Application of genetic engineering in sericulture - to produce usable protein from silkworm

沈 阳 农 二 1 且 大 手 学 -tll, '.! 1 < 1 ) =,n 币,1990 Journal of Shenyan 民 A 巳 ricultural Uuivcr'.;ily 基 因 工 程 在 蚕 业 上 的 应 用 利 用 蚕 的 个 体 生 产 有 rn 黑 白 月 1 王 学 兵 马 在 兰 ( t 七!;!I/ ;,!:.) 气 (1'[N ;: ) 以 及 的 个 体 对 fo '. 仁 t1 '\') 乡 [ [ 归 王 志 : ' J J主 休,t1rn 基 fl 斗 工 {'i' i() 子 r l 'i:,, 飞 ' :,; i'ri=r 价 格 M P,li'r'J1:JH] 蛋 白 用 L::;UJ 三 )j 音 杆 菌 等 原 核 生 物 的 宿 ] 二 我 i,i:; 二 tic.1-l' t" I.I: 恒 的 有 用 主 白 J 占 ii l 比. 乒 u, :; 价 ; 气 古 柏 :正[cf! 加 功 能. 更 加 技 近 门 ; 蛋 白 质 i,17,f 尤 点 ;l'j I 头 功 附 恪 先 细 胞 h1i 育 工 的 生 产 系 "it IH lt. 1/Z,j ; 匠 ij: ' 气 1 ' ' ( 让 I(;;, 利 用 茧 的 由 主 或 fj: Ts 飞 c 牛 卢 布 用 登 山 顶 注 重 组 \l 毒 DNAl!J. FU r \t 二 1 沪, 午 /j,,i: 丁 :'1.,,.,-.,-ow; 平 川 ;: ' :{' 门 ;l[l,;fl 安 门 l 重 组 病 毒 a 户 z 统 安 全 可 布, 可 以 大 规 J:t'iTl-1 巳 牛 t O A 飞 快 i,j: 基 闪 工 程 ; ' r?; 1'.;,:- (I!, : 斗 1,rl:: 1\fL r,\t,,: 蚕 业 生 产 在 我 国 有 着 悠 久 的 历 史, 白 古 以 来, 丝 绸 试 对 我 国 人 民 的 生 18 和 经 济 发 民 起 到 了 重 要 作 用 据 统 计, 1988 年 丝 绸 外 贸 创 汇 已 达 16,5 亿 美 元 之 多 不 仅 如 此, 有 关 家 击 和 作 蚕 基 础 理 论 和 应 用 方 面 的 研 究, 尤 其 是 家 歪 的 研 究 对 整 个 生 物 学 的 发 展 作 出 了 巨 大 的 贡 献 迄 今, 远 没 有 任 何 种 昆 虫 比 家 ittlih 究 得 更 加 详 细 和 全 国 在 被 人 们 称 之 谓 新 技 术 革 命 的 三 大 按 心 技 术 之 - 生 物 工 程 的 研 究 方 面, 蚕 业 上 的 WT 究 和 r0.m 也 卓 有 成 效 本 文 仅 从 利 用 茧 的 个 体 生 产 有 用 蛋 白 质 [ 向 角 度 来 闸 述 : 宿 主 战 体 采 统 在 北 因 T 4 " 1 以 盯 上 的 优 越 性, 前 ;!D< 有 关 技 术 1 宿 主 的 作 用 自 从 限 制 性 内 切 酶 和 DNA.i. 主 接 酶 被 发 现 以 来, 平 lj}f-j f+; 外 J,[ 因 亘 古 l 技 术 以 大 肠 杆 菌 作 宿 主 生 产 产 量 有 限 价 格 昂 贵 的 有 用 蛋 白 质 就 被 人 们 所 关 注, 并 相 继 研 究 获 得 成 功 到 目 前 为 止, 除 了 人 的 膜 岛 素 生 民 激 素 干 扰 素 等 已 被 大 哥 生 产 并 在 医 疗 上 开 始 应 用 外, 还 有 不 下 几 十 种 各 种 各 样 的 有 m 蛋 白 阴- 利 川 基 因 m 组 技 术 也 获 得 丁 成 功 作 为 宿 主, 除 了 大 Jj 药 忏 茵 占 ff.1.