环 球 中 医 药 2016 年 5 月 第 9 卷 第 5 期 摇 Global Traditional Chinese Medicine, May 2016,Vol 郾 9, No 郾 5 摇 557 两 种 电 针 对 脊 髓 损 伤 14 天 后 大 鼠 运 动 功 能 神 经 元 及 MEK2 p 鄄 ERK1 表 达 的 影 响 论 著 宋 良 玉 摇 吕 威 摇 景 泉 凯 摇 莫 雨 平 摇 姚 海 江 摇 宋 洪 涛 摇 姜 婧 摇 苑 晓 晨 摇 毛 颖 秋 摇 时 素 华 摇 李 志 刚 揖 摘 要 铱 摇 目 的 摇 基 于 Raf / Ras / ERK 信 号 通 路, 探 讨 两 种 电 针 对 大 鼠 脊 髓 损 伤 后 14 天 丝 裂 原 激 活 / 细 胞 外 信 号 调 节 激 酶 2(mitogen 鄄 activated / extracellular signal 鄄 regulated kinase 2,MEK2) 磷 酸 化 细 胞 外 信 号 调 节 蛋 白 激 酶 1(phosphorylation 鄄 extracellular signal 鄄 regulated kinase 1, p 鄄 ERK1) 表 达 的 影 响 以 及 对 大 鼠 后 肢 运 功 功 能 和 神 经 元 的 影 响 方 法 摇 雄 性 清 洁 级 SD 大 鼠 (60 只 ), 随 机 分 为 五 组, 空 白 组 (12 只 ) 假 手 术 组 (12 只 ) 模 型 组 (12 只 ) 脉 冲 电 针 组 (12 只 ) 音 乐 电 针 组 (12 只 ) 采 用 改 良 式 的 Allen 爷 s 打 击 法 复 制 模 型 两 组 电 针 组 选 取 大 椎 冶 命 门 冶 进 行 不 同 电 针 针 刺 干 预, 每 天 1 次, 每 次 20 分 钟, 空 白 组 假 手 术 组 及 模 型 组 在 治 疗 组 治 疗 时 进 行 抓 取 束 缚, 保 证 处 理 条 件 的 相 同 脊 髓 损 伤 (spinal cord injury,sci) 后 14 天, 采 用 神 经 功 能 评 定 法 BBB 评 分 对 大 鼠 脊 髓 损 伤 进 行 评 估, 综 合 评 定 大 鼠 SCI 后 的 运 动 功 能 采 用 HE 染 色 尼 氏 染 色 方 法 观 察 脊 髓 损 伤 大 鼠 损 伤 脊 髓 前 角 组 织 病 理 改 变 运 用 免 疫 组 化 技 术 和 Western blot 技 术 观 察 损 伤 脊 髓 前 角 MEK2 p 鄄 ERK1 含 量 的 变 化 结 果 摇 BBB 评 分 结 果 显 示, 经 脉 冲 电 针 与 音 乐 电 针 治 疗 后, 脊 髓 损 伤 大 鼠 后 肢 活 动 功 能 较 模 型 组 均 有 改 善 (P<0. 01), 且 音 乐 电 针 评 分 高 于 脉 冲 电 针, 但 两 组 比 较 无 统 计 学 差 异 ;HE 染 色 与 尼 氏 染 色 结 果 说 明 脉 冲 电 针 与 音 乐 电 针 组 均 可 修 复 脊 髓 前 角 神 经 元 细 胞, 增 加 神 经 元 细 胞 中 尼 氏 体 含 量, 且 音 乐 电 针 优 于 脉 冲 电 针 ; 免 疫 组 化 及 Western Blot 结 果 说 明 脉 冲 电 针 与 音 乐 电 针 均 可 提 高 脊 髓 前 角 神 经 元 中 MEK2 p 鄄 ERK1 的 含 量, 但 两 者 无 统 计 学 差 异 结 论 摇 脉 冲 电 针 与 音 乐 电 针 均 能 诱 导 SCI 大 鼠 脊 髓 内 MEK2 p 鄄 ERK1 的 表 达, 促 进 脊 髓 损 伤 后 神 经 修 复 再 生 功 能, 音 乐 电 针 作 用 较 脉 冲 电 针 略 有 优 势 揖 关 键 词 铱 摇 脉 冲 电 针 ; 摇 音 乐 电 针 ; 摇 脊 髓 损 伤 ; 摇 大 鼠 ; 摇 丝 裂 原 激 酶 活 / 细 胞 外 信 号 调 节 激 酶 2; 摇 磷 酸 化 细 胞 外 信 号 调 节 蛋 白 激 酶 1 揖 中 图 分 类 号 铱 摇 R245. 31+9 摇 揖 文 献 标 识 码 铱 摇 A 摇 doi:10 郾 3969 / j 郾 issn 郾 1674 鄄 1749 郾 2016 郾 05 郾 009 Influences on the locomotor function, neuron and the expression of MEK2 and p 鄄 ERK1 of the 14 th day post 鄄 spinal cord injury rats by using two different electro 鄄 acupuncture therapies 摇 SONG Liang 鄄 yu, LV Wei, JING Quan 鄄 kai, et al. School of Acupuncture and Moxibustion, Beijing University of Chinese Medicine,Beijing,100029,China Corresponding author: SHI Su 