杨志刚

620 中国肿瘤生物治疗杂志 http://www.biother.org Chi J Cacer Biother, Ju. 2018, Vol. 25, No. 6 DOI:10.3872/j.iss.1007-385x.2018.06.012 临床研究 RUNX1 异构体在急性白血病中的表达及临床意义 杨志刚 1,2, 刘佳 2, 文瑞婷 2, 吴国才 2, 王巍 3, 张宇明 2 (1. 广东医科大学附属湛江中心人民医院血液风湿内科, 广东湛江 524045;2. 广东医科大学, 广东湛江 524023;3. 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院血液实 验室, 上海 200437) [ 摘要 ] 目的 : 探讨 RUNX1 异构体的表达与临床疗效 疾病预后的关系, 以期为急性白血病的个体化治疗 预后判断及微小残留病 (miimal residual disease,rd) 的监测提供有价值的实验依据 方法 : 选择 2012 年 4 月至 2013 年 4 月于广东医学院 ( 现为广东医科大学 ) 附属医院血液内科住院的急性白血病初治患者 88 例 复发患者 10 例为研究对象 采用 qcr 法检测急性白血病初治 复发患者以及对照组患者 ( 非恶性白血病 )RUNX1 异构体 RUNX1a 和 的表达水平, 并追踪检测同一患者化疗前后 RUNX1a 和 表达水平的变化 结果 : (1)AL 初治组 复发组以及 ALL 初治组 的表达水平较对照组升高 (<0.05),AL 初治组 的表达水平较 ALL 初治组升高 (<0.05) (2)AL 及 ALL 患者初治时 RUNX1a 和 的表达水平较化疗后完全缓解 (complete remissio,cr) 时升高 (<0.05) (3) 比较初诊时的 RUNX1a 和 表达水平, 半年内死亡与存活患者 首疗程化疗后 CR 组与 NCR 组 初诊时高白细胞组与非高白细胞组均无显著差异 (>0.05);AL-ETO 融合基因阳性患者 RUNX1a 表达水平较阴性患者升高 (<0.05) (4) 急性白血病患者 RUNX1a 和 的表达水平随着化疗呈递减趋势, 复发时又明显增高甚至超过初治状态 结论 : RUNX1a 异构体参与了急性白血病的发病, 并且与 AL 的复发相关 ;RUNX1a 和 表达水平与临床疗效相关, 与疾病预后无关, 可作为疾病疗效判断的指标 ; 动态监测 RUNX1a 和 RUNX1b/c 异构体的表达水平可以作为化疗后 RD 监测的有效指标, 用于评估疗效 早期识别复发风险 [ 关键词 ] RUNX1 异构体 ; 急性白血病 ; 疗效评估 ; 复发 ; 微小残留病 [ 中图分类号 ] R733.71;R730.2 [ 文献标识码 ] A [ 文章编号 ] 1007-385X(2018)06-0620-09 Expressio of RUNX1 isoformsad its cliical sigificace i acute leukemia YANG higag 1,2, LIU Jia 2, WEN Ruitig 2, WU Guocai 2, WANGWei 3, HANG Yumig (1. 2 Departmet of Hematology ad Rheumatology, Affiliated hajiag Cetral eople s Hospital of Guagdog edical Uiversity, hajiag 524045, Guagdog, Chia; 2. Guagdog edical Uiversity, hajiag 524023, Guagdog, Chia; 3. Laboratory of Hematology, Yueyag Hospital of Itegrative Chiese ad Wester edicie, Shaghai Uiversity of Traditioal Chiese edicie, Shaghai 200437, Chia) [Abstract] Objective: To ivestigate the relatioship betwee the expressio of RUNX1 isoforms ad the cliical curative effect ad the progosis of acute leukemia (AL), i order to provide valuable experimetal data for the idividualized treatmet, RD (miimal residual disease) moitorig ad progosis predictio of AL. ethods: AL patiets with primary treatmet (T, =88) ad recrudescece (RC, =10) that treated at the Departmet of Hematology of Affiliated Hospital of Guagdog edical Uiversity from April, 2012 to April, 2013 were icluded i this study. Real-time CR was used to examie the mrna expressio of RUNX1 isoforms (RUNX1a ad RUNX1b / c) i T patiets, RC patiets ad cotrols (o-maligat hematological disease patiets). The chages i mrna expressio of RUNX1a ad RUNX1b/c i patiets before ad after the chemotherapy were also observed. Results:(1)The expressio levels of i AL ad ALL T group ad AL RC group was sigificatly higher tha those of cotrol group (<0.05); The expressio level of i AL T group was icreased compared with ALL T group (<0.05). (2) The expressio levels of RUNX1a ad i AL ad ALL patiets at iitial treatmet were sigificatly higher tha those after complete remissio (CR) (<0.05). (3) By comparig the expressio levels of RUNX1a ad at iitial diagosis, [ 基金项目 ] 广东省科技计划基金资助项目 (No. 2014A020212300,2016A020215149); 湛江市财政资金科技专项竞争性分配项目 (No. 2016A06003) roject supported by the Sciece ad Techology laig roject of Guagdog rovice(no. 2014A020212300, 2016A020215149), ad the hajiag City Fiacial Resources for Competitive Sciece ad Techology Distributio rogram(no. 2016A06003) [ 作者简介 ] 杨志刚 (1966-), 男, 博士, 教授, 博士生导师, 主要从事血液病免疫学机制的研究 [ 通信作者 ] 杨志刚 (YANG higag,correspodig author),e-mail:yagzg@gdmu.edu.c

杨志刚, 等.RUNX1 异构体在急性白血病中的表达及临床意义 621 there was o sigificat differece betwee 6-moth death group ad survival group, CR group ad NCR (o-complete remissio) group after first cycle of chemotherapy, or the high leukocyte group ad o-high leukocyte group (all >0.05).The expressio level of i AL-ETO positive group was higher tha that of egative group (<0.05). (4) The expressio levels of RUNX1a ad i patiets with acute leukemia decreased with the icreasig chemotherapy cycle, ad sigificatly icreased whe had a relapse, which may eve succeed the iitial level.coclusio: RUNX1a isoforms participate i the pathogeesis of acute leukemia, ad isrelated to the relapse of AL. The expressio levels of RUNX1a ad are related to the cliical efficacy that ca be used as a idicator