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中 国 农 业 大 学 学 报 1999, 4(3): 109~113 Journal of China Agricultural University 小 鼠 桑 棍 胚 玻 璃 化 冷 冻 前 后 生 物 频 谱 处 理 对 体 外 发 青 的 影 晌 1 朱 士 恩 2 王 海 彦 曾 申 明 王 永 胜 张 忠 诚 ( 中 国 农 业 大 学 动 物 科 技 学 院 ) 周 林 陈 银 ( 北 京 周 林 频 谱 公 司 ) 摘 要 本 试 验 利 用 周 林 频 谱 仪 (WS-302) 照 射 玻 璃 化 冷 冻 前 后 小 鼠 桑 梅 胚, 研 究 对 其 体 外 发 育 的 影 响, 结 果 表 明 : 胚 胎 在 10%EG 溶 液 中 处 理 5 min 后 移 入 EFS30 中 处 理 mm 的 二 步 法 冷 冻 组, 解 冻 后 经 照 射 5~ 20 min 后 的 胚 胎 发 育 率 (95%~100%) 与 对 照 组 (94%) 比 较 元 显 著 性 差 异 (P>O.O 日 当 在 EFS40 中 处 理 1 min 的 一 步 法 冷 冻 组 的 胚 胎, 照 射 后 发 育 率 由 对 照 组 的 54% 提 高 到 97% 差 异 极 显 著 (P<O.0 1) 改 用 GFS40 一 步 法 冷 冻 的 胚 胎 照 射 后 的 发 育 率 也 明 显 高 于 对 照 组 (P<0.05) 另 外, 对 冷 冻 前 胚 胎 进 行 照 射, 其 解 冻 后 发 育 率 (87%) 也 得 到 了 显 著 提 高 (P<O.0 1) 关 键 词 分 类 号 S814. 6 生 物 谱 ; 玻 璃 化 ; 冷 冻 ; 桑 榷 胚 ; 小 鼠 Effect of Bio-Frequency Spectrum on Development of MouseVitrified Morulae in vitro Zhu Shi'en Wang Haiyan Zeng Shenming Wang Yongsheng Zhang Zhongcheng CCoi1ege of Animal Science &. Technology, CAU) Abstract Zhou Lin Chen K un CBeijing Zhoulin Bio-Frequency Company) This experiment was to study the developmental ability of mouse morulae which were irradiated by Zhoulin Bio-Frequency Spectrum Generator (WS-302) before or after being frozen. Mouse morulae were pretreated in 10% EG for 5 min, then pipetted into EFS40 for another 1 min treatment and plunged into LN 2 (two-step) for storage. After thawing the embryos were irradiated by WS-302 for 5 ~ 20 min. The rate of development was 95 % ~ 100% in vitro culture, which was not differ from the control(94%) group(p>o. 05). How ever,mouse morulae were frozen only in EFS40 for 1 min (one-step),the ra te of development was 97 % after the thawed embryos were irradiated by WS-302 and the control was 54%, the difference was