鄄 hua, E 鄄 mail:molly 鄄 flower@ 163. com;li Zhi 鄄 gang, lizhigang620@ 126. com 揖 Abstract 铱 摇 Objective 摇 To investigate the influences on the expression of MEK2 and p 鄄 ERK1 in the 14th day post spinal cord injury (SCI) by using two different electro 鄄 acupuncture (EA) therapies, and 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 (81373728) 作 者 单 位 : 100029 摇 北 京 中 医 药 大 学 针 灸 推 拿 学 院 [ 宋 良 玉 ( 硕 士 研 究 生 ) 吕 威 ( 硕 士 研 究 生 ) 景 泉 凯 ( 硕 士 研 究 生 ) 莫 雨 平 ( 博 士 研 究 生 ) 姜 婧 ( 博 士 研 究 生 ) 李 志 刚 ]; 内 蒙 古 自 治 区 人 民 医 院 中 医 科 ( 宋 洪 涛 ); 中 国 医 学 科 学 院 微 循 环 研 究 所 ( 苑 晓 晨 ); 北 京 中 医 药 大 学 科 研 实 验 中 心 ( 毛 颖 秋 ); 北 京 中 医 药 大 学 第 三 附 属 医 院 康 复 科 ( 时 素 华 ); 中 国 康 复 研 究 中 心 北 京 博 爱 医 院 ( 姚 海 江 ); 首 都 医 科 大 学 康 复 医 学 院 ( 姚 海 江 ) 作 者 简 介 : 宋 良 玉 (1989- ), 女,2013 级 在 读 硕 士 研 究 生 研 究 方 向 : 针 刺 干 预 中 枢 神 经 系 统 损 伤 的 机 理 研 究 E 鄄 mail:877931519@ qq. com 通 讯 作 者 : 时 素 华 (1981 - ), 女, 博 士, 主 治 医 师 研 究 方 向 : 针 刺 干 预 中 枢 神 经 系 统 损 伤 的 机 理 研 究 E 鄄 mail:molly 鄄 flower@ 163. com; 李 志 刚 (1965- ), 博 士, 教 授, 博 士 生 导 师 研 究 方 向 : 针 刺 干 预 中 枢 神 经 系 统 损 伤 的 机 理 研 究 E 鄄 mail:lizhigang620@ 126. com
摇 558 环 球 中 医 药 2016 年 5 月 第 9 卷 第 5 期 摇 Global Traditional Chinese Medicine, May 2016,Vol 郾 9, No 郾 5 further explore the possible roles of MEK2 and p 鄄 ERK1 in the development of experimental SCI and the effect of different EA for them. Methods 摇 Adult male Sprague 鄄 Dawley ( SD) rats were randomly divided into normal control group (n = 12), sham operation group ( no operation, without SCI nor treatment, n = 12), SCI model group ( SCI 鄄 induction without treatment, n = 12), pulsed EA group ( SCI 鄄 induction with pulse 鄄 EA treatment, n = 12), and music EA group (SCI 鄄 induction with music 鄄 EA treatment, n = 12). SCI model was established by using the modified Allen 爷 s method. Basso 鄄 Beattic 鄄 Bresnahan ( BBB) scale was performed to assess the locomotor function of rats. HE staining and Nissl 爷 s staining were used to observe the pathological changes of SCI rats and the situation of remnant neuron. The expression of MEK2 and p 鄄 ERK1 was detected by using Western blot and Immunohistochemical method. Results 摇 The BBB score of SCI model group are significantly lower than normal control group and sham operation group, while pulsed 鄄 EA group and music 鄄 EA group could reverse it in the 14 th day post 鄄 SCI ( P < 0. 