-j 优 势 以 外, 还 有 枯 草 杆 菌 自,r-F0: 茵 动 物 培 养 细 胞 等 可 是, 通 过 大 量 实 践, 人 们 逐 渐 认 识 到 以 大 肠 忏 苗 等 般 生 物 作 为 宿 主 生 产 出 来 的 蛋 白 质 有 些 是 不 尽 如 意 的 也 就 是 说, 插 入 大 肠 杆 菌 质 拉 DNA 中 的 外 来 基 因 只 要 能 够 随 著 质 位 的 转 录 而 引 录, 并 且 转 录 ) 言 形 Jr 的 mrna 能 够 正 确 地 翻 译, 氨 基 酸 就 可 以 按 照, mrna 提 供 的 信 息 以 A 店 的 顺 序 沾 合 成 肤 怔, 形 成 的 多 肤 链 自 动 折 叠 就 能 够 形 成 具 有 三 级 构 边 的 蛋 白 质 然 而, 现 实 却 并,Jr 如 此 简 单 分 子 结 构 比 较 复 杂 的 蛋 白 质 在 其 分 子 内 部 存 在 着 大 : 茧 的 S-S 结 构, 例 如 t-pa ( 组 织 纤 维 蛋 白 洛 酶 原 激 活 剂 tis su 巳 plasmi nogen activator) 蛋 白 质 分 子 内 就 存 在 首 这 种 结 构 这 种 S-S 结 构 在 大 肠 ff 菌 体 内 并 不 能 形 成 此 外, 还 存 在 着 蛋 白 质 分 子 的 修 饰 问 题, 饰 生 物 体 内 许 多 蛋 白 质 具 有 id 杂 的 柏 链, 收 稿 日 期 刊 白 雪 - CJQ-0\ 本 Z if, 气 n11 盯 q:;,;q 汽 抖,: 问 t'::l'y,:'1'.o 其 中 将 月 lj fti: 耍 的 是 糖 链 的 修 --- 这 些 柏 ri'f 与 白 山 的 芸 (:+ltw 结 合 在 胆, 啊! 性 的 作

82 沈 阳 农 业 大 学 学 K 21 卷 用 虽 然 还 不 完 全 清 楚, 但 是 已 经 知 道 它 与 蛋 白 质 的 生! 用 活 性 和 安 定 性 有 关 系 大 肠 杆 菌 体 内 并 不 具 有 附 加 精 皑 的 功 能 除 了 上 述 谁 也 而 外,if 存 在 引 生 l 茂 的 ;ft 白 质 细 菌 自 身 难 以 识 别 并 将 其 分 泌 到 体 外 字 l 可 哩 归 根 结 底 句 单 不 具 有 辑 :4J 结 构 (() 类 出 自 由 在 时 生 物 飞 巾, 作 为 市 主, 类 似 的 情 况 以 大 肠 忏 民 i 作 为 宿 二: 丁 只 能 生 产 出 分 子 虽 不 大,; 向 选 简 怕 ] 宇 : 杆 菌 也 具 有 与 大 肠 杆 菌 除 了 大 肠 忏 川 平 r1tti 平 忏 1'.i',1 外, 町 ltf,i W.1t 被 人 们 作 为 市 立 米 和 j 旧 M 町 菌 与 大 肠 杆 菌 和 枯 草 杆 雨 不 同, 它 是 真 传 生 物 啕 细 胞 f;1i,f 句 七 );:.Wii 由 和 村 :t((f rwil1: 得 多, 生 产 出 来 的 蛋 白 质 理 应 更 加 接 近 于 u i. ;甘 白 质 ο 但 是, 惜 民 1:;J Im i; 二 许 多 难 皿 并 以 有 得 到 元 全 的 克 服 为 了 进 兑 上 也 市 主 1 1 );it 点,1;,Jc ff 必,11 (il ) 且 更 加 丙 丁子 的 生 物, H 发 新 的 宿 主 载 体 系 统 顺 应 这 种 情 况, 人 们 进 It 开 发 丁 以 功 物 I 占 非 细 胞 作 为 柑 主 生 产 有 用 蛋 白 质 的 体 系 以 动 物 培 } 手 细 胞 作 为 Iat 虽 然 能 够 克 服 在 敞 :'1: ' 阳 市 E 中 存 在 i'r'j xrt 岖, 但 也 明 显 地 存 在 着 两 个 缺 点 是 成 本 市, 卅 养 动 物 细 )1 包 需 吓 加 5% ~ 10υj 仔 牛 的 1f:1 j 斤 出 来,{ 旦 有 些 功 物 的 细 胞 们 ; 自 添 加 部 分 成 十 三 母 子, 产 量 低. fh 然 近 年 来 元 血 j 青 培 养 基 已 被 开 发 放 f11l 成 本 增 加, 生 产 双 益 不 高 二 是 生 工 )主 主 要 是 [j j 人 I; 才 行 异 1r'J 动 物 细 胞 吉 Jfi'. 