential oil 1 Inhibition rate of mycelial growth (%) 2 GBS1-104 3 GBS3-93 3 CSG7-3 3 PA01 3 CO-51 3 PC 3 PG6-3 3 Cmep1-3 3 CPY-01A 3 10 100.0±0.0c 100.0±0.0b 96.6±3.3d 100.0±0.0c 100.0±0.0d 100.0±0.0c 96.8±5.5d 100.0±0.0c 100.0±0.0c 50 100.0±0.0c 93.3±8.3b 29.6±5.4c 88.4±10.5c 68.7±9.9c 88.0±16.1c 45.0±2.0c 51.0±10.6b 68.7±9.9b 100 76.8±10.8b 89.0±4.4b 15.2±2.4b 39.8±12.2b 29.6±5.7b 29.2±7.1b 28.6±8.9b -18.2±8.9a 29.6±5.7a Tween 20 (0.01%) -6.2±7.4a -6.8±5.0a -1.2±2.6a 4.5±12.2a -5.2±9.2a -0.6±4.1a 11.2±7.1a -29.5±8.7a 0.9±1.8a 1 The essential oils were diluted with tween 20 (0.01%) 2 Inhibition rate (%)= (CK-Treatment) / CK 100 3 Plant pathogen isolates used in this experiment. GBS1-104, GBS3-93 : Botrytis cinerea ; CSG7-3 : Colletotrichum gloeosporioides; PA01: Colletotrichum higginsianum; CO- 51 : Colletotrichum orbiculare ; PC : Phytophthora capsici ; PG6-3 Pestalotiopsis sp. ; Cmep1-3 : Penicillium digitatum ; CPY-01A : Fusarium solani. 31

表 四 柚 子 精 油 培 養 基 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 菌 絲 生 長 抑 制 效 果 Table 4. Effect of PDA medium added with C. maxima essential oil on inhibiting mycelial growth of plant pathogens Diluted folds of essential oil 1 Inhibition rate of mycelial growth (%) 2 GBS1-104 3 GBS3-93 3 CSG7-3 3 PA01 3 CO-51 3 PC 3 PG6-3 3 Cmep1-3 3 CPY-01A 3 100 81.1±1.5b 73.4±1.1b 55.8±2.8c 89.8±5.1b 17.2±5.1b 77.9±3.4b 69.1±4.0b -48.6±17.7c 35.5±1.9c 1,000 38.7±0.9ab 34.8±6.5a 10.2±5.4b 28.7±9.7a 5.2±1.4a 30.1±6.9a 25.3±2.9a -33.3±3.2bc 7.9±2.2ab 10,000 19.1±3.7a 34.2±7.5a 8.4±4.3a 26.7±8.8a 9.8±4.0ab 37.5±2.8a 28.5±0.2a -17.5±8.1ab 8.0±6.0b Tween 20 (0.01%) 17.1±6.5a 29.5±5.0a 3.7±3.5a 8.4±6.8a 3.1±4.0a 42.8±5.8a 31.8±0.9a -6.4±1.9a -3.5±7.7a 1 The essential oils were diluted with tween 20 (0.01%) 2 Inhibition rate (%)= (CK-Treatment) / CK 100 3 Plant pathogen isolates used in this experiment. GBS1-104, GBS3-93 : Botrytis cinerea ; CSG7-3 : Colletotrichum gloeosporioides; PA01: Colletotrichum higginsianum; CO- 51 : Colletotrichum orbiculare ; PC : Phytophthora capsici ; PG6-3 Pestalotiopsis sp. ; Cmep1-3 : Penicillium digitatum ; CPY-01A : Fusarium solani. 32