01), but there was no statistical differences between the two treatment groups (P>0. 05). The results of HE staining and Nissl 爷 s staining showed that the two kinds of treatment could improve this pathological changes. The expression of MEK2, p 鄄 ERK1 in SCI model group increased in the 14 th day post 鄄 SCI, while there was no statistical differences (P>0. 05), the two kinds of treatment could up 鄄 regulate the level of expression of MEK2 and p 鄄 ERK1 more significantly, but also had no statistical differences ( P>0. 05), and there was no statistical differences between the two treatment groups ( P >0. 05) at the same time. Conclusion 摇 MEK2 and p 鄄 ERK1 in SCI rats were higher than normal. The levels of The pulse 鄄 and music 鄄 EA treatments may effectively improve the levels of MEK2 and p 鄄 ERK1 in spinal cord, thus promoting the recovery of hindlimb function of SCI rats. The effectiveness of music 鄄 EA offered a better result in the recovery than that of pulse 鄄 EA treatment, but there was no statistical differences between the two treatment groups in locomotor function and the expression of MEK2 and p 鄄 ERK1 in the 14 th day post 鄄 SCI. 揖 Key words 铱 摇 Pulse electro 鄄 acupuncture; 摇 Music electro 鄄 acupuncture; 摇 Spinal cord injury; 摇 Rat; 摇 MEK2; 摇 p 鄄 ERK1 摇 摇 脊 髓 损 伤 ( spinal cord injury, SCI) 是 一 种 破 坏 性 的 神 经 系 统 疾 病 [1], 是 由 于 各 种 不 同 致 病 因 素 引 起 的 脊 髓 结 构 功 能 的 损 害, 造 成 损 伤 平 面 以 下 的 脊 髓 功 能 障 碍 [2] 随 着 人 们 生 活 水 平 的 提 高 现 代 工 业 的 发 展, 意 外 损 伤 导 致 的 脊 髓 损 伤 患 者 逐 年 增 加 [3] 全 球 脊 髓 损 伤 的 发 病 率 为 (20 ~ 60) / 1000 000 [4], 是 一 种 致 残 率 高 的 严 重 的 致 残 性 疾 病 [5], 起 病 突 然, 不 仅 使 患 者 终 身 面 临 残 疾, 同 时 也 形 成 了 与 他 人 不 同 的 特 殊 群 体 心 理 特 征 [6], 严 重 威 胁 着 患 者 的 健 康 和 生 命, 造 成 了 沉 重 的 社 会 和 家 庭 负 担 [7] 本 研 究 拟 以 不 同 电 针 治 疗 SCI 大 鼠 为 切 入 点, 运 用 大 鼠 脊 髓 损 伤 评 分 标 准 BBB 评 分 观 察 SCI 大 鼠 后 运 动 功 能 及 行 为 学 变 化 采 用 HE 染 色 尼 氏 染 色 观 察 SCI 大 鼠 损 伤 脊 髓 前 角 组 织 病 理 改 变, 探 讨 不 同 电 针 对 SCI 大 鼠 损 伤 脊 髓 前 角 形 态 学 的 影 响 Western blot 技 术 观 察 损 伤 脊 髓 前 角 丝 裂 原 激 活 / 细 胞 外 信 号 调 节 激 酶 2 (mitogen 鄄 activated / extracellular signal 鄄 regulated kinase 2, MEK2 ) 磷 酸 化 细 胞 外 信 号 调 节 蛋 白 激 酶 1 ( phosphorylation 鄄 extracellular signal 鄄 regulated kinase 1, p 鄄 ERK1) 含 量 的 变 化, 探 讨 不 同 电 针 对 SCI 大 鼠 损 伤 脊 髓 前 角 相 关 蛋 白 表 达 的 调 节 作 用 1 摇 材 料 与 方 法 1. 