中 国 农 学 通 报 2016,32(23):1-5 Chinese Agricultural Science Bulletin 仔 猪 感 染 PRRSV-FJ04A 毒 株 的 组 织 病 理 学 及 病 毒 在 体 内 分 布 研 究 王 隆 柏, 王 晨 燕, 吴 学 敏, 车 勇 良, 陈 如 敬, 周 伦 江 ( 福 建 省 农 业 科 学 院 畜 牧 兽 医 研 究 所 / 福 建 省 畜 禽 疫 病 防 治 工 程 技 术 研 究 中 心, 福 州 350013) 摘 要 : 旨 在 研 究 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 福 建 04A 株 (PRRSV-FJ04A) 感 染 仔 猪 后 的 组 织 病 理 变 化 和 病 毒 在 仔 猪 体 内 各 器 官 的 分 布 情 况 采 用 PRRSV-FJ04A 株 人 工 接 种 30 日 龄 PRRSV 抗 体 阴 性 仔 猪, 通 过 组 织 学 观 察 与 荧 光 定 量 RT-PCR 技 术, 对 呼 吸 道 消 化 道 泌 尿 道 主 要 器 官 及 免 疫 器 官 等 组 织 进 行 了 病 理 和 病 毒 抗 原 定 量 分 析 结 果 表 明,PRRSV-FJ04A 毒 株 接 种 猪 群 10 天 被 屠 宰 后, 肺 脏 中 有 大 量 肺 泡 细 胞 变 性 坏 死, 巨 噬 细 胞 增 生 ; 淋 巴 结 淋 巴 细 胞 坏 死 ; 脑 神 经 元 变 性 坏 死, 脾 小 体 有 大 量 细 胞 碎 片, 肝 脏 有 颗 粒 变 性, 扁 桃 体 隐 窝 上 皮 脱 落 等 ;PRRS 病 毒 在 猪 群 体 内 各 组 织 器 官 含 量 分 布 以 肺 脏 为 最 高, 其 次 为 淋 巴 结 脑 扁 桃 体 血 液 等, 而 在 肾 脏 中 病 毒 含 量 最 低 关 键 词 :PRRSV-FJ04A; 病 理 学 ; 分 布 中 图 分 类 号 :S854.4 文 献 标 志 码 :A 论 文 编 号 :casb16050005 PRRSV-FJ04A Distribution and Histopathology in Infected Piglets Wang Longbai, Wang Chenyan, Wu Xuemin, Che Yongliang, Chen Rujing, Zhou Lunjiang (Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences/Fujian Animal Disease Control Technology Development Center, Fuzhou 350013) Abstract: The experiment was conducted to study the histopathological changes of piglets infected by PRRSV- FJ04A and its distribution in the infected piglets. PRRSV-FJ04A strain was used to infect the 30-day-old healthy piglets. The pathological changes and distribution of virus in the organs including airtube, digestive canal, urinary tract and immune organs were analyzed by histopathology observation and real- time RT- PCR assay. The piglets were killed 10 days after infected. The results showed that there were a lot of metamorphic and necrotic alveolar cells, hyperplastic macrophages in the lung. It also caused necrotic lymphocyte of lymphaden and neuron degeneration, even neorobiosis of brain. And a lot of cell debris in