小, 单 位 容 积 的 细 胞 数 悍 留 在 10 8 ~10 7 /m 的 水 平 上, 这 气,Jc!Fi 忏 {[j,! 1 ll 是 较 低 的 此 外, u 存 在 (;"\ ' 1'. 续 ;} 发 比 较 适 宜 的 载 体 的 问 题 由 于 上 在 Ji;{ 因, 人 们 叉 开 发 出 以 ;}) 物 i 二 作 为 1H l:: 生 产 有 用 茧 白 质 的 宿 主 载 体 系 统 以 功 物 个 体 为 宿 主 并 不 需 要 ;4 杂 的 培 养 住 置, 哎 才 二 低, 生 T" " 来 出 ((1m 白 质 又 能 够 克 服 在 微 生 物 宿 主 中 存 在 的 缺 点, 因 此, 深 受 人 们 的 111! 日 前 已 在 宗 主 大 鼠 ( 仓 鼠 ) 小 鼠 LlJ 羊 等 个 体 上 取 得 时 功. 在 这 F\1. 苔 {( 介 引 以 百 ((J 俨 { 木 { ' f":ftj 主 生 r : 叮 II]: 行 白 质 的 有 关 情 况 2 支 蚕 - nmnt 川 市 主 我 体 系 统 及 骂 优 声! -r 家 益 和 作 ; 在 经 过 人 j 与 长 mi 呵 斥 且 )II fl 二 丰 li 1 X: f. l_',? Ji,' ( 尺 问 帖 i,i] i.f 1 (.J }j,去 特 别 是 家 茧, 对 其 生 物 学 特 性 进 行 f ' 日 可 以 入 1'1'.Jiilf 究 啕 而 且 1iJ 禾 l 门 人 工 饲 料 白, 这 将 给 年 四 季 大 川 模 地 工 厂 化 生 产 提 供 有 利 条 仲 已 知 在 的 多 页 病 中, 有 种 感 染 京 虽 洋 使 其 致 1if'.itr ' 病 毒, 叫 做 家 歪 核 型 多 角 体 病 毒 (Bomhyxr:rnri Nuclca, Polyhcd.-osis Virus:Bmi\JPV) 这 种 病 毒 是 种 具 有 外 膜 的 棒 状 响 毒, 大 小 约 为 30nm X 300nm, - 1 染 色 体 纽 约 有 130000 个 碱 基 对, 是 双 链 环 状 的 DNA BmNP 飞 / 在 被 感 染 的 家?tf11:[! IJ 也 按 中 形 成 1-111 tit 称 之 I 多 角 体 的 病 毒 包 函 体, 多 角 体 内 部 有 病 tj;\ 虫 子, 在 自 然 界 中 包 到 保 护 的 作 用 二号 角 ( 杠 臼 衷 节 的 :1 芮 革 粒 子 在 野 外 可 以 在 相 当 长 时 间 内 不 灰 去 活 性 J NPV 病 毒 旦 经 口 进 入 家 员 休 内, 在 中 朋 旦 出 消 化 液 中 的 蛋 白 酶 将 多 角 体 分 f 晖, 内 巾 的 归 7 号 粒 子 怦 放 出 来, 11 1{ \; 付 并 侵 入 )! 