1 摇 动 物 与 分 组 选 择 清 洁 级 雄 性 SD 大 鼠, 体 质 量 (220 依 20) g, 共 60 只 随 机 分 为 五 组,A 空 白 组 (12 只 ) B 假 手 术 组 (12 只 ) C 模 型 组 (12 只 ) D 脉 冲 电 针 组 (12 只 ) E 音 乐 电 针 组 ( 12 只 ) 由 斯 贝 福 ( 北 京 ) 实 验 动 物 科 技 有 限 公 司 提 供, 合 格 证 号 :SCXK ( 京 )2011 鄄 0004 在 北 京 中 医 药 大 学 动 物 室 进 行 单 笼 饲 养, 温 度 为 (25 依 3) 益, 湿 度 (45 依 10) %, 自 由 饮 水 进 食, 并 且 实 行 12 小 时 昼 夜 规 律 调 整, 三 天 后 进 入 实 验 1. 2 摇 针 刺 方 法 造 模 步 骤 参 考 课 题 组 前 期 实 验 [8] 穴 位 选 择 参 照 全 国 针 灸 学 会 实 验 针 灸 研 究 会 制 定 的 实 验 动 物 针 灸 穴 位 图 谱 选 取 大 椎 冶 命 门 冶 两 个 督 脉 上 的 穴 位 空 白 组 (A): 相 同 饲 养 条 件 下 不 做 任 何 干 预, 但 要 在 其 他 针 刺 组 治 疗 时 抓 取 进 行 束 缚, 每 次 20 分 钟, 持 续 到 达 预 定 时 间, 以 保 证 处 理 条 件 相 同
环 球 中 医 药 2016 年 5 月 第 9 卷 第 5 期 摇 Global Traditional Chinese Medicine, May 2016,Vol 郾 9, No 郾 5 摇 559 假 手 术 组 (B): 相 同 饲 养 条 件 下, 术 后 不 做 任 何 处 理, 但 要 在 其 他 针 刺 组 治 疗 时 抓 取 进 行 束 缚, 每 次 20 分 钟, 持 续 到 达 预 定 时 间, 以 保 证 处 理 条 件 相 同 模 型 组 ( C) : 相 同 饲 养 条 件 下, 术 后 不 做 任 何 处 理, 但 要 在 其 他 针 刺 组 治 疗 时 抓 取 进 行 束 缚, 每 次 20 分 钟, 持 续 到 达 预 定 时 间, 以 保 证 处 理 条 件 相 同 脉 冲 电 针 组 ( D) : 于 造 模 后 先 行 BBB 评 分, 再 选 取 大 椎 冶 ( 第 7 颈 椎 棘 突 下, 向 下 斜 刺 ) 命 门 冶 ( 第 2 腰 椎 棘 突 下, 向 上 斜 刺 ) 进 针 约 0. 5 ~ 0. 7 cm 使 用 韩 氏 LH 鄄 202H 型 电 疗 仪, 上 接 阴 极, 下 接 阳 极, 持 续 脉 冲 电 流, 频 率 2 Hz, 强 度 2 ma, 治 疗 时 间 20 分 钟, 输 出 强 度 在 刚 开 始 时 以 背 部 肌 肉 出 现 轻 微 抽 动 为 度, 待 其 适 应 后 则 以 双 下 肢 瘫 痪 肌 肉 出 现 有 节 律 的 收 缩 为 度 每 天 重 复 治 疗 一 次, 持 续 到 达 预 定 时 间, 另 外 前 七 天 12 小 时 为 一 个 时 间 段 给 予 大 鼠 庆 大 霉 素 消 炎, 后 七 天 24 小 时 为 一 个 时 间 段 给 予 大 鼠 庆 大 霉 素 消 炎 音 乐 电 针 组 ( E): 于 造 模 后 先 行 BBB 评 分, 再 行 音 乐 电 针 治 疗, 取 穴 与 进 针 方 向 同 脉 冲 电 针 组, 针 柄 接 ZJ 鄄 12H 音 乐 电 针 治 疗 仪 ( 中 国 针 灸 学 会 研 制, 深 圳 市 圣 祥 高 科 技 有 限 公 司 生 产 ), 音 乐 选 取 治 瘫 处 方 [9], 每 次 20 分 钟, 输 出 强 度 在 刚 开 始 时 以 背 部 肌 肉 出 现 轻 微 抽 动 为 度, 待 其 适 应 后 则 以 双 下 肢 瘫 痪 肌 肉 出 现 有 节 律 的 收 缩 为 度 每 天 重 复 治 疗 一 次, 持 续 到 达 预 定 时 间, 另 外 前 七 天 12 小 时 为 一 个 时 间 段 给 予 大 鼠 庆 大 霉 素 消 炎, 后 七 天 24 小 时 为 一 个 时 间 段 给 予 大 鼠 庆 大 霉 素 消 炎 1. 3 摇 脊 髓 取 材 造 模 14 天 后 取 上 述 各 组 大 鼠 每 组 6 只, 用 10% 水 合 氯 醛 腹 腔 麻 醉 (3. 5 ml / kg), 待 大 鼠 深 度 麻 醉 固 定 于 弓 形 板 上 进 行 心 脏 灌 注 固 定 : 首 先 打 开 胸 腔, 充 分 暴 露 心 脏, 用 灌 注 针 从 左 心 室 心 尖 部 插 入 直 至 主 动 脉, 再 剪 开 右 心 耳, 灌 注 0. 