acinus lienalis, granular degeneration of liver and exuviation of cryptae tonsillares were found. There were a large amount of virus in the lung, followed by lymph gland, brain, amygdala and blood. And kidney was found to have the least virus. Key words: PRRSV-FJ04A; pathohistology; distribution 0 引 言 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 (porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 是 由 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 (PRRSV) 引 起 母 猪 不 孕 流 产 产 死 胎 和 育 肥 猪 呼 基 金 项 目 : 省 公 益 类 科 研 院 所 专 项 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 多 抗 原 表 位 基 因 串 联 表 达 与 应 用 研 究 (2014R1023-16); 福 建 省 科 技 创 新 平 台 建 设 项 目 猪 主 要 病 毒 性 疾 病 化 学 发 光 免 疫 检 测 技 术 的 研 究 与 应 用 (2014N2003-4) 第 一 作 者 简 介 : 王 隆 柏, 男,1977 年 出 生, 副 研 究 员, 本 科, 研 究 方 向 : 动 物 病 毒 学 与 分 子 生 物 学 通 信 地 址 :350003 福 州 市 晋 安 区 新 店 埔 垱 100 号 福 建 省 农 业 科 学 院 畜 牧 兽 医 研 究 所,Tel:0591-87572301,E-mail:wanglongbai @163.com 通 讯 作 者 : 周 伦 江, 男,1973 年 出 生, 研 究 员, 博 士, 研 究 方 向 : 动 物 预 防 兽 医 学 通 信 地 址 :350003 福 州 市 晋 安 区 新 店 埔 垱 100 号 福 建 省 农 业 科 学 院 畜 牧 兽 医 研 究 所,Tel:0591-87572301,E-mail:lunjiang@163.com 收 稿 日 期 :2016-05-03, 修 回 日 期 :2016-07-06
2 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn [1-2] 吸 障 碍 为 特 征 的 传 染 病, 可 诱 导 其 他 一 些 病 毒 或 细 菌 不 同 程 度 继 发 感 染 PRRSV 属 于 动 脉 炎 病 毒 科 动 脉 炎 病 毒 属, 为 单 股 正 链 RNA 病 毒 据 血 清 学 和 基 因 序 列 分 析 表 明 :PRRSV 可 划 分 为 2 种 基 本 基 因 型, 即 欧 洲 型 和 美 洲 型, 代 表 株 分 别 为 LV 和 VR2332 [3-4] 该 [5] 病 自 1987 年 美 国 首 次 报 道 以 来, 已 经 给 世 界 主 要 养 猪 国 家 带 来 了 巨 大 经 济 损 失 据 已 有 研 究 表 明, [6-7] PRRSV 具 有 广 泛 变 异 特 点, 即 使 同 一 基 因 型 不 同 分 [8-9] 离 株 之 间 也 存 在 着 广 泛 的 抗 原 变 异 和 致 病 性 差 异 笔 者 通 过 美 洲 型 PRRSV-FJ04A 株 人 工 感 染 仔 猪, 复 制 出 PRRS 病 症, 采 集 各 器 官 病 料 分 别 通 过 组 织 病 理 学 与 荧 光 定 量 RT-PCR 技 术, 观 察 各 器 官 的 组 织 病 理 变 化 和 病 毒 在 体 内 的 分 布 规 律, 为 PRRSV 临 床 诊 断 及 有 效 预 防 提 供 理 论 参 考 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 试 剂 与 仪 器 PRRSV-FJ04A 毒 株 由 本 研 究 室 分 离 鉴 定 保 存 8 头 30 日 龄 PRRSV 