表 五 檸 檬 桉 精 油 培 養 基 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 菌 絲 生 長 抑 制 效 果 Table 5. Effect of PDA medium added with E. citriodora essential oil on inhibiting mycelial growth of plant pathogens Diluted folds of essential oil 1 Inhibition rate of mycelial growth (%) 2 GBS1-104 3 GBS3-93 3 CSG7-3 3 PA01 3 CO-51 3 PC 3 PG6-3 3 Cmep1-3 3 CPY-01A 3 1,000 100.0±0.00c 100.0±0.0b 100.0±0.0b 100.0±0.0c 100.0±0.0b 100.0±0.0b 84.2±12.2c 72.2±14.3b 100.0±0.0b 10,000 31.6±1.7b 33.6±5.7a 82.5±2.3a 26.9±11.5b 5.2±8.2a 56.3±14.1a 17.0±6.7a -18.2±8.0a -1.9±2.1a 100,000 20.2±1.3a 31.5±3.2a 9.5±3.1a 10.0±4.6a 3.6±2.3a 43.6±4.8a 27.7±1.2ab -8.7±8.0a -0.2±7.3a Tween 20 (0.01%) 17.1±6.5a 29.5±5.0a 3.7±3.5a 8.4±6.8a 12.6±12.3a 42.8±5.8a 31.8±0.9b -6.4±1.9a -3.5±7.7a 1 The essential oils were diluted with tween 20 (0.01%) 2 Inhibition rate (%)= (CK-Treatment) / CK 100 3 Plant pathogen isolates used in this experiment. GBS1-104, GBS3-93 : Botrytis cinerea ; CSG7-3 : Colletotrichum gloeosporioides; PA01: Colletotrichum higginsianum; CO-51 : Colletotrichum orbiculare ; PC : Phytophthora capsici ; PG6-3 Pestalotiopsis sp. ; Cmep1-3 : Penicillium digitatum ; CPY-01A : Fusarium solani. 33

表 六 柚 子 精 油 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果 Table 6. Effect of C. maxima essential oil on inhibiting spore germination of plant pathogens Diluted folds of essential oil 1 Inhibition rate of spore germination (%) 2 PA01 3 GBS1-104 3 CPY-01A 3 Cmep1-3 3 CSG7-3 3 PG6-3 3 CO-51 3 10 100.0±0.0c 98.9±1.1c 100.0±0.0d -70.3±7.5a 98.2±1.1b 99.5±0.9b 100.0±0.0b 20 100.0±0.0c 98.6±0.6c 98.7±1.5cd -84.6±5.4a 98.3±1.5b 100.0±0.0b 97.6±3.0b 50 99.7±0.6c 93.3±3.4c 92.6±1.2bc -65.4±12.3a 98.1±2.1b 97.5±2.8b 99.4±1.0b 100 75.2±17.4b 70.9±14.3b 87.5±5.6b -21.6±29.5b 98.6±1.6b 97.5±4.4b 50.6±21.8a Tween 20 (0.01%) -2.0±1.2a -2.5±1.6a 2.0±1.8a 5.2±3.0b 0.1±2.0a 1.4±7.6a 32.7±4.2a 1 The essential oils were diluted with tween 20 (0.01%) 2 Inhibition rate (%)= (CK-Treatment) / CK 100 3 Plant pathogen isolates used in this experiment. PA01: Colletotrichum higginsianum; GBS1-104 : Botrytis cinerea ; CPY-01A : Fusarium solani ; Cmep1-3 : Penicillium digitatum ; CSG7-3 : Colletotrichum gloeosporioides ; PG6-3 Pestalotiopsis sp. ; CO-51 : Colletotrichum orbiculare. 34

表 七 檸 檬 桉 精 油 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果 Table 7. Effect of E. citriodora essential oil on inhibiting spore germination of plant pathogens Diluted folds of essential oil 1 Inhibition rate of spore germination (%) 2 PA01 3 GBS1-104 3 CPY-01A 3 Cmep1-3 3 CSG7-3 3 PG6-3 3 CO-51 3 500 82.7±7.0c 100.0±0.0b 98.3±1.5d 80.1±6.3b 98.2±0.4d 99.0±1.7c 100.0±0d 1,000 68.2±12.5bc 100.0±0.0b 83.5±1.2cd 83.3±7.9b 99.6±0.7d 59.8±1.0b 100.0±0d 1,500 72.1±9.1bc 98.6±1.2b 84.9±4.4bc 74.5±5.1b 88.4±1.2c 59.0±2.5b 90.3±3.9c 2,000 51.8±3.1b 97.3±0.5b 78.5±4.8ab 68.7±15.2b 78.5±2.5b 45.3±12.9b 67.0±1.6b Tween 20 (0.01%) -3.3±3.1a -2.5±1.6a 2.0±1.8a 5.2±3.0a 0.1±2.0a 2.0±2.1a 2.0±6.2a 1 The essential oils were diluted with tween 20 (0.01%) 2 Inhibition rate (%)= (CK-Treatment) / CK 100 3 Plant pathogen isolates used in this experiment. PA01: Colletotrichum higginsianum; GBS1-104 : Botrytis cinerea ; CPY-01A : Fusarium solani ; Cmep1-3 : Penicillium digitatum ; CSG7-3 : Colletotrichum gloeosporioides ; PG6-3 Pestalotiopsis sp. ; CO-51 : Colletotrichum orbiculare. 35