greatly significant(p<o. 01). When the morulae were vitrified in GFS40, the developmental rate was signicantly higher than the control (P< o. 05) after the thawed embryos were irradiated by WS-302. The developmental rate was also significantly higher than the control when mouse morulae were irradiated by WS-302 before freezing (P<O. 01). Key words bio-frequency spectrum; vitrification; frozen; morulae; mouse 收 稿 日 期 1997-09-01 1 本 试 验 为 周 林 频 谱 公 司 资 助 项 目 2 朱 士 恩, 北 京 圆 明 园 西 路 2 号 中 国 农 业 大 学 ( 西 校 区 ), 100094

110 中 国 农 业 大 学 学 报 1999 年 生 物 谱 Cbio-frequenQY spectrum) 是 生 物 自 身 物 理 信 息 的 电 磁 波 表 征, 实 验 证 明 生 物 体 自 身 是 一 个 天 然 的 能 向 周 围 空 间 发 射 多 种 信 号 的 生 物 辐 射 源 [IJ 根 据 物 理 学 原 理, 在 一 定 条 件 下 当 2 种 物 理 信 号 相 同 或 相 近 时 能 引 起 谐 振, 产 生 最 大 的 吸 收 传 统 的 电 磁 波 理 疗 仪 器 大 都 只 是 机 体 向 外 辐 射 特 性 的 较 窄 或 单 一 谱 段, 周 林 生 物 频 谱 仪 所 产 生 的 辐 射 波 具 有 宽 频 带 特 性, 峰 值 在 3. 6~6μm 之 间, 主 能 量 分 布 在 峰 值 波 长 附 近, 且 延 续 呈 远 红 外 亚 毫 米 波 以 及 毫 米 波 [2J 由 它 所 发 射 的 信 号 可 引 起 机 体 产 生 内 热 效 应, 并 导 致 细 胞 通 透 性, 胶 体 状 态, 生 物 电, 酸 碱 度 和 酶 系 统 的 改 变, 形 成 生 物 活 性 物 质 组 织 股 和 乙 眈 胆 碱 等, 可 使 新 陈 代 谢 旺 盛, 生 物 组 织 营 养 改 善, 组 织 再 生 能 力 加 强, 功 能 恢 复 加 快 [I, 3J 目 前 用 频 谱 辐 射 哺 乳 动 物 胚 胎, 缓 解 和 修 复 冻 伤 的 试 验 尚 属 首 次, 类 似 试 验 在 国 内 外 未 见 报 道 为 此, 本 试 验 用 乙 二 醇 和 丙 三 醇 为 主 体 抗 冻 保 护 剂 配 制 成 各 种 玻 璃 化 溶 液, 分 别 对 冷 冻 解 冻 后 小 鼠 桑 植 胚 进 行 照 射, 探 讨 生 物 谱 对 哺 乳 动 物 玻 璃 化 冷 冻 后 胚 胎 的 冻 伤 恢 复 效 果, 同 时 也 对 玻 璃 化 冷 冻 方 法 作 进 一 步 探 讨 和 完 善 1 材 料 和 方 法 1. 1 材 料 实 验 动 物 为 5~6 周 龄 的 昆 明 白 系 小 鼠 ( 中 国 科 学 院 动 物 遗 传 研 究 所 ) 周 林 生 物 频 谱 仪 为 WS-302 型 便 携 式 频 谱 议 ( 深 圳 周 林 频 谱 有 限 公 司 ) 冲 卵 液 为 mpbs 溶 液 问 预 处 理 液 用 10% 乙 二 醇 CEthylene glycol, EG) 溶 液 将 30% 聚 蔚 糖 和 0.5rriol.L- 1 蔚 糖 用 PBS 液 洛 解 泪 合 后, 制 成 FS 溶 液 FS 溶 液 再 与 乙 二 醇 CEthylene glycol) 溶 液 或 丙 三 醇 CGlycerol) 按 一 定 比 例 配 制 成 EFS30, EFS40 及 GFS40 玻 璃 化 溶 液 ( 表 1) 胚 胎 培 养 液 为 mkrb 溶 液 囚 1. 