抗 体 为 阴 性 的 仔 猪 由 福 州 一 种 猪 有 限 公 司 提 供 TRIzol 购 自 Invitrogen 公 司 AgPath- ID TM Onestep RT-PCR Kit 试 剂 盒 购 自 ABI 公 司, 定 量 PCR 八 联 管 购 自 BIO- RAD 公 司 普 通 PCR 仪 为 ABI 公 司 2720, 荧 光 定 量 PCR 扩 增 仪 为 Eppendorf AG 22331, 引 物 和 探 针 均 由 TaKaRa( 大 连 ) 公 司 合 成 1.2 方 法 1.2.1 动 物 接 种 及 样 品 采 集 随 机 选 取 6 头 断 奶 仔 猪 接 种 PRRSV-FJ04A 株 病 毒, 每 头 猪 均 采 用 以 下 3 种 方 式 接 种 病 毒 : 分 别 为 颈 部 肌 肉 注 射 1 ml/ 头, 口 服 0.5 ml/ 头, 滴 鼻 0.5 ml/ 头 病 毒 量 为 2 10 7.25 TCID 50/mL 接 种 后 观 察 仔 猪 的 临 床 表 现, 每 天 测 定 体 温 变 化 待 发 病 猪 群 发 病 第 10 天 时 扑 杀 病 重 猪, 剖 检 观 察 采 心 脏 肺 脏 脾 脏 肝 脏 肾 脏 淋 巴 结 等 主 要 器 官 的 组 织 各 2 份, 其 中 一 份 用 10% 甲 醛 固 定, 另 一 份 用 作 检 测 病 毒 含 量 2 头 仔 猪 接 种 相 同 剂 量 的 生 理 盐 水, 不 接 种 病 毒, 作 为 阴 性 对 照 1.2.2 组 织 病 理 学 观 察 剖 检 病 猪 收 集 肝 脏 肺 脏 脾 脏 和 淋 巴 结 等 组 织 器 官 切 成 厚 度 约 5 mm 的 组 织 块, 用 10% 甲 醛 固 定 24 h 后, 经 过 流 水 冲 洗, 不 同 浓 度 乙 醇 脱 水 浸 蜡 包 埋 修 蜡 切 片 染 色, 观 察 各 组 织 器 官 的 病 理 学 变 化 1.2.3 病 毒 体 内 分 布 含 量 测 定 取 各 器 官 病 料 1 g 用 作 提 取 病 毒 RNA 的 样 品, 其 提 取 方 法 按 照 Invitrogen TRIzol Reagent 说 明 书 进 行 ; 引 物 探 针 设 计 及 标 准 曲 [6] 线 构 建 参 照 文 献, 荧 光 定 量 RT-PCR 方 法 反 应 体 系 和 反 应 条 件 按 AgPath-ID TM One-step RT-PCR Kit 试 剂 盒 说 明 书 进 行 病 毒 分 布 含 量 根 据 扩 增 曲 线 图, 可 由 软 件 自 动 分 析 出 每 个 检 测 样 品 的 CT 值 及 相 应 病 毒 拷 贝 数 2 结 果 与 分 析 2.1 临 床 症 状 猪 群 接 种 病 毒 3 天 后 开 始 出 现 体 温 升 高 至 40.8, 病 猪 出 现 食 欲 不 振, 精 神 沉 郁, 尿 黄, 部 分 还 伴 有 流 清 鼻 涕 和 呼 吸 困 难 ; 发 病 10 天 后, 病 重 猪 的 耳 朵 和 腹 部 发 紫 发 绀, 出 现 结 膜 炎 ; 个 别 病 猪 后 肢 瘫 痪, 站 立 不 起 而 阴 性 对 照 猪 群 未 见 异 常 症 状 2.2 病 理 变 化 剖 检 病 程 为 10 天 的 猪 2 头, 为 病 猪 1 和 病 猪 2 病 理 变 化 为 肺 部 有 出 血 点 肉 变 水 肿 和 间 质 变 宽 等 ; 肺 门 腹 股 沟 肠 系 膜 等 处 淋 巴 结 出 血 肿 大 ; 扁 桃 体 充 血 出 血 ; 脑 膜 充 血 ; 大 部 分 病 死 猪 有 心 包 炎 ; 肾 脏 呈 褐 色 或 土 黄 色, 质 地 较 脆 ; 个 别 病 死 猪 胃 底 黏 膜 有 少 许 溃 疡 和 出 血 点 而 阴 性 对 照 猪 群 未 见 异 常 病 理 变 化 2.3 组 织 病 理 切 片 分 别 取 病 程 10 天 和 阴 性 对 照 猪 的 组 织 器 官 进 行 病 理 切 片, 结 果 阴 性 对 照 猪 的 组 织 器 官 未 出 现 异 常, 而 接 毒 试 验 组 出 现 如 下 组 织 病 变 肺 脏 : 主 要 表 现 为 肺 炎, 肺 泡 腔 内 有 大 量 渗 出 物, 如 红 细 胞 白 细 胞 及 胞 碎 屑 等, 肺 泡 细 胞 出 现 变 性 坏 死 和 脱 落, 间 质 中 有 纤 维 增 生, 导 致 实 