of curative effect, but have o sigificat correlatio with the progosis of the disease.dyamic moitor of theexpressio levels of RUNX1a ad RUNX1b/c isomers ca be used as a effective idicator of RD moitorig after chemotherapy, which ca be used to evaluate the efficacy ad idetify the risk of recurrece at early stage. [Key words] RUNX1 isoforms; acute leukemia; evaluatio of curative effect; relapse;miimal residual disease(rd) [Chi J Cacer Biother, 2018, 25(6): 620-628. DOI:10.3872/j.iss.1007-385X.2018.06.012] Rut 相关转录因子 (rut-related trascriptiofactor,runx) 家族是一类重要的发育调控因子, 在细胞增殖 分化 发育以及凋亡中起调控作用 RUNX 家族主要包括 RUNX1 RUNX2 和 RUNX3 [1] [2-3] 有研究发现,RUNX 家族参与了多种肿瘤的发生, 如 RUNX1 在造血调控以及血液肿瘤的发生发展中起重要作用 ;RUNX2 作为骨细胞的特异性转录因子, [4] 参与了骨骼发育与骨肉瘤的形成 ;RUNX3 的失活 [5] 可导致实体瘤的形成 因此, 不同的 RUNX 具有不同的组织表达特异性和不同的生物学功能 在 t(8; 21) 阳性的急性髓细胞性白血病 ( acute myeloid leukemia,al) 患者基因序列中 RUNX1 被首次发现, 因此亦称为 AL1 [6] RUNX1 由于 mrna 剪接不同, 可编码 RUNX1a RUNX1b 和 RUNX1c 三种异构体 RUNX1a 缺乏 C 末端转录调节结构域, 但与 RUNX1b 含有相同的 N 端结构 RUNX1b 与 RUNX1c 含有相同的 C 端结构, 两者具有相似的功能,RUNX1a 能够 [7] 竞争性抑制 RUNX1b 及 RUNX1c 有研究发现, RUNX1a 过表达可以抑制由 G-CSF 诱导的骨髓髓系祖细胞的终末分化,RUNX1a 缺乏转录活性, 比 RUNX1b 具有更高的亲和力与靶基因结合, 因此促进了白血病的发病 RUNX1a 在急性白血病患者骨髓单个核细胞中的表达水平升高, 并通过动物实验证 [8] 实 RUNX1a 过表达能够导致白血病的发生 RUNX1a 异构体大量表达于人脐带血 CD34 + 细胞群体, 小鼠骨髓祖细胞中 RUNX1a 过表达能够促进移植 [9] 后植入 RUNX1a 能够扩增造血干细胞, 而抑制 RUNX1a 的功能可以促进单核细胞和粒细胞的生 [10-12] 成 与此相反的是,RUNX1b/c 过表达促进了 p53 [13-14] 依赖性的衰老, 并且促进了造血细胞分化 因此, 不同的 RUNX1 异构体的表达水平对正常或恶性血细胞生成产生的作用是不同的 目前, 国内外大多是关于 RUNX1 基因功能及其对靶基因的转录调控机制的研究, 但关于 RUNX1 转录因子异构体 RUNX1a RUNX1b 以及 RUNX1c 表达水平与急性白 血病临床类型 疗效及预后关系的研究鲜有报道 因此本研究通过比较急性白血病初次治疗 (primary treatmet,t) 复发 (recrudescece, RC) 患者与对照组 RUNX1 异构体 RUNX1a 和 的表达差异, 并追踪患者化疗前后 RUNX1 异构体的表达变化, 探讨 RUNX1 异构体的表达与临床疗效 疾病预后的关系, 以期为急性白血病的临床个体化治疗 预后判断及微小残留病 (miimal residual disease, RD) 监测提供有价值的实验依据 1 资料与方法 1.1 临床资料选择 2012 年 4 月至 2013 年 4 月于广东医学院 ( 现为广东医科大学 ) 附属医院血液内科住院的急性白血病初治患者 88 例 复发患者 10 例为研究对象, [15] 诊断参照 2008 年 WHO 分类标准 入组 AL T 患者 52 例 RC 患者 5 例 ( 急性早幼粒细胞白血病即 3 除外 ),ALL T 患者 36 例 RC 患者 5 例 以 51 例非恶性血液病患者为对照组, 其中缺铁性贫血 26 例 巨幼细胞性贫血 6 例 特发性血小板减少性紫癜 19 例 ; 男性 30 例, 女性 21 例, 中位年龄 41 岁 (15~82 岁 ) 化疗方案 :AL(3 除外 ) 诱导缓解采用 