奇 r1; r!1, 主 要 在 脂 的 体 中 增 殖 已 经 查 明 形 成 多 角 体 蛋 白 质 的 基 因 编 ii 巧 在 病 毒 的 染 色 体 组 上 该 基 因 在 病 丐 增 启 过 程 的 后 期 由 启 动 子 所 支 自 己, 生 产 大 : 由 多 角 体 主 白 质, 生 产 呈 每 头 主 多 达 lomg 以 上, 占 感 染 细 胞 整 个 蛋 白 质 含 量 的 10% 之 多, 这 说 明 支 配 多 角 体 :ff 白 质 基 因 的 自 动 子 活 性 是 w 常 强 的 同 时 也 暗 示 着 在 这 个 强 力 的 启 动 子 之 后 用 其 它 外 源 基 因 取 代 多 角 体 去 白 质 1,1; 因, 利 用 活 性 很 强 的 启 动 子 来 大 量 合 成 外 源 基 因 产 物 的 可 能 性 非 常 幸 运 的 是, 多 角 体 只 是 在 病 毒 粒 子 从 亲 代 向 子 代 传 递 时 起 到 重 要 的 作 用, 而 对 病 毒 粒 子 自 身 的 形 成 并 没 有 直 接 关 系 因 此, 将 病 毒 DNA 序 列 中 的 多 角 体 在 因 阿 挽 向 民 它 体 来 l 占 网, 也 同 样 能 够 得 : rr] 行 晴 :11:fUr-J wj1 号 粒 子 c n11 病 毒 的 活 性 并 没

1 期 王 学 英等 83 基 因 工程 在 安 业 飞 的 应 用 有 由 于 上 述 处理 而 受 到 影 响 正 是 由 于 远 点 才促 使人们 得 以 利 用 这个宿 主 载 体系统 慨 而言 之 以 家 茧 BmNP V作为宿主 战 体 系 统 主 要 古五点长 处 2,1 多 角 体 茧 白质大 量 被 合成 说 明 对 毒 U N A序 列l 中 启 功 于 部 分 lt'j ii 性是非常 强的 这 有 利 2.2 多 角体 蛋 白 质 讨病 毒 的 咱 也 并 不 是 必 甫的 从 而 每 υ N A l 川 l l 切 去多 角 体 蚕 白 基 因部 于基 因重 组 后 利 用 该 启 功 子 来犬 _ra生 外 源基 因的产物 分 用 其 它的外 源 基 因取 而 代 之 病 占 同 样 具 ff 感 染 干口 增 ii.的hg )J 2.3 多 角 体在昔 j且 光学 ii. 微 镜 下 tj 吕 眼观 奈 坷 豆 组 病 毒DNA IIJ不 苟 妥 县 百 特珠的标记 重 2.4 重 组 病 毒由于不形成多 角 体 所 以 在 自 然 界不 比 l VJ 生 仔 F L 不 豆 于 造成 危吉 组病毒 DN A不形 成 多 角 休 因 此 叮 以 选 择 出 米 2.!j 家 虽 能 够在 人 工 控 制j 条 件 下大呈饲 白 利 用 该 系 统 1 98 1年 日 尔 JjX 大 学 前 r H :r:1 t 7-泣 支 体 内 成 功 地 k 注J 人的 α 型 干 比 幸 我 们 已经 知 道 也 自 f111 岳 1 H 茧 的 核型乡 的 1,+.: J11J.i号 1 斗 hl -f 山 呈 l i二 状 大 小约 为 5 5 n m x :S 3 0 n m 接 酸 类 型 为 在UJ之 υ N A o 才 J 存 有 呀 f'i1-n 在 fj 式 ii}i 主 才皮 包 出 任 多 角 体 坠 叫做多 角 f本 态 而 击 另 外 仲 是不 包入 三 角 中 h iifr. 态,iiJ 孕 讨 冗 Jf 友 以 作 茧 个 体 为 宿 主 t'f 盗核 型 多 角 体病 毒为载 体 利 m 作 茧 的 宿 主 载 体 J: tic 当二 卢 布 jj 蛋 白质也是 项具 有 茧 要生产 实 际意义的研 究课越 a 元 旦 应 该 指 出 的 忌 与 家 或 相 比 作 企 具有 其 独 特的 优 越 性 因为 作 蚕以 蜗 越 冬 并 且 蝠 体大 利 用 这 点 ij 崎 朋 注入重主il 病 毒 Jfj 大批 蚕 蝠来生产有 用 蛋 白 质 这可以 的止在 家 蚕 蚕 期 注入主 址 病 毒 时 由 于 蚕爬 行 引 坦 的 fl 感染的问 题 现在 我 国已在人 在 从 丰作 蚕 宿 主 载 体 系统的开发 研 究 J 作 3 利 吁 家 蚕 Bn1NPV. 市 玉 载 体 系 统 生 产 有 It] 白 卅 的方 法 和 步 骤. 