2 实 验 方 法 1. 2. 1 小 鼠 超 数 排 卵 5~6 周 龄 昆 明 白 系 雌 性 小 鼠, 自 然 光 照, 自 由 采 食, 经 适 应 饲 养 7 d 后, 分 别 用 10IU 的 孕 马 血 清 促 性 腺 激 素 CPMSG: 天 津 实 验 动 物 中 心 ) 和 人 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 ChCG: 宁 波 市 激 素 制 品 厂 ), 经 隔 日 腹 腔 表 1 玻 璃 化 冷 冻 液 配 制 玻 璃 化 溶 液 抗 冻 保 护 剂 稀 释 液 体 积 比 例 EFS30 乙 二 醇 Cethylene glycod FS 液 骨 3 : 7 EFS40 乙 二 醇 Cethylene glycod FS 液 4 : 6 GFS40 丙 三 醇 Cglycerol) FS 液 4 : 6 祷 FS 液 r 将 含 量 为 30% 聚 煎 糖 与 0.5 mo!.l-l 胖 糖 洛 于 PBS 溶 液 中 内 注 射 后 与 同 系 性 成 熟 公 鼠 交 配, 交 配 后 有 阴 道 栓 小 鼠 于 hcg 注 射 后 78~80 h 将 子 宫 摘 出, 用 mpbs 液 冲 洗 子 宫 内 容 物, 于 实 体 显 微 镜 下 回 收 致 密 桑 堪 胚 1. 2. 2 胚 胎 玻 璃 化 冷 冻 一 步 法 冷 冻 保 存 将 室 温 调 至 20~25'C, 而 后 用 吸 管 将 胚 胎 直 接 移 入 事 先 装 好 玻 璃 化 溶 液 的 0.25 冷 冻 保 存 ml 塑 料 细 管 内, 1~2 min 处 理 后 封 口, 即 投 入 液 氮 中 一 步 法 二 步 法 冷 冻 保 存 胚 胎 移 入 细 管 前, 首 先 在 10%EG 预 处 理 溶 液 中 夺 衡 5 minc 预 先 处 理 ) 以 后 同 一 步 法 1. 2. 3 解 冻 冷 冻 细 管 由 液 氮 中 取 出 后 直 接 投 入 20~25'C 水 中 解 冻, 用 0.5 mol.l 一 1 煎 糖 榕 液 0.8 ml 冲 洗 细 管 内 容 物 于 表 面 皿 中, 在 实 体 显 微 镜 下 收 集 胚 胎 收 集 的 胚 胎 移 入 新 鲜 的 0.5 mol.l- 1 蔚 糖 滴 中 脱 出 抗 冻 剂, 再 用 mpbs 液 洗 净 后 移 入 mkrb 液 中 待 照 射 1. 2. 4 周 林 生 物 频 谱 照 射 在 培 养 皿 中 作 成 400μL 的 mkrb 液 滴, 液 滴 周 围 稍 加 液 体 石

第 3 期 朱 士 恩 等 : 小 鼠 桑 榕 胚 玻 璃 化 冷 冻 前 后 生 物 频 谱 处 理 对 体 外 发 育 的 影 响 111 蜡 固 定 将 冷 冻 前 和 解 冻 后 的 胚 胎 分 别 导 人 mkrb 滴 中, 将 一 直 径 为 60~90 mm 的 玻 璃 平 皿 内 添 加 适 量 的 水, 然 后 放 置 于 38"C 的 衡 温 水 浴 箱 中 的 试 管 架 上, 再 将 含 有 胚 胎 的 培 养 皿 置 于 玻 璃 平 皿 中, 注 意 不 要 淹 没 培 养 皿 而 后 用 预 热 后 的 周 林 频 谱 仪 ( 强 档, 功 率 12 W; 频 率 50~ 60 Hz) 照 射 照 射 高 度 为 15 cm, 照 射 时 间 为 0, 5, 10, 15 及 20 min 1. 2. 