变, 而 且 在 间 质 可 见 到 许 多 积 聚 的 淋 巴 细 胞 ; 在 肺 内 支 气 管 中, 有 许 多 积 聚 的 淋 巴 细 胞 渗 出 性 蛋 白 及 纤 维 原 等 成 分 ; 在 肺 间 质 的 巨 噬 细 胞 出 现 增 生, 肺 泡 膈 变 厚, 观 察 到 不 同 程 度 死 亡 的 巨 噬 细 胞, 淋 巴 细 胞 外 渗 ( 图 1) 图 1 病 猪 肺 脏 组 织 切 片 扁 桃 体 : 有 出 血 斑 和 出 血 点, 脱 落 的 隐 窝 上 皮, 结 构 疏 松 的 淋 巴 小 结, 出 现 许 多 坏 死 淋 巴 细 胞, 且 数 量 在 减 少, 出 现 空 腔 ( 图 2)
王隆柏等 仔猪感染 PRRSV-FJ04A 毒株的组织病理学及病毒在体内分布研究 图 2 病猪扁桃体组织切片 3 图 5 病猪脑组织切片 肝脏 出现淋巴细胞浸润 红细胞积聚 肝血窦内 脾脏 有大量增生脾小梁 白髓大量减少 脾小体 枯否氏细胞变多 小叶间和门管区有淋巴细胞增生 小 中出现淋巴细胞坏死 血液大量变多 坏死灶中发现红 叶间增宽 可风肝细胞空泡变性 图 3 细胞浸润 淋巴小结减少许多 图 6 图 3 病猪肝脏组织切片 淋巴结 以出血性淋巴结炎为主 被膜下水肿 有 大量的水泡变性 坏死 形成空泡 并有大量红细胞浸 图 6 病猪脾脏组织切片 肾脏 肾小管间出血 肾小球肾炎 可见内有细胞 坏死 红细胞浸润 图 7 润 图 4 图 7 病猪肾小球组织切片 图 4 病猪淋巴结组织切片 脑 病变表现为非化脓性脑炎 水样变性的大脑皮 质分子层 神经元坏死 变性 血管周围出现单个核细 胞积集成管套现象 脑组织内出现许多空泡 图 5 结肠 粘膜表面覆盖渗出物 上皮下固有层处有许 多浸润的炎性细胞 如浆细胞 中性粒细胞和肥大细 胞 同时粘膜上皮坏死 变性 图 8 胃 底腺部结构紊乱 腺细胞减少 粘膜上皮下的
4 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 图 8 病猪结肠粘膜组织切片 图 9 病猪胃粘膜上皮组织切片 固有层有大量的炎症细胞 图 9 结 扁桃体 血液 脑汁等 而肾脏含量最低 根据病猪 2 扩增曲线由软件自动生成的 CT 值及计算出来各器 胰腺 有坏死灶 坏死灶附近有淋巴细胞为主的炎 性细胞浸润 间质中有大量的淋巴细胞浸润 官含病毒拷贝数见表 2 从表 2 可知病毒含量最高的器 2.4 病毒分布情况检测 官为肺脏 其次为淋巴结 血液 脑汁 扁桃体等 而肾 采用荧光定量 RT-PCR 定量检测病猪各器官样品 脏含量最低 可见 发病猪群 PRRS 病毒在体内各器 中病毒的分布情况 根据病猪 1 扩增曲线由软件自动 官分布情况大致为肺脏 淋巴结 扁桃体 脑汁 血液等 生成的 CT 值及计算出来各器官含病毒拷贝数见表 1 部位的含量较高 而在胰脏 肾脏等器官病毒含量 从表 1 可知病毒含量最高的器官为肺脏 其次为淋巴 较低 表 1 病猪 1 器官的病毒含量情况表 样品名称 肺脏 淋巴结 扁桃体 血液 脑汁 脾脏 肝脏 心脏 胰脏 肾脏 循环阀值 26.17 26.25 27.64 28.32 30.13 30.23 31.91 34.08 34.29 35.21 病毒拷贝数 1.15E+07 1.10E+07 5.68E+06 2.96E+06 9.43E+05 8.91E+05 4.21E+05 4.15E+04 3.64E+04 2.03E+04 表 2 病猪 2 器官的病毒含量情况表 样品名称 肺脏 淋巴结 血液 脑汁 扁桃体 脾脏 心脏 肝脏 胰脏 肾脏 循环阀值 24.0 25.37 28.31 29.33 29.95 31.79 32.39 35.02 35.98 36.87 病毒拷贝数 5.2E+07 2.17E+07 3.02E+06 1.55E+06 1.03E+06 3.17E+05 2.81E+05 3.59E+04 1.25E+04 5.68E+03 3 结论与讨论 细胞渗出物 巨噬细胞增生 淋巴结出现坏死等 出现 猪繁殖与呼吸综合征在临床主要表现为母猪怀孕 免疫抑制 这样致猪群的免疫功能被严重损坏 机体对 后期流产 产死胎及生长猪的呼吸道疾病 直接导致发 外界病毒或细菌的抵抗力大幅度下降 这与 PRRSV 病猪群的死亡较少 甚至有的毒株对感染猪群只发生 主要在单核巨噬细胞内完成病毒繁殖复制过程[11-13] 主 一过性的体温反应 体温一般不超过 40.5 临床症状 要侵害富含巨噬细胞或单核细胞组织器官的原理基本 