且 以 家 世 BmJ\. f' I 市 立 的 体 采 统生J '..: -T 比 去 J:1 例 i,l HIJ (,ls:叫 f fll D N A时 存 及 干 扰 亲 虽 因 表 达的 方 法 步 味 3.1 纯 化家蚕核 型 多 角 体 州 主导 ill 取 标 准 i,j 远 的 血 隆 株 0 由 柏 甘jl] JJ的归 毒 性 子 q 1证以 U l\ l\, J i 二 利I lirt ;\jlj i主 内 UJ NJ 付 只 l)j 断 把 切 断 ]i 得 到 的 D N A 断 片 整 合 剧 大肠 忏 菌 Jli 粒 上 1Ht tt 人 丁 州 tf D N Arli11 J '1 1; J k. 肠 杆 的 质 粒 分 到Jj 转 化 副 大 3.2 肠杆菌 i体 内 建 立 病 毒 N A的 贮 陆 文库 3.3 从 病 毒 位 于 正 在 大 且 j世 础 的 细 胞 中 分 冯主 fid H二 且 t1 :1:; 111 E N A 3.5 以 合 唱的豆 补 1<J D N A为 探 计 从 己 过 立 的 市 二j U N A贮 成 立 j午 rj 位 4 ι 有 多 角 i本 主 因的 3,4 利 用 反 转录 晦 由 上 边 分 自 到 J m R N A合 吱 1 补的 D A o 质 桂 并 将 其 同 击 3.6 r i文 选 同 起 了 的!JJ( 粒 l!jl l J; _I;:_t, f可 i;;,: 'J Li:J, Vi 入 五 出 Jdi li tl 成 当 UK ;.;'.,: 1 '.J M Ajj 源 业 时 用 的 原 柱 3.7 3.8 7吁干 扰 示 毕 因且i 合 到 J白 人 外 ii 基 因 片HI丑 剧 bi 1 1-1 0 j巴 插 入 了 干 扰 主 旦 因 J JiJ1 把!J l A平时iJ L'j U N A;: G,:i',.i i '. i'1j l i t孚.. J ;'; fr 细 胞 Oi'r Ti飞细 胞 中 口l 立 生 自 然 交 快 Jf;!JV, Jgj 入 J i -Jt 二 'U'M1 :J 1 / :d L 1i'J iih!l f 3,9 应 用 空 Vf. 1去 回 收 不 形 与 乡 f(d I妇 '.j 丘 也 J l 的 1.j,',, ( L'.. 取 I \ J 均 比 且 时 具有 千 扰 本 基 因1'1'.j 剧 毒 并 将 其 纯 仁

84 沈 阳 农 业 大 学 学 报 21 巷 3. 10 使 重 组 肩 毒 在 培 芹 细 f] 包 中 唱 唱, 并 把 搜 出 培 弄 液 中 的 重 组 病 毒 注 射 到 家 蚕 5 龄 幼 虫 体 内 ( 亦 可 经 口 感 染 ), 让 家 蚕 生 产 干 扰 素 大 量 的 干 扰 素 会 释 放 到 体 液 中 有 试 验 结 果 表 明, 将 重 组 肩 毒 分别 感 染 家 茧 的 l'ci 养 细 胞 归 5 玲 均 虫, 在 培 养 液 中 和 体 液 中 各 自 可 得 到 i l) J /ml 以 10 7 /ml 个 单 位 的 干 扰 素 在 5 龄 幼 虫 体 内 的 惶 相 当 于 每 毫 升 体 液 收 到 40µ 巴, 头 蚕 可 生 产 60µg 时 j f 扰 素 远 个 j文 字 是 恨 百 ] 现 的, 但 是 如 果 考 虑 到 干 扰 素 的 合 成 量,.E 不 足 多 简 体 蛋 白 质 合 成 垦 的 1 % 这 力, 有 待 于 进 步 深 入 研 究 事 夹, 说 l-j)] ; 主 个? 占 主 载 体 系 统 仍 然 存 在 着 极 大 潜 以 上 是 以 生 产 干 扰 素 为 例 介 绍 了 利 用 家 茧 BmNP V 宿 主 战 体 系 统 操 作 的 方 店 和 步 骤 推 l 而 广 之, 不 仅 干 扰 素, 其 它 1 芳 贵 的 有 用 蛋 白 质 也 可 采 用 大 体 类 似 的 方 法 来 生 产 家 蚕 作 蚕 NP V 宿 t. :1 主 体 军 统 必 阳 在 亚 加 广 泛 ii {&: 国 内 被 利 用 步 ι? 