9% 生 理 盐 水 约 250 ml, 待 肝 脏 颜 色 呈 灰 白 色 且 从 心 脏 流 出 的 液 体 由 红 色 变 成 透 明 清 亮 的 液 体, 可 更 换 4% 多 聚 甲 醛 溶 液 继 续 灌 注 约 300 ml, 时 间 30 分 钟, 待 大 鼠 出 现 四 肢 抽 搐 及 全 身 僵 硬 肝 脏 变 硬 可 停 止 灌 注, 卸 下 弓 形 板, 以 打 击 点 为 中 心, 剥 离 肌 肉 脊 椎 取 出 损 伤 脊 髓 节 段 (T9 鄄 11), 约 1 cm 长, 浸 入 4% 多 聚 甲 醛 溶 液 中 固 定, 待 处 理 将 固 定 好 的 组 织 进 行 常 规 石 蜡 包 埋, 连 续 切 片, 切 片 厚 度 为 4 ~ 5 滋 m, 部 分 切 片 进 行 HE 染 色, 部 分 切 片 进 行 尼 氏 染 色 用 于 Western Blot 的 标 本 造 模 14 天 后 取 上 述 各 组 大 鼠 每 组 6 只,10% 水 合 氯 醛 予 大 鼠 腹 腔 麻 醉, 待 大 鼠 完 全 麻 醉 后, 迅 速 用 手 术 剪 剪 下 大 鼠 损 伤 脊 髓 节 段, 剔 除 肌 肉 与 骨 头, 于 无 菌 工 作 台 冰 盘 上 分 离 出 脊 髓 组 织, 放 入 无 菌 冻 存 管 后 置 于 液 氮 中, 之 后 转 移 至 -80 益 冰 箱 保 存, 待 检 测 1. 4 摇 运 动 功 能 BBB 评 分 综 合 评 定 大 鼠 SCI 后 的 运 动 功 能, 将 大 鼠 后 肢 运 动 分 为 22 个 等 级, 后 肢 全 瘫 为 0 分, 完 全 正 常 为 21 分 包 括 早 期 以 无 或 极 少 的 后 肢 关 节 运 动 为 特 征, 中 期 以 几 次 共 济 失 调 步 态, 晚 期 以 精 细 运 动, 如 拖 着 脚 趾 和 尾 巴, 躯 干 不 稳 定 以 及 爪 子 交 替 轮 转 1. 5 摇 HE 染 色 尼 氏 体 染 色 检 测 HE 染 色 : 石 蜡 切 片 进 行 常 规 脱 蜡 ; 浸 入 苏 木 素 染 色 5 分 钟,1% 盐 酸 酒 精 分 化 5 s, 自 来 水 冲 洗 反 蓝 30 分 钟,0. 5% 伊 红 染 色 5 s, 常 规 脱 水, 透 明, 中 性 树 胶 封 片 尼 氏 染 色 : 石 蜡 切 片 进 行 常 规 脱 蜡 ; 使 用 Solarbio 尼 氏 染 色 试 剂 盒 进 行 Nissol stain 焦 油 紫 法 染 色 1. 6 摇 免 疫 组 化 检 测 常 规 脱 蜡 水 合,PBS 洗 3 次,5 分 钟 / 次 抗 原 修 复 : 用 柠 檬 酸 钠 缓 冲 液 于 微 波 炉 修 复 后, 组 织 切 片 自 然 晾 至 室 温 封 闭 内 源 性 过 氧 化 物 酶 :3% H 2 O 2 室 温 孵 育 10 分 钟 PBS 洗 3 次,5 分 钟 / 次 每 张 切 片 加 50 滋 L 正 常 非 免 疫 血 清, 室 温 孵 育 30 分 钟 一 抗 孵 育 : 将 组 织 切 片 于 稀 释 的 一 抗 溶 液 中 4 益 湿 盒 孵 育 过 夜 PBS 洗 3 次,5 分 钟 / 次 二 抗 孵 育 : 将 组 织 切 片 于 稀 释 的 二 抗 抗 溶 液 中 室 温 湿 盒 孵 育 1 小 时 PBS 洗 3 次,5 分 钟 / 次 DAB 显 色, 室 温 1 ~ 10 分 钟, 显 微 镜 下 掌 控 ddh 2 O 洗 3 次,5 分 钟 / 次 苏 木 素 复 染 1 ~ 10 分 钟,1% 盐 酸 酒 精 分 化, 显 微 镜 下 掌 控 乙 醇 脱 水, 二 甲 苯 透 明, 中 性 树 胶 封 固 1. 7 摇 Western blot 检 测 取 受 损 脊 髓 组 织 研 磨, 提 取 蛋 白, 采 用 Bradford 法 测 定 蛋 白 含 量, 经 10% SDS 凝 胶 电 泳 分 离, 转 移 蛋 白 至 PVDF 印 迹 膜 上 用 5% TBS 鄄 T 脱 脂 奶 粉 封 闭, 加 入 适 当 漂 洗 液 稀 释 的 抗 体 ( 一 抗 浓 度 :NT 鄄 3 为 1 颐 500;Trk C 为 1 颐 1000), 封 口,4 益 孵 育 过 夜 ; 用 大 量 的 TBS 鄄 T 漂 洗 液 洗 膜 3 次, 每 次 10 分 钟, 加 入 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 二 抗, 洗 膜 3 次, 每 次 10 分
摇560 环球中医药 2016 年 5 月第 9 卷第 5 期摇 Global Traditional Chinese Medicine, May 2016,Vol郾 9, No郾 5 钟;将 PVDF 膜放置 ECL 混合液中温育 5 分钟,于暗 经元排列整齐 说明经脉冲电针与音乐电针治疗 IPP 软件对扫描蛋白图象进行灰度分析 优于脉冲电针 见图 1 室压上 X 光片,感光数分钟,显影,保存,扫描 用 1. 8摇 统计学处理 后均可促进脊髓前角神经元形态修复且音乐电针 表 1摇 各组大鼠后肢运动神经行为学评分比较 数据采用统 计 学 软 件 SPSS 20. 0 进 行 统 计 分 呈正态分布,方差齐时运用单因素方差分析,两组 间比较用 LSD 检验;数据非正态分布或方差不齐时 采用非参检验或单因素方差分析 Dunnett爷 s T3 法进 行,以 P<0. 