5 胚 胎 的 体 外 发 育 性 观 察 胚 胎 对 照 组 及 实 验 组 用 培 养 液 洗 净, 移 入 于 CO z 培 养 箱 中 经 平 衡 12 h 后 的 mkrb 培 养 液 中 000 μl' 滴 -1, 培 养 10 枚 胚 胎 ), 置 于 5%C0 2' 95% 空 气 和 100% 相 对 湿 度, 温 度 为 38"C 培 养 箱 中 培 养 每 小 时 镜 下 观 察 胚 胎 发 育 情 况 凡 发 育 至 囊 胚 阶 段 的 胚 胎 视 为 发 育 性 胚 胎 1.2.6 统 计 分 析 胚 胎 发 育 率 的 比 较 采 用 卡 方 (X z ) 检 验 2 结 果 2.1 玻 璃 化 冷 冻 前 的 胚 胎 经 周 林 生 物 频 谱 照 射 后 的 发 盲 率 冷 冻 前 对 新 鲜 胚 胎 进 行 频 谱 照 射, 照 射 高 度 为 15 cm, 照 射 时 间 分 别 为 5, 10, 15 min, 冷 冻 解 冻 后 的 发 育 率 分 别 为 87%, 83% 和 53%( 表 2); 与 不 加 照 射 的 对 照 组 (54%) 相 比, 5~ 10 min 组 的 囊 胚 发 育 率 得 到 了 显 著 提 高 (P<O.0 1) 表 2 周 林 频 谱 照 射 1 对 用 EFS( 或 GFS) 一 步 法 玻 璃 化 冷 冻 前 后 小 鼠 桑 榷 胚 发 育 率 的 影 响 照 射 处 理 冷 冻 温 度 冷 冻 时 间 照 射 时 间 冷 冻 液 /"C t/min t/min 发 育 胚 数 / 照 射 胚 数 (.% ) 冷 冻 前 20 EFS40 1 19/35(54) 5 27/31 (8 7) 祷 关 10 29/35(83) 传 15 19/36(53) 冷 冻 后 20 EFS40 1 19/35(54) 5 29/30(9 7) 替 铃 10 52/65(80) 奖 15 50/64 (7 8) 祷 EFS40 2 O 53/94(56) 5 28/40(70) 10 20/39(51) 15 30/34(88) 祷 20 GFS40 1 19/33(58) 5 32/37(86) 替 GFS40 2 22/34(70) 5 38/42(90) 祷 1 照 射 高 度 为 15 cm, 功 率 为 12 W. 表 3 同,2 对 照 组 ( 不 加 照 射 ). 表 3 同. 势 与 对 照 组 比 较 差 异 显 著 (P<O. 05); 赞 祷 与 对 照 组 比 较 差 异 极 显 著 CP<O.0 1). 2.2 一 步 法 玻 璃 化 冷 冻 胚 胎 经 周 林 生 物 频 i 普 照 射 后 的 发 盲 率 1 20"C 室 温 条 件 下, EFS40 中 经 1~2 min 处 理 后 冷 冻 保 存 的 胚 胎, 解 冻 后 进 行 照 射, 照 射

112 中 国 农 业 大 学 学 报 1999 年 高 度 为 15 cm, 照 射 时 间 为 5, 10, 15 min 结 果 1 min 冷 冻 组 的 囊 胚 发 育 率 为 97(P<0. 01), 80% (P<O. 05) 及 78% (P<O. 05) ( 表 2) 与 对 照 组 的 囊 胚 发 育 率 (54%) 相 比 均 有 显 著 性 差 异 而 2 min 冷 冻 组, 只 有 照 射 15 min 后 经 培 养 的 囊 胚 发 育 率 显 著 提 高 (88%), 与 对 照 组 (56%) 相 比 差 异 极 显 著 (P<O.0 1) 2 20'C 条 件 下, 用 GFS40 处 理 1~2 min 后 冷 冻 组 的 胚 胎, 解 冻 后 照 射 高 度 不 变, 照 射 时 间 为 5 min, 2 组 胚 胎 的 囊 胚 发 育 率 为 86% 和 90%( 表 2) 与 对 照 组 的 58% 和 70% 相 比 差 异 显 著 (P<O.O 日 2.3 二 步 法 玻 璃 化 冷 冻 胚 胎 经 周 林 生 物 频 i 曾 照 射 后 的 发 盲 率 二 步 法 冷 冻 即 25'C 室 温 下, 用 10%EG 平 衡 5 min 后, 移 入 EFS30 玻 璃 化 榕 液 中 处 理 1 min 投 入 液 氮 中 冷 冻 保 存 解 冻 后 的 胚 胎 在 照 射 高 度 15 cm; 照 射 时 间 为 5, 10, 20 min, 培 养 后 的 囊 胚 发 言 率 分 别 为 98%, 100% 及 95%( 表 3) 与 不 加 照 射 的 对 照 组 的 囊 胚 发 育 率 (94%) 相 比 元 显 著 性 差 异 (P>0.05) 