文 献 l 'i".:,it '!{ ; 二 咀 i 泣, l 古 厅, 1:3 (i ): 川 ~! )., + l 与 [J.j ;J:, ' 1 \ "]' - Jlt 业, 1 :.' 日 巳 ; ( 巾. 2~J i 儿 t - i:, 1[. J 主 i 飞 ticj), 1 '.l 日 S ; 刑 ' )lj- 1 ij : 8U~r I 恬 刀 ι;.ill! 午 t rn. 1 口 88; 如 ] 册 1 >) : 72~ ' { 6 s 1,u1;(,(;. /.- r 才 尹 少 / u y -.\ 门 日 本 仨 以 : J;'; ;,:, [t], 别 '{Ji,)' 彦, 过 [ 击 ( 日 ), I 吁 88; 另 l j!]fl l cc; : 旦 ~7 1! ' ti: 3 ~ 3C 7 忖 松 正,,:. 5 才? γ ζ 工 γ )l, 遗 传 了 ;I "'f:. rj 才 二 江! 王 ;: 巳 叫 ;". } : 二 fl:. l C88 : s \, Ii 性 r:e:.1,, 可 ] 于 这 (i/{ u \i.'j /: ij[ c i:'i ;J, \ lso: 5 口 ~ JJ, 川 口 ~ 门 司 二 -1 0~ l Vi

l JIJ] 85 Application of Genetic Engineering in Seri culture --To produce us able protein from silkworm Wang Xu eying Ma Chunlan (Department of Plant Protectio'.l, Shenyang Agrir,u\lural Uniyersity) Abstract Usable protein featuring in limited output and expensive cost is obtained by means of genetic engineering taking silkworm as host an<l nucleus type multiangle virus as bearer.the Protein has the advantages of high efficiency an<l valence, having the; function of accepting carbohydrate chain and being even closer to natural Protein. This production system has the advantages of low cost and high Production efficiency as compared with that taking rultivaterl animal cell as hos!. No special label is required for recombined virus DNA using silkworm host-hearer system to produce usable Protein.Recombined virus could he examined under normal optical microscope. The system is safe and reliable ar.d could be used in a large scale or industrial Production. Key words:genetic engineering;host:protein: bearer: virus