和病理变化并不明显 若发生继发感染后临床症状才 吻合 这也从组织形态学角度进一步揭示了 PRRSV 表现出更为复杂和发病更严重 本研究将 PRRSV- 对猪免疫力影响的原因 [10] FJ04A 毒株人工感染仔猪 复制出了典型的 PRRS 病 目前已有许多方法用于 PRRSV 检测 如免疫荧 症 并致猪群发病严重 通过病理组织切片观察发现 光 病毒分离 RT-PCR 方法和核酸探针等 但这些检测 猪群各主要器官的实质细胞和有关淋巴细胞都有出现 技术存在费力 费时和不能进行定量检测的问题 而 不同程度坏死及组织中炎症细胞的浸入 微循环障碍 荧光定量 RT-PCR 方法可以弥补以上不足 荧光定量 等 尤其是病毒对肺脏 淋巴结 脾脏等系统破坏严重 PCR 技术是近几年发展起来的新技术 具有敏感性 出现巨噬细胞和淋巴细胞浸润 肺脏出现间质性肺炎 高 特异性好的优势 同时可以进行定时定量检测 已 有大量肺泡细胞变性坏死 脱落 大量纤维增生 淋巴 在临床检测中得到广泛应用[14] 本研究利用荧光定量
王 隆 柏 等 : 仔 猪 感 染 PRRSV-FJ04A 毒 株 的 组 织 病 理 学 及 病 毒 在 体 内 分 布 研 究 5 RT-PCR 方 法 定 量 检 测 病 毒 在 体 内 各 器 官 的 分 布 情 况, 使 得 试 验 结 果 就 更 为 准 确 可 信 试 验 结 果 表 明 : 在 所 检 测 的 器 官 中 都 存 在 病 毒, 肺 脏 淋 巴 结 扁 桃 体 脑 汁 血 液 等 组 织 器 官 含 量 较 高, 而 在 肝 脏 胰 脏 肾 脏 等 [15] 器 官 含 量 较 少, 这 与 匡 宇 等 采 用 免 疫 组 化 的 方 法 检 测 病 毒 分 布 情 况 基 本 一 致, 而 本 研 究 则 更 明 确 了 病 毒 在 各 主 要 器 官 中 的 含 量 通 过 观 察 PRRSV 引 起 的 病 理 组 织 学 变 化 及 荧 光 定 量 PCR 检 测 病 毒 在 各 器 官 的 分 布 为 研 究 PRRSV 的 致 病 机 理 及 疫 苗 评 价 等 奠 定 了 基 础 本 研 究 发 现 PRRSV 主 要 病 变 及 病 毒 分 布 含 量 较 高 的 器 官 基 本 为 集 中 在 肺 脏 淋 巴 结 脑 扁 桃 体 等, 这 就 明 确 的 解 释 PRRSV 在 临 床 上 表 现 出 来 的 复 杂 特 征, 如 出 现 类 似 伪 狂 犬 病 的 神 经 症 状, 引 起 神 经 胶 质 结 节 管 套 等 非 化 脓 性 脑 炎 的 病 变 外, 还 有 类 似 猪 瘟 一 样 的 临 床 症 状 和 消 化 道 病 理 而 且, 笔 者 特 意 采 取 病 料 及 肿 大 的 关 节 液 进 行 HCV PRV PCV PRRSV 检 测 及 细 菌 分 离, 结 果 发 现 只 有 PRRSV 为 阳 性, 这 进 一 步 说 明 单 一 的 PRRSV 能 直 接 造 成 大 量 猪 群 发 病 参 考 文 献 [1] Done S H, Paton D J. Porcine reproductive and respiratory syndrome: Clinical disease, pathology and immunosuppresion[j]. Vet Rec,1995,36:32-35. [2] 周 伦 江, 王 隆 柏, 王 伟, 等. 变 异 型 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 FJ06A 毒 株 的 分 离 鉴 定 和 致 病 性 [J]. 福 建 农 林 大 学 学 报 : 自 然 科 学 版, 2011,40(6):618-623. [3] 史 喜 菊, 韩 春 来, 夏 春, 等. 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 基 因 组 遗 传 变 异 分 析 [J]. 