05 为差异有统计学意义的标准 2摇 结果 BBB 评分 组别 析,以均数 依标准差( x 依s) 表示 多组间比较,数据 空白组 A 假手术组 B 模型组 C 脉冲电针组 D 音乐电针组 E 21依0. 00 21依0. 00 3. 58依0. 23 a 6. 25依0. 33 b 6. 67依0. 36 b 注: 与空白组相较, a P<0. 01;与模型组相较, b P<0. 01 2. 3摇 尼氏体染色结果 2. 1摇 运动功能 BBB 评分结果 数据为非正态分布,采用非参数检验,组间比 较采用成对比较方法,结果显示,造模后 14 天,与空 尼氏染色结果显示,空白组脊髓前角神经元所 含尼氏体丰富,且神经细胞形态清晰;假手术组与 白组比较,假手术组 BBB 评分未有变化,说明假手 正常组尼氏体含量无明显差别;模型组神经细胞结 BBB 分值明显减少,经统计学分析,有显著性差异 尼氏体较模型组有所增多,且神经元形态清晰,排 组和音乐电针组的 BBB 分值均有所增加,经统计学 氏体明显增多,说明经脉冲电针与音乐电针均可增 术未破坏 脊 髓; 与 空 白 组 假 手 术 组 比 较, 模 型 组 构破坏,尼氏体明显减少;脉冲电针组神经元所含 ( P<0. 01),说明造模成功;与模型组比较,脉冲电针 列致密;音乐电针组较脉冲电针组神经元中所含尼 分析,有极显著性差异( P <0. 01),说明脉冲电针与 加脊髓前角神经元中所含尼氏体的数量,且音乐电 音乐电针疗法均能改善脊髓损伤大鼠后肢运动功 能;与脉冲电针组相较,音乐电针组仅 BBB 分值增 加,但无统计学意义 见表 1 针组优于脉冲电针组 见图 2 2. 4摇 免疫组化检测结果 免疫组 化 结 果 显 示 MEK2 与 p鄄erk1 在 空 白 组的脊髓前 脚 神 经 元 细 胞 中 含 量 较 多,且 表 达 于 2. 2摇 HE 染色结果 HE 染色结果显示,空白组脊髓前脚神经元形 态结构清晰,排列紧密;假手术组神经元形态结构 清晰,可显现炎性细胞;模型组神经元缺失明显,边 界不清晰;脉冲电针组神经元数目较模型组数目增 多,且结构较为清晰;音乐电针组较脉冲电针组神 胞浆中;假手术组次之;模型组二者表达均较空白 组与模型组增加;脉冲电针组与音乐电针组 MEK p鄄erk 的表达 均 较 模 型 组 明 显 增 多, 且 音 乐 电 针 MEK p鄄erk 的 含 量 高 于 脉 冲 电 针 组 见 图 3 图 4 图 1摇 各组大鼠损伤脊髓 HE 染色图片( 伊400) 图 2摇 各组大鼠损伤脊髓尼氏染色图片( 伊400)
环球中医药 2016 年 5 月第 9 卷第 5 期摇 Global Traditional Chinese Medicine, May 2016,Vol郾 9, No郾 5 摇561 图 3摇 各组大鼠脊髓损伤 MEK2 图片( 伊400) 2. 5摇 Western blot 检测结果 图 4摇 各组大鼠脊髓损伤 p鄄erk1 图片( 伊400) 与空 白 组 假 手 术 组 相 比 较, 模 型 组 MEK2 p鄄erk1表达增加,但经统计学分析,无显著性差异 3摇 讨论 中医康复学认为,SCI 的病机属本虚标实,本虚 (P>0. 05) ;方差齐用单因素方差分析统计,组间用 为肝肾亏虚,标实是指瘀血和痰浊阻滞经络,SCI 的 冲电针组与音乐电针组的 MEK2 p鄄erk1 有明显升 性质主要是经络瘀阻 阳气不足 临床证型主要为 LSD 多重比较方法,结果显示,与模型组相比较,脉 病位在督脉,阻滞于督脉,累及肾 脾 肺 肝,病理 高趋势,但经统计学分析,差异不显著( P>0. 05) ;方 肝 肾 亏 虚 与 痰 瘀 阻 络, 病 机 是 督 脉 损 伤, 肾 阳 结果显示,脉冲电针组与音乐电针组比较,MEK2 尽管脊髓损伤在脊柱,但主要损及督脉 督脉 差不齐用非参数检验统计,组间用成对比较方法, 不足 [10] p鄄erk1表达趋势 较 一 致, 两 者 有 明 显 统 计 学 差 异 总督周身之阳经与脊髓重合,有统摄元阳 振奋全 表 2摇 各组大鼠受损脊髓组织 MEK2 可调节全 身 气 血, 在 全 身 经 络 系 统 中 处 于 主 导 地 ( P>0. 05) 见表 2 图 5 p鄄erk1 相对灰度值比较 组别 MEK2 p鄄erk1 空白组 A 1. 61依0. 69 1. 72依0. 59 模型组 C 2. 32依0. 95 2. 68依0. 18 假手术组 B 脉冲电针组 D 音乐电针组 E 1. 64依0. 60 2. 99依1. 31 3. 09依1. 21 身阳经的功能,且督脉与任 冲 阳维脉皆有联系, 位,与现代医学所描述的脊髓作为中枢神经的功能 相类似 [11] 主要选取 大椎冶 命门冶 二穴,旨在疏 通督脉,温肾壮阳,活血化瘀,使阳气通达全身,使 1. 94依0. 29 精血养四末而恢复机体各部功能 2. 72依0. 26 针刺治疗的基础上通以伏打电池所产生的电流刺 3. 36依1. 12 电针治疗 SCI 有着 简 便 廉 验冶 的特点,在 激可能会增强其治疗作用 [12],且对于恢复患者功能 效果确切 督脉电针可以改善损伤局部组织的血 液微循环,且又能促进脑脊液流动,减轻部位的水 肿和血肿的压迫及黏连,从而扼制脊髓继发性损伤 的进行 [13] 音乐电针疗法是音乐 电疗 针灸三位一体之 新型的理疗方法,具有欣赏性和娱乐性,可调节内 脏生理活动,消除病理情绪,平衡心理状态 [14],音乐 电针疗法的优势是身体不容易产生耐受性;低 中 频多波混合电流;多种选择性音乐电疗将传统医学 注:A 空白组;B 假手术组;C 模型组;D 脉冲电针组;E 音乐电针组 与现代科学技术结合,以声和电两种物理因子同时 图 5摇 各组大鼠受损脊髓组织 MEK2 p鄄erk1 表达情况 作用于人体耳和经穴的一种新颖的非药物的自然