表 八 1,000 mg a.i./l 亞 托 敏 添 加 於 不 同 濃 度 精 油 對 草 莓 灰 黴 病 菌 菌 株 生 長 抑 制 效 果 Table 8. Effect of 1,000 mg a.i./l azoxystrobin added with different concentrations of essential oils on inhibiting isolates of B. cinerea Essential oil Diluted fold Inhibition rate of mycelial growth (%) 1 GBS1-104 2 GBS3-93 3 C. maxima 100 71.0±14.7b 100.0±0.0b 1,000 40.7±0.9a 66.0±1.8a 10,000 39.0±1.8a 65.2±2.3a E. citriodora 1,000 100.0±0.0c 100.0±0.0c 10,000 52.0±2.9b 75.7±2.1b 100,000 44.6±4.5a 64.6±2.3a Azoxystrobin 41.1±2.5a 62.2±4.4a 1 Inhibition rate (%)= (CK-Treatment) / CK 100 2 GBS1-104 : azoxystrobin-resistant isolate 3 GBS3-93 : azoxystrobin-sensitive isolate 36

表 九 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 的 效 果 Table 9. Efficacy of essential oils on control of Chinese cabbage anthracnose Disease severity (%) 2 Essential oil Diluted fold 1 1 hr before inoculation 1 hr after inoculation C. maxima 50 50.0±21.7bcd 37.5±0.0bc 100 58.3±19.1bcd 33.3±14.4ab E. citriodora 500 37.5±0.0bc 25.0±0.0ab 1,000 37.5±0.0bc 33.3±14.4ab Tween 20 (0.01%) 75.0±0.0d 70.8±19.1cd CK1 3 83.3±14.4d 83.3±14.4d CK2 4 0.0±0.0a 0.0±0.0a 1 The essential oils were diluted with tween 20 (0.01%) 2 Disease severity (%)= ( number of leaves in each scale scale number) /(total leaves max scale) 3 CK1 : Treated with water before/after inoculation. 4 CK2 : Not inoculated. 37

表 十 精 油 對 胡 瓜 炭 疽 病 的 防 治 效 果 Table 10. Efficacy of essential oils on control of cucumber anthracnose Disease severity (%) 2 Essential oil Diluted fold 1 1 hr before inoculation 1 hr after inoculation C. maxima 50 3.7±5.5ab 5.0±0.0abc 100 4.2±2.8ab 3.2±3.8ab E. citriodora 500 9.3±3.6abc 9.3±3.6abc 1,000 9.3±5.0abc 12.7±6.3abc Tween 20 (0.01%) 17.5±6.6c 10.0±4.3abc CK1 3 15.0±5.0bc 15.0±.5.0bc CK2 4 0.0±0.0a 0.0±0.0a 1 The essential oils were diluted with tween 20 (0.01%) 2 Disease severity (%)=( number of leaves in each scale scale number)/(total leaves max scale) 3 CK : Treated with water before/after inoculation. 4 CK2 : Not inoculated. 38

表 十 一 精 油 防 治 由 B. cinerea GB1-104 引 起 之 草 莓 葉 部 灰 黴 病 的 效 果 Table 11. Efficacy of essential oils on control of strawberry leaves gray mold caused by B. cinerea GB1-104 Disease severity (%) 2 Essential oil Diluted fold 1 1 hr before inoculation 1 hr after inoculation C. maxima 50 72.2±29.3bc 30.6±12.7abc 100 77.8±9.6c 50.0±25.0abc E. citriodora 500 66.7±22.1bc 25.0±16.7abc 1,000 69.4±29.3bc 16.7±8.3ab Tween 20 (0.01%) 72.2±29.3bc 77.8±17.4c CK1 3 22.2±12.7abc 22.2±12.7abc CK2 4 0.0±0.0a 0.0±0.0a 1 The essential oils were diluted with tween 20 (0.01%) 2 Disease severity (%)=( number of leaves in each scale scale number)/(total leaves max scale) 3 CK : Treated with water before/after inoculation. 4 CK2 : Not inoculated. 39