DA[ 柔红霉素 + 阿糖胞苷 (Ara-C)] 方案, 巩固治疗采用大剂量 Ara-C;ALL 诱导缓解和巩固治疗采用 VDCLD( 长春新碱 + 柔红霉素 + 环磷酰胺 + 门冬酰胺酶 + 地塞米松 ) 方案 本研究已获广东医科大学附属医院医学伦理委员会同意, 所有入组人员均签署知情同意书 88 例 T 患者随诊 1~13 个月, 比较同一患者初诊时以及首疗程化疗完全缓解 (complete remissio, CR) 后的 RUNX1 异构体的表达水平, 可评估的患者 AL 16 例 ALL 17 例 根据疾病确诊半年内是否存活, 分为 AL 死亡组 (9 例 ) 与存活组 (15 例 ),ALL 死亡组 (9 例 ) 与存活组 (11 例 ); 根据首疗程化疗后是否达到 CR 状态分为 CR 组 (AL16 例 ALL17 例 ) 与未完全缓解 (o -complete remissio,ncr) 组 (AL9

622 例 ALL3 例 ); 根据初诊时外周血白细胞数 (AL: WBC>100 10 9 /L 为高白细胞 ;B-ALL:WBC>30 10 9 / L,T-ALL:WBC>100 10 9 /L 为高白细胞 ) 将 88 患者分为高白细胞组 13 例 (AL 7 例,ALL 6 例 ), 与非高白细胞组 75 例 (AL 45 例,ALL 30 例 ) 52 例 AL 患 中国肿瘤生物治疗杂志, 2018, 25(6) 者中 31 例初诊时采用荧光原位杂交技术检测了 AL-ETO 融合基因, 根据 AL-ETO 融合基因检测结果将 31 例患者分为 AL-ETO 融合基因阳性组 (4 例 ) 和阴性组 (27 例 ) 88 例患者临床资料见表 1 Cliical feature Leukemia classificatio Sex Age(t/a) CR group ad NCR group after the first course of chemotherapy RC Death group ad survival group at 6 moths High leukocyte No high leukocyte AL-ETO fusio gee 表 1 88 例患者临床资料 () Tab.1 Cliical data of 88 patiets() AL(N=52) 0 2, 1 1, 2 14, 4 16, 5 15, 6 2, Uclassified 2 ale 27 Female 25 48(5-87) CR 16 R 4 NR 5 5 Death 9 Survival 15 7 45 ositive group 4 Negative group 27 ALL(N=36) L 1 3, L 2 17 Uclassified 16 ale 21 Female 15 23(5-76) CR 17 R 1 NR 2 5 Death 9 Survival 11 6 30-1.2 主要试剂淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物公司, TRIzol 逆转录试剂盒 SYBR@remix Ex TaqTII 试剂盒购自 TaKaRa 公司, 引物由生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司合成 1.3 总 RNA 提取抽取骨髓液 2~4 ml, 加 EDTA 抗凝, 淋巴细胞分离液分离单个核细胞, 按 TaKaRa 公司 TRIzol 试剂盒说明书提取总 RNA, 用紫外分光光度仪检测浓度及纯度, 其 D 260/D 280 比值为 1.8~2.0 1.4 cdna 合成在冰上进行逆转录反应液的配置, 逆转录体系 10 µl, 包括总 RNA 3 µl 5 rimescript Buffer 2 µl RNase-free 水 5 µl,37 反应 15 mi,85 反应 5 s 反应产物 -20 保存 1.5 CR 扩增产物的可靠性检测通过 CR 产物熔解曲线分析判断产物的可靠性 以 cdna 作为模板, 加入 CR 反应体系扩增 RUNX1a 和 RUNX1b/c 基因片段及内参 GADH 总反应体系 10 μl:sybr remix Ex Taq T Ⅱ 5 µl,cr Forward rimer(10 µmol/l) 0.2 µl,cr Reverse rimer(10 µmol/l) 0.2 µl, 逆转录反应产物 1 µl,dh 2O 3.6 µl CR 循环条件 :95 30s ;95 5 s,60 20 s, 40 个循环 1.6 q-cr 检测 RUNX1a 表达水平根据 RUNX1 mrna 序列,rimer3 (http://frodo. wi.mit.edu/) 软件在线设计 RUNX 1a 和 RUNX 1b/c 引物, 并进行 BLAST 