而 20'C 室 温 下, 用 EFS40 二 步 法 冷 冻 保 存 的 胚 胎, 解 冻 后 经 照 射 结 果, 与 对 照 组 也 无 显 著 性 差 异 (89% 和 94%)(P>0.0 日 表 3 周 林 生 物 频 谱 照 射 对 用 EFS 二 步 法 玻 璃 化 冷 冻 小 鼠 桑 堪 胚 发 育 率 的 影 响 冷 冻 温 度 rc 第 一 步 第 二 步 预 处 理 液 t/min 冷 冻 液 t/min 照 射 时 间 发 育 胚 数 / t/min 照 射 胚 数 <%)1 25 10%EG 5 EFS30 1 O 45/48(94) 5 48/49(98) 10 41/41(00) 20 38/40(95) 20 10%EG 5 EFS40 1 O 39/44(89) 5 34/38(89) 1 试 验 组 与 对 照 组 比 较 无 显 著 性 差 异 (P>O.O 日 3 讨 论 1 本 试 验 按 照 Kasai 等 阳 和 Zhu 等 的 的 胚 胎 玻 璃 化 冷 冻 方 法 对 小 鼠 致 密 桑 榷 胚 进 行 冷 冻 特 别 是 二 步 法 冷 冻 保 存 的 胚 胎, 其 囊 胚 发 育 率 较 高 (89%~94%), 与 前 作 者 [7J 的 结 果 相 一 致 但 一 步 法 冷 冻 的 胚 胎 解 冻 后 的 发 育 率 明 显 低 于 前 作 者 [ 的 小 鼠 的 品 种 不 同 其 胚 胎 冷 冻 后 的 发 育 率 也 不 尽 相 同 [ 础 本 试 验 使 用 的 小 鼠 为 昆 明 白 系, 而 Kasai 等 使 用 的 是 ICR 系 小 鼠 可 能 是 品 系 的 不 同, 造 成 胚 胎 的 抗 冻 效 果 不 同 2 周 林 频 谱 对 冷 冻 前 小 鼠 桑 植 胚 进 行 照 射 后 再 冷 冻, 其 解 冻 后 的 发 育 率 与 不 加 照 射 的 对 照 组 相 比, 照 射 5~10 min 明 显 高 于 对 照 组 (87%, 83% : 54%)(P<0. 01, P<0. 05)( 表 2) 证 明 频 谱 照 射 完 整 无 损 的 新 鲜 胚, 可 增 加 其 抗 冻 效 果 3 20'C 室 温 下, 用 EFS40 一 步 法 冷 冻 保 存 的 胚 胎, 解 冻 后 囊 胚 发 育 率 在 54%~56% 之 间, 这 可 能 是 冷 冻 时 受 高 浓 度 的 抗 冻 保 护 剂 化 学 毒 性 作 用 和 急 速 降 温 及 解 冻 时 的 快 速 升 温, 使 透

第 3 期 朱 士 恩 等 : 小 鼠 桑 摆 胚 玻 璃 化 冷 冻 前 后 生 物 频 谱 处 理 对 体 外 发 育 的 影 响 113 明 带 或 胚 胎 部 分 细 胞 受 损, 容 易 产 生 不 可 逆 的 恢 复 [ 川 lj 基 于 这 种 情 况, 本 试 验 利 用 周 林 生 物 频 谱 仪 (WS-302), 对 解 冻 后 的 胚 胎 进 行 照 射 照 射 高 度 规 定 为 15 cm 是 根 据 王 永 胜 等 [3J 摸 索 出 的 最 佳 高 度, 经 5, 10, 15 min 照 射 后 培 养, 使 囊 胚 发 育 率 由 对 照 组 的 54% 提 高 到 97%, 差 异 极 显 著 (P<O.0 1)( 表 2) 这 种 效 果 的 产 生, 可 能 来 源 于 生 物 频 谱 照 射 后, 胚 胎 新 陈 代 谢 加 强, 营 养 得 到 改 善, 增 进 了 组 织 恢 复 和 再 生 功 能 口 气 4 用 丙 三 醇 代 替 乙 二 醇 配 制 成 的 GFS40 玻 璃 化 溶 液, 在 20'C 的 室 温 下, 对 胚 胎 步 法 冷 冻 保 存, 解 冻 后 只 照 射 5 min, 囊 胚 发 育 率 也 显 著 高 于 对 照 组 (P<O. 05) ( 表 2) 更 进 一 步 证 实 了 生 物 频 谱 对 玻 璃 化 冷 冻 胚 胎 受 损 后 的 代 偿 和 恢 复 有 促 进 作 用 5 20'C 或 25'C 室 温 下, 二 步 法 玻 璃 