摇 562 环 球 中 医 药 2016 年 5 月 第 9 卷 第 5 期 摇 Global Traditional Chinese Medicine, May 2016,Vol 郾 9, No 郾 5 疗 法 [15] 细 胞 外 信 号 通 路 系 统 在 脊 髓 损 伤 的 发 病 中 起 到 关 键 性 作 用 细 胞 外 调 节 蛋 白 激 酶 ( extracellular regulated protein kinases,erk) 又 被 称 为 p44/ 42MAPK, 是 MAPK 超 家 族 中 的 重 要 成 员 [16] MEK / ERK 信 号 通 路 是 将 细 胞 外 刺 激 信 号 传 导 至 细 胞 内 并 调 控 其 他 基 因 表 达 的 重 要 通 路 之 一, 细 胞 外 信 号 作 用 于 细 胞 表 面 受 体 [17], 活 化 蛋 白 激 酶 的 激 酶 MEK, 能 够 磷 酸 化 并 激 活 下 游 的 ERK [18], ERK 是 已 知 MEK 的 唯 一 底 物, 也 是 MEK 磷 酸 化 的 唯 一 触 点,ERK 通 路 是 由 Ras Raf MEK ERK 组 成 的 一 条 三 级 级 联 反 应 通 路, 参 与 了 细 胞 的 生 长 增 殖 分 化 和 凋 亡, 与 多 种 疾 病 的 发 生 有 关 [19] 研 究 表 明 丝 裂 原 通 路 对 神 经 前 体 细 胞 的 生 成 神 经 脊 的 形 成 和 发 育 突 触 信 号 传 递, 以 及 意 识 学 习 和 记 忆 能 力 的 形 成 有 重 要 作 用, 从 而 促 进 神 经 细 胞 死 亡 参 与 脊 髓 损 伤 修 复 的 过 程 [20] 从 本 实 验 结 果 来 看, 两 组 电 针 治 疗 组 大 鼠 BBB 评 分 高 于 同 一 时 间 段 上 的 模 型 组 大 鼠 的 行 为 学 评 分, 表 明 接 受 了 脉 冲 电 针 与 音 乐 电 针 治 疗 后 的 SCI 大 鼠 后 肢 运 动 功 能 得 到 改 善, 且 两 组 电 针 治 疗 组 大 鼠 神 经 元 恢 复 较 模 型 组 明 显 而 MEK2 p 鄄 ERK1 的 表 达, 模 型 组 较 空 白 组 与 假 手 术 组 都 有 增 加 的 趋 势, 两 组 电 针 治 疗 组 MEK2 p 鄄 ERK1 增 加 的 趋 势 更 为 显 著, 但 均 无 统 计 学 差 异, 说 明 大 鼠 在 SCI 后 14 天 受 损 脊 髓 有 自 愈 倾 向, 而 电 针 可 以 加 速 受 损 脊 髓 的 修 复, 尽 管 在 分 子 生 物 学 检 测 结 果 上 未 见 统 计 学 [21] 差 异 刁 利 红 等 研 究 发 现, 电 针 任 脉 的 穴 位 可 增 [22] 加 MEK2 水 平, 罗 文 舒 等 研 究 发 现, 电 针 督 脉 穴 位 后,p 鄄 ERK1 的 表 达 有 所 增 加 结 合 BBB 评 分 与 尼 氏 染 色 结 果 分 析, 笔 者 推 测 受 损 脊 髓 的 修 复 与 MEK2 p 鄄 ERK1 的 表 达 增 加 有 关 综 上 所 述, 脉 冲 电 针 与 音 乐 电 针 的 治 疗 可 诱 导 SCI 大 鼠 受 损 脊 髓 MEK2 p 鄄 ERK1 的 表 达, 促 进 SCI 大 鼠 运 动 功 能 恢 复, 改 善 脊 髓 前 角 神 经 元 形 态 结 构, 为 电 针 治 疗 脊 髓 损 伤 后 神 经 重 建 修 复 提 供 了 新 的 实 验 依 据 由 于 本 研 究 音 乐 电 针 在 治 疗 时 间 上 疗 程 相 对 较 短, 样 本 量 相 对 较 少, 未 能 体 现 出 其 明 显 的 优 势, 与 脉 冲 电 针 在 诱 导 SCI 大 鼠 受 损 脊 髓 MEK2 p 鄄 ERK1 的 表 达 上 无 明 显 差 异, 这 有 待 笔 者 后 期 实 验 深 入 研 究 参 考 文 献 [1] 摇 李 波 霖, 周 宾 宾, 张 鸿 升, 等. 电 针 治 疗 脊 髓 损 伤 后 神 经 源 性 膀 胱 功 能 障 碍 动 物 实 验 研 究 进 展 [ J]. 甘 肃 中 医 学 院 学 报, 2015,32(3):63 鄄 65. [2] 摇 李 波 霖, 周 宾 宾, 金 昕. 电 针 刺 激 不 同 穴 位 治 疗 脊 髓 损 伤 机 制 实 验 研 究 进 展 [J]. 