分析 (www. cbi. lm. ih. gov / BLAST), 避免非特异性扩增 ; 内参 GADH 引物采用通用引物 引物由生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司合成 引物序列及扩增片段见表 2 qcr 反应按 TaKaRa 公司 SYBR remix Ex TaqT Ⅱ 试剂盒说明书进行 在冰上进行 qcr 反应液配置 :SYBR remix Ex TaqT Ⅱ5 µl,cr Forward rimer(10 µmol/l) 0.2 µl,cr Reverse rimer(10 µmol/l) 0.2 µl, 逆转录反应产物 1 µl,dh 2O 3.6 µl, 总体系 10 µl 反应条件: 预变性 95 30 s,1 个循环 ;CR 反应 95 5 s, 20 45 s,60 20 s,20, 30 s,40 个循环 RUNX1a 相对表达量均用 2 -ΔΔCT 值表示,ΔCT = CT 目的基因 -CT 内参基因 1.7 追踪急性白血病患者从初治到连续化疗 2 个疗程后 RUNX1 异构体表达变化的趋势分别于初诊时 第一个疗程化疗后 第二个疗程化疗后 3 个时间点采集每位患者的骨髓样本, 采用 qcr 法检测 3 个时间点患者的 RUNX1a 和 RUNX1b/c mrna 表达水平 ; 连续追踪 13 例患者 (AL 8 例

杨志刚, 等.RUNX1 异构体在急性白血病中的表达及临床意义 623 ALL 5 例 ) 化疗 2 个疗程的 RUNX1a 和 RUNX1b / c mrna 表达变化趋势 1.8 统计学处理应用 SSS 17.0 统计软件分析 本资料属于计量资料且不服从正态分布, 用中位数 () 描述 ; 除同一 急性白血病患者化疗前后的比较采用配对设计的 Wilcoxo 符号秩和检验外, 其余 2 组之间的比较均采用独立样本 a-whitey U 秩和检验, 以 <0.05 或 <0.05 表示差异有统计学意义 表 2 RUNX1a 和 RUNX1b/c 引物序列及扩增片段 Tab. 2 RUNX1a ad RUNX1b/c primers ad amplified fragmets Gee RUNX 1a RUNX 1b/c GADH rimer sequece F 5 - AACCCTCAGCCTCAGAGTCA-3 R 5 - CCACATTCTGCCTTCCTCAT-3 F 5 - AACCCTCAGCCTCAGAGTCA-3 R 5 - CAATGGATCCCAGGTATTGG-3 F 5 -GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3 R 5 - TGAGCTTGACAAAGTGGTCG-3 Amplified fragmet legth(bp) 191 98 212 2 结果 2.1 CR 扩增产物均一可靠所提 RNA 经分光光度计检测,D 260/D 280 值为 1.8~ 2.0, 纯度好, 可用于 qcr 检测 熔解曲线分析 ( 图 1) 显示,RUNX1a RUNX1b/c 和 GADH 基因 CR 扩增产物熔解温度均一, 熔解峰为锐利的单一峰, 说明扩增产物均一, 无非特异扩增及引物二聚体 2.2 急性白血病 T RC 患者 RUNX1a 和 RUNX1b/c mrna 表达水平 AL 及 ALL T 组的 表达水平均较对照组增高,ALT 组的 表达水平较 ALL T 组升高,AL RC 组 表达水平明显高于对照组 ( 均 <0.05);ALL RC 组表达水平虽高于对照组, 但差异无统计学意义 (>0.05) ( 表 3 4) AL 及 ALL T 组 RC 组与对照组比较 ALT 组与 ALLT 组比较, 表达水平均无统计学意义 (>0.05)( 表 3 4) 1: RUNX1b/c; 2: RUNX1a: 3: GADH 图 1 RUNX1b/c RUNX1a 和 GADH 熔解曲线图 Fig. 1 Fusio curves of RUNX1b/c, RUNX1a ad GADH 表 3 急性白血病 T RC 患者及对照组患者 RUNX1a 表达水平 Tab.3 Expressio levels of RUNX1a ad i AL patiets of T, RC ad cotrols Cotrol 51 0.001193 0.0267403 (0.0000070-0.0290397) (0.0026170-7.8154440) AL T 52 0.0031500-3.885 0.000 0.04322520-1.867 0.062 (0.0000471-1.4401002) (0.0003680-25.8463530) RC 5 0.0190454-2.715 0.007 0.0741320-0.991 0.322 (0.0013168-52.7027373) (0.0054430-0.1417550) ALL T 36 0.0015505-6.524 0.000 0.0243370-0.2.84 0. 776 (0.0001398-4.8074390) RC 5 0.0080501-1.566 0.117 0.1431910-1.911 0.060 (0.0000148-4.8317555) (0.0178860-2.1750790)