化 冷 冻 保 存 的 胚 胎, 解 冻 后 胚 胎 不 加 照 射, 培 养 后 的 囊 胚 发 育 率 高 达 94% 阳, 生 物 频 谱 照 射 后 虽 有 一 些 提 高 (89%~100%), 但 是 元 显 著 差 异 (P> O. 05) ( 表 3) 6 周 林 频 谱 对 冷 冻 前 小 鼠 桑 檀 胚 进 行 照 射, 解 冻 后 囊 胚 发 育 率 比 对 照 组 得 到 了 明 显 的 提 高 而 冷 冻 解 冻 后 的 胚 胎 经 照 射 后, 囊 胚 发 育 率 高 于 冻 前 照 射 组 说 明 周 林 频 谱 照 射 用 于 冻 伤 胚 胎 的 恢 复 其 效 果 更 明 显 参 考 文 献 I 陈 锦. 模 拟 人 体 频 谱 特 性 及 作 用 探 讨. 第 二 届 全 国 生 物 频 谱 研 讨 会 论 文 集, 1992, 1~5 2 周 林. 生 物 频 谱 概 述. 第 二 届 全 国 生 物 频 谱 研 讨 会 论 文 集, 1992, 1 ~ N 3 王 永 胜, 左 琴, 朱 士 恩, 张 忠 诚, 陈 锦. 周 林 生 物 频 谱 对 家 兔 胚 胎 发 育 影 响 的 初 步 研 究. 中 国 畜 牧 杂 志, 1997, 34: 6~8 4 Whittingham D G. Survival of mouse embryos after freezing and thawing. London Nature, 1971, 233: 125 ~126 5 Toyoda y, Chang M C. Fertilization of rat eggs in vitro by epididymal spermatozoa and the development of eggs following transfer. J Reprod Fert, 1974, 36:9~12 6 Ka'sai M,Komi J H, Takakamo A, 吏 sudera H,Sakurai T,Machida T. A simple method for mouse embryo cryopreservation in a low toxicity v'itrification solution, without appreciable loss of viability..j Reprod Fert, 1990,89: 91 ~97 7 Zhu S E, Kasai M, Otoge H, Sakurai T, Mac.1:tida T. Cryopreservation of expanded mouse blastocysts by vitrification in ethylene glycol-based solutions.. J Reprod Fert, 1993, 98: 139~ l45 8 Yokoyama M. Freeze Preservation of Mouse Embryos: with Reference to Strain Differences. J Mamm Ova Res, 1989, 6:19~22 9 朱 士 恩, 张 忠 诚, 李 玉 欣, 曾 申 明. 小 鼠 桑 梅 胚 简 易 玻 璃 化 冷 冻 技 术 再 探 讨. 中 国 畜 牧 杂 志, 1997, 33:14~17 10 Dobrinsky J R. Cellular approach to cryoperservation of embryos.. Theriogenology, 1996, 45: 17~26 11 Kasai M,Zhu S E, Pedro P B, et al. Fracture damage of embryos and its prevention during vitrification and warming. Cryobiology, 1996, 33;459~464 12 俞 婉 芳. 频 谱 治 疗 仪 治 疗 冻 疮 42 例. 第 三 届 全 国 生 物 频 谱 研 讨 会 论 文 集, 1995,1l 7~ 1l 8