表 十 二 精 油 防 治 由 B. cinerea GB1-104 引 起 之 草 莓 果 實 灰 黴 病 的 效 果 Table 12. Efficacy of essential oils on control of strawberry fruit gray mold caused by B. cinerea GB1-104 Disease severity (%) 2 Essential oil Diluted fold 1 1 hr before inoculation 1 hr after inoculation C. maxima 50 79.2±14.4de 41.7±14.4bc 100 54.2±19.1bcd 33.3±14.4abc E. citriodora 500 83.3±19.1de 25.0±0.0ab 1,000 41.7±14.4bc 29.2±7.2abc Tween 20 (0.01%) 62.5±12.5cd 87.5±12.5de CK1 3 100.0±0.0e 100.0±0.0e CK2 4 0.0±0.0a 0.0±0.0a 1 The essential oils were diluted with tween 20 (0.01%) 2 Disease severity (%)=( number of fruits in each scale scale number)/(total fruits max scale) 3 CK : Treated with water before/after inoculation. 4 CK2 : Not inoculated. 40

圖 一 柚 子 皮 為 台 灣 主 要 的 農 業 廢 棄 物 之 一 Figure 1.Peel of pomelo, which is one of the main agriculture waste in Taiwan. 41

圖 二 精 油 蒸 餾 萃 取 裝 置 示 意 圖 右 側 為 材 料 加 熱 處, 中 間 為 冷 卻 管, 左 側 為 精 油 收 集 瓶 Figure 2.The equipment of steam distillation. The materials were heated in the flask on the right side, the produced steam would be cooled down in the middle tube and collected to the flask on the left side. 42

RT: 0.00-49.19 100 90 96.27 % 9.23 NL: 2.91E6 TIC MS 20141107- Peo 80 relative Relative abundance Abundance 70 60 50 40 30 20 10 0 7.65 9.77 11.55 14.83 19.94 22.84 24.17 27.75 31.95 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) 圖 三 柚 子 精 油 之 氣 相 層 析 圖 Figure 3. GC spectrum of C. maxima 43

100 [ ] 66.98 90.98 90 80 70 60 50 92.98 93.94 The main content of pomelo essential oil. 40 30 20 107.03 relative abundance 10 0 136.01 145.08 193.04 215.06 280.79 326.92 371.82 50 100 150 200 250 300 350 400 m/z Limonene 圖 四 柚 子 精 油 主 成 分 與 檸 檬 烯 之 質 譜 圖 Figure 4. MS spectrum of limonene and the main content of pomelo essential oil. 44

RT: 0.00-50.19 100 90 43.69% 14.21 NL: 2.53E6 TIC MS a01 80 relative abundance Relative Abundance 70 60 50 40 30 20 10 0 8.91% 14.07 6.25% 16.78 17.06% 20.91 12.56% 23.18 6.95 8.29 5.26 12.73 20.56 24.29 28.09 28.46 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) 4.5% 圖 五 檸 檬 桉 精 油 之 氣 相 層 析 圖 Figure 5. GC spectrum of E. citriodora 45

+ c Full ms [40.00 600.00] 100 41.01 90 80 70 60 67.01 95.03 121.01 Chemical B 50 40 30 20 139.08 10 relative abundance 0 154.05 177.03 236.04 299.64 358.32 41 50 100 150 200 250 300 350 400 m/z Citronellal 圖 六 化 合 物 B 與 香 茅 醛 之 質 譜 圖 Figure 6. MS spectrum of citronellal and chemical B. 46

c Full ms [40.00 600.00] 67.01 100 90 80 70 81.01 60 50 40 95.02 Chemical D relative abundance 30 20 10 0 123.10 138.03 153.93 209.15 50 100 150 200 250 300 350 40 m/z Citronellol 圖 七 化 合 物 D 與 香 茅 醇 之 質 譜 圖 Figure 3. MS spectrum of citronellol and chemical D. 47

+ c Full ms [40.00 600.00] 67.00 100 81.02 90 80 70 Chemical E 60 50 95.02 40 relative abundance 30 20 10 0 123.02 137.97 180.49 265.14 327.08 50 100 150 200 250 300 350 40 m/z Citronellyl acetate 圖 八 化 合 物 E 與 乙 酸 香 葉 酯 之 質 譜 圖 Figure 8. MS spectrum of citronellyl acetate and chemical E. 48