624 2.3 RUNX1a 和 的表达水平与急性白血病疗效的关系采用配对设计的 Wilcoxo 符号秩和检验分析同一患者化疗前后 RUNX1a 和 表达 中国肿瘤生物治疗杂志, 2018, 25(6) 的变化, 结果 ( 表 5) 显示,AL 及 ALL 患者初治时 RUNX1a 和 的表达水平高于化疗 CR 后, 差异均具有统计学意义 (<0.05) ALL T AL T 36 52 表 4 AL 与 ALL T 患者 RUNX1a 和 表达水平 Tab.4 Expressio level of RUNX1a ad i AL ad ALL T patiets 0.0015505 (0.0001398-4.8074390) 0.0031500 (0.0000471-1.4401002) -2.003 0.045 0.0243370 0.0432252 (0.0003680-25.8463530) -1.914 0.056 2.4 RUNX1a 和 的表达水平与患者半年生存率的关系比较半年内死亡组与存活组患者初诊时的 RUNX1a 和 表达水平, 结果 ( 表 6) 显 示,AL 和 ALL 的死亡组与存活组比较, 患者初诊 时的 RUNX1a 和 2 的表达水平均差 异无统计学意义 (>0.05) 表 5 急性白血病 T 和 CR 患者 RUNX1a 和 的表达水平变化 Tab. 5 Expressio level of RUNX1a ad i AL patiets of T ad CR AL ALL T CR T CR 16 16 17 17 0.0046180 (0.0001260-1.4401000) 0.0020310 (0.0001160-0.5862180) 0.0020220 (0.0001400-4.8074400) 0.0008960(0.0001920-0.0248430) 1.877 2.183 0.002 0.000 0.0492840 (0.0050500-25.8463253) 0.0157890 (0.0040060-15.3750050) 0.0297700 (0.0024430-1.0044340) 0.0146680 1.600 1.411 0.012 0.037 AL ALL Death Survival Death Survival 表 6 急性白血病半年内死亡组与存活组患者治疗前 RUNX1a 和 RUNX1 b/c mrna 的表达水平 Tab. 6 re-treatmet level of RUNX1a ad RUNX1 b/c mrna of acute leukemia patiets 9 15 9 11 i the 6-moth death group ad survival group 0.0027140 (0.0005640-0.0088060) 0.0027430 (0.0000470-1.4401000) 0.0017480 (0.0001800-0.0106870) 0.0008000 (0.0001400-0.0066610) -0.03-1.064 0.976 0.287 0.0249490 (0.0003680-0.5988120) 0.0384820 (0.0059300-25.8463530) 0.0261000 (0.0054110-0.1988800) 0.0155170-0.865-0.57 0.387 0.569 2.5 首疗程化疗后 CR 组与 NCR 组患者治疗前 RUNX1 异构体的表达水平比较 AL-CR 与 NCR 组患者治疗前的 RUNX1a 表达水平, 结果 ( 表 7) 显 示,CR 组与 NCR 组患者治疗前 RUNX1a RUNX1b/c 的 mrna 表达水平比较差异无统计学意义 (>0.05) 由于 ALL 的 NCR 组患者例数较少, 不纳入本次比较分析