针 灸 临 床 杂 志, 2015,31(5):75 鄄 78. [3] 摇 熊 楚 梅, 范 顾, 宋 玉 兰. 康 复 期 脊 髓 损 伤 患 者 自 我 护 理 的 研 究 进 展 与 对 策 思 考 [J]. 实 用 临 床 医 药 杂 志, 2015,19(10): 176 鄄 178. [4] 摇 杨 凤 翔, 王 成 秀, 李 娜, 等. 脊 髓 损 伤 后 神 经 源 性 膀 胱 的 康 复 研 究 进 展 [J]. 华 西 医 学, 2015,30(2):389 鄄 392. [5] 摇 樊 帆, 汤 爱 玲, 叶 文 琴. 脊 髓 损 伤 病 人 神 经 源 性 膀 胱 功 能 评 估 及 分 类 研 究 进 展 [J]. 护 理 研 究, 2015,29(1):8 鄄 11. [6] 摇 任 怡 雯. 创 伤 性 截 瘫 患 者 功 能 锻 炼 依 从 性 研 究 进 展 [ J]. 临 床 护 理 杂 志, 2015,14(2):55 鄄 58. [7] 摇 黄 卫, 李 新 志, 卢 国 强, 等. 急 性 脊 髓 损 伤 的 治 疗 现 状 和 研 究 进 展 [J]. 中 外 医 疗, 2015,(3):197 鄄 198. [8] 摇 宋 萌, 王 远 征, 时 素 华, 等. 督 脉 电 针 对 大 鼠 急 性 脊 髓 损 伤 6h 后 Nestin 表 达 的 实 验 研 究 [J]. 首 都 医 药,2013,20(2):52 鄄 54. [9] 摇 李 晓 雷, 张 缙. 音 乐 电 针 对 慢 性 运 动 疲 劳 大 鼠 乳 酸 超 氧 化 歧 化 酶 丙 二 醛 的 影 响 [ D]. 哈 尔 滨 : 黑 龙 江 省 中 医 研 究 院,2011. [10] 摇 刘 金 辉, 易 满. 脊 髓 损 伤 中 医 病 因 病 机 及 认 识 [ J]. 新 疆 中 医 药, 2014,32(5):116 鄄 119. [11] 摇 时 素 华, 李 志 刚, 秦 丽 娜, 等. 脊 髓 损 伤 相 关 信 号 通 路 及 中 医 药 治 疗 研 究 [J]. 北 京 中 医 药, 2014,33(4):308 鄄 310. [12] 摇 刘 堂 义, 杨 华 元, 蒯 乐, 等. 单 穴 电 针 仪 的 研 制 及 其 意 义 [J]. 辽 宁 中 医 杂 志, 2010,37(2):241 鄄 243. [13] 摇 张 秦 宏. 电 针 对 大 鼠 急 性 脊 髓 损 伤 后 胶 质 纤 维 酸 性 蛋 白 表 达 影 响 的 实 验 研 究 [D]. 哈 尔 滨 : 黑 龙 江 中 医 药 大 学,2008. [14] 摇 滕 金 艳. 不 同 电 针 对 抑 郁 症 胃 肠 道 躯 体 症 状 的 临 床 观 察 及 实 验 研 究 [D]. 北 京 : 北 京 中 医 药 大 学,2013. [15] 摇 邓 晓 丰. 不 同 电 针 对 慢 性 应 激 大 鼠 海 马 和 血 清 中 IL 鄄 1 茁 IL 鄄 6 表 达 的 影 响 [D]. 北 京 : 北 京 中 医 药 大 学,2013. [16] 摇 时 素 华, 李 志 刚, 宋 金 玲, 等. 电 针 对 大 鼠 脊 髓 损 伤 后 notch1 ps1 表 达 的 实 验 研 究 [ J]. 北 京 中 医 药 大 学 学 报, 2011,34(10):714 鄄 717+720. [17] 摇 林 斌, 沈 忠 美, 鄢 妘. MEK 抑 制 剂 对 脊 髓 损 伤 后 胶 质 瘢 痕 形 成 的 影 响 [ J ]. 中 国 脊 柱 脊 髓 杂 志, 2012, 22 ( 12 ): 1102 鄄 1107. [18] 摇 关 永 格, 何 昱 雯, 李 坤 寅, 等. 芍 药 甘 草 汤 对 子 宫 腺 肌 病 细 胞 Ras Raf MEK 鄄 2 的 影 响 [ J]. 辽 宁 中 医 杂 志, 2014,41 (7):1530 鄄 1532. [19] 摇 李 鑫, 朱 文 浩, 高 颖. ERK1 / 2 通 路 及 其 介 导 多 发 性 硬 化 发 病 的 研 究 进 展 [ J]. 世 界 科 学 技 术 鄄 中 医 药 现 代 化, 2015,17 (4):880 鄄 884. [20] 摇 曹 富 江. Raf / Erk1 / 2 / Merk 信 号 传 导 通 路 在 脊 髓 损 伤 修 复 中 的 病 理 机 制 研 究 [D]. 天 津 : 天 津 医 科 大 学,2013. [21] 摇 刁 利 红, 罗 文 舒, 王 玲, 等. 电 针 任 脉 经 穴 对 局 灶 性 脑 缺 血 大 鼠 ERK1 / 2 表 达 的 影 响 [ C] / / 广 东 省 针 灸 学 会 第 十 次 学 术 交 流 会 论 文 汇 编. 2007:195 鄄 199. [22] 摇 罗 文 舒, 杨 卓 欣, 于 海 波, 等. 电 针 任 督 脉 经 穴 对 脑 缺 血 大 鼠 侧 脑 室 下 区 ERK 通 路 的 影 响 [ J]. 中 医 药 导 报, 2008,14 (5):3 鄄 5. ( 收 稿 日 期 : 2015 鄄 07 鄄 29) ( 本 文 编 辑 : 蒲 晓 田 )