动 物 医 学 进 展,2003,24(3):58-60. [4] Meng X J, Paul P S, Halbur P G, et al. Phylogenetic analyses of the putative M(ORF6) and N(ORF7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(prrsv): Implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the USA and Europe[J].Arch Virol, 1995,140:745-755. [5] Keffaver K K. Reproductive failure of unknown etiology[j]. American Association of Swine Practitioness Newstetter,1989,1:1-9. [6] Mateu E, Martin M, Vidal D. Genetic diversity and phyiogenetic analysis of glycoprotein 5 of European- type porcine reproductive and respiratory virus strains in Spain[J].J GenVirol,2003,84:529-534. [7] 郝 晓 芳, 周 艳 群, 田 志 军, 等. 高 致 病 性 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 RT-PCR 鉴 别 诊 断 方 法 的 建 立 [J]. 中 国 预 防 兽 医 学 报,2007,29(9): 704-709. [8] Meng X J, Paul P S, Halbur P G,et al.sequence comparison of open reading frames 2 to 5 of low and high virulence United States isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[j]. Jornal of General Virology,1996,76:3181-3188. [9] 宋 志 军, 宋 长 绪, 杨 增 岐, 等. 猪 生 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 TaqMan 荧 光 定 量 RT-PCR 检 测 方 法 的 建 立 [J]. 中 国 兽 医 科 学,2006,36(2):98-102. [10] Qiu H J, Tian Z J, Tong G Z, et a1.inducing protectiveimmunity of a recombinant pseudorabies virus expressing the GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in piglet[j].vet Immunol Immunopathol,2005,106:309-319. [11] 郑 杰, 宁 宜 宝, 赵 启 祖, 等. 高 致 病 性 变 异 株 引 起 的 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 在 我 国 的 发 生 与 流 行 [J]. 中 国 兽 医 杂 志,2007,43(6):48-51. [12] 熊 丁 杰, 徐 志 文, 梅 淼, 等.PRRSV 感 染 致 断 奶 仔 猪 肺 脏 和 外 周 免 疫 器 官 的 病 理 损 伤 [J]. 中 国 兽 医 学 报,2011,11(5):725-729. [13] Bautista E M, Suarez P, Molitor T W, et al. T cell response to the structural polypetides of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[j].arch Virol,199,144:117-134. [14] Ke L D, Chen Z, Yung W K. A reliability test of standard- based quantitative PCR: exogenous VS endogenous standards[j].molcell Probes,2000,l4(2):27-35. [15] 匡 宇, 郭 鑫, 滕 可 导, 等.PRRSV 缺 失 变 异 毒 株 HB-2(sh)2002 在 人 工 感 染 仔 猪 组 织 中 的 分 布 与 定 位 [J]. 中 国 兽 医 杂 志,2007,43(3):8-10.