100 91.03 90 80 70 60 105.04 Chemical F 50 40 79.02 133.05 30 relative abundance 20 10 0 40.96 161.04 189.04 204.15 50 100 150 200 250 300 350 400 450 50 m/z Caryophyllene 圖 九 化 合 物 F 與 丁 香 烯 之 質 譜 圖 Figure 9, MS spectrum of caryophyllene and chemical F. 49

Inhibition rate of mycelial growth(%) 100% 80% 60% 40% 20% E. citriodora 1,000X E. citriodora 10,000X C. maxima 100X Azoxystrobin 0% 1000 500 100 50 0 Concentration of azoxystrobin(mg a. i./l) 圖 十 於 不 同 濃 度 亞 托 敏 添 加 柚 子 或 檸 檬 桉 精 油 對 抗 亞 托 敏 草 莓 灰 徽 病 菌 菌 株 (GBS1-104) 生 長 抑 制 效 果 測 試 Figure 10. Efficacy of azoxystrobin added with essential oils from C. maxima and E. citriodora on inhibiting growth of azoxystrobin resistance B. cinerea GBS1-104. 50

圖 十 一 精 油 對 胡 瓜 葉 片 的 影 響 a: 處 理 水 ;b 為 處 理 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油 ;c: 處 理 稀 釋 50 倍 之 柚 子 精 油 ;d: 處 理 稀 釋 20 倍 之 柚 子 精 油 ;e: 處 理 0.01% 之 tween 20;f: 處 理 稀 釋 1,000 之 檸 檬 桉 精 油 ;g: 處 理 稀 釋 500 之 檸 檬 桉 精 油 ;h: 處 理 稀 釋 100 之 檸 檬 桉 精 油 圖 中 紅 色 箭 頭 所 指 處 為 精 油 造 成 之 傷 害 Figure 11. The phytotoxicity of essential oils on cucumber. a: water treatment; b: treated by 100X C. maxima essential oil ; c: treated by 50X C. maxima essential oil; d: treated by 20X C. maxima essential oil; e: 0.01% tween 20 treatment; f: treated by 1,000X E. citriodora essential oil; g: treated by 500X E. citriodora essential oil; h: treated by 100X E. citriodora essential oil. The wounds on leaves are pointed by red arrows. 51

圖 十 二 精 油 對 小 白 菜 葉 片 的 影 響 a: 處 理 水 ;b 為 處 理 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油 ;c: 處 理 稀 釋 50 倍 之 柚 子 精 油 ;d: 處 理 稀 釋 20 倍 之 柚 子 精 油 ;e: 處 理 0.01% 之 tween 20;f: 處 理 稀 釋 1,000 之 檸 檬 桉 精 油 ;g: 處 理 稀 釋 500 之 檸 檬 桉 精 油 ;h: 處 理 稀 釋 100 之 檸 檬 桉 精 油 圖 中 紅 色 箭 頭 所 指 處 為 精 油 造 成 之 傷 害 Figure 12. The phytotoxicity of essential oils on Chinese cabbage. a: water treatment; b: treated by 100X C. maxima essential oil ; c: treated by 50X C. maxima essential oil; d: treated by 20X C. maxima essential oil; e: 0.01% tween 20 treatment; f: treated by 1,000X E. citriodora essential oil; g: treated by 500X E. citriodora essential oil; h: treated by 100X E. citriodora essential oil. The wounds on leaves are pointed by red arrows. 52

圖 十 三 精 油 對 草 莓 葉 片 的 影 響 a: 處 理 水 ;b 為 處 理 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油 ;c: 處 理 稀 釋 50 倍 之 柚 子 精 油 ;d: 處 理 稀 釋 20 倍 之 柚 子 精 油 ;e: 處 理 0.01% 之 tween 20;f: 處 理 稀 釋 1,000 之 檸 檬 桉 精 油 ;g: 處 理 稀 釋 500 之 檸 檬 桉 精 油 ;h: 處 理 稀 釋 100 之 檸 檬 桉 精 油 圖 中 紅 色 箭 頭 所 指 處 為 精 油 造 成 之 傷 害 Figure 13. The phytotoxicity of essential oils on strawberry plants. a: water treatment; b: treated by 100X C. maxima essential oil ; c: treated by 50X C. maxima essential oil; d: treated by 20X C. maxima essential oil; e: 0.01% tween 20 treatment; f: treated by 1,000X E. citriodora essential oil; g: treated by 500X E. citriodora essential oil; h: treated by 100X E. citriodora essential oil. The wounds on leaves are pointed by red arrows. 53