杨志刚, 等.RUNX1 异构体在急性白血病中的表达及临床意义 2.6 RUNX1a 和 的表达水平与急性白血病患者初诊时外周血白细胞计数的关系比较 ALL 高白细胞组与非高白细胞组 RUNX1a 表达水平, 结果 ( 表 8) 显示, 虽然高 625 白细胞组 RUNX1 两个异构体 RUNX1a RUNX1b/c 的 mrna 表达水平高于非高白细胞组, 但两组比较差异无统计学意义 (>0.05) CR NCR 表 7 AL 首疗程 CR 组与 NCR 组患者治疗前 RUNX1a 和 的表达水平 Tab.7 re-treatmet level of RUNX1a ad of AL patiets with CR ad 16 9 0.0046180 NCR after the first course of chemotherapy (0.0001260-1.4401000) 0.0013420 (0.0000470-0.0154030) -1.302 0.193 0.0492830 (0.0050500-25.8463530) 0.0358670 (0.0056090-0.5988120) -0.566 0.571 2.7 RUNX1 的表达水平与 AL-ETO 融合基因的关系比较 AL-ETO 融合基因阳性组与阴性组 RUNX1a 表达水平, 结果 ( 表 9) 显 示,AL-ETO 融合基因阳性组 的表达水平较阴性组明显升高 (<0.05), 而 RUNX1b / c mrna 的表达水平在阳性组与阴性组比较差异无统计学意义 (>0.05) AL ALL 表 8 高白细胞组与非高白血病组 RUNX1a 和 的表达水平 Tab.8 Expressio level of RUNX1a ad i high leukocyte group ad o- high leukocyte group High leukocyte No-high leukocyte High leukocyte No-high leukocyte 7 45 6 30 0.0027430 (0.0019000-0.0544090) 0.0033050 (0.0000470-1.4401000) 0.0062170 (0.0002980-0.0501030) 0.0010320 (0.0001400-4.8074400) -0.121-0.313 0.904 0.189 0.0373520 (0.0003680-2.4056250) 0.0372330 (0.0050500-25.8463530) 0.0513520 (0.0118320-0.2018050) 0.0210870-0.362-1.061 0.717 0.289 表 9 AL-ETO 融合基因阳性组与阴性组 RUNX1a 和 的表达水平 Tab. 9 Expressio level of RUNX1a ad i positive AL-ETO fusio gee group ad egative group ositive Negative 4 27 0.0161450 (0.0083900-0.0307600) 0.0032560 (0.0000470-1.4401000) -2.121 0.034 0.0299480 (0.0075670-25.8463530) 0.0392330 (0.0050500-3.1680470) -0.236 0.814 2.8 同一急性白血病患者从初治到连续 2 个疗程化疗后 RUNX1 异构体的表达变化趋势追踪监测 13 例急性白血病患者从初治到连续 2 个疗程化疗后 RUNX1 异构体的表达水平变化, 结果 ( 图 2) 显示, 病例 1(ALL 患者 ) 与病例 2(AL- 4 患者 ) 在第 1 个疗程后 R 时 RUNX1a 的表达水平高于初治时, 第 2 个疗程 CR 后明显下降 ; 病例 1 第 1 个疗 程后 R 时 RUNX1b/c 的表达水平虽有降低, 但第 2 个疗程 CR 时其表达水平又升高并超过初治时 ; 病例 3(AL- 2 患者 ) 第 1 个疗程后 CR 时 RUNX1b/c 的表达水平明显高于初治时, 第 2 个程 CR 时其表达水平又明显下降 病例 1~3 在化疗期间均出现感染, 病例 1 和病例 2 未查明为何种病原体所致, 但抗感染治疗有效, 病例 3 为病毒感染 ( 病毒性结膜炎 ) 除上述个

626 别现象外, 其余患者 2 种异构体 RUNX1a RUNX1b/c 的表达水平在初治时最高, 随着连续 2 次化疗其表达水平呈递减趋势, 复发时又明显增高甚至超过初治状态 ( 病例 13 为 ALL 复发患者 )( 图 2) 图 2 急性白血病患者连续 2 个疗程化疗后 RUNX1a(A) 和 RUNX1b/c(B) 的表达趋势 Fig. 2 Expressio tred of RUNX1a (A) ad RUNX1b/c (B) after chemotherapy for 2 cosecutive courses i patiets with acute leukemia 3 讨论 [16] 早期研究认为,RUNX1 作为肿瘤抑制基因在 [17-18] AL 中发挥抑癌作用, 但是最近一些研究发现, RUNX1 能够通过促进白血病细胞增殖发挥致癌作 [10-12] 用 研究报道,RUNX1 通过不同的异构体表达调节细胞的分化从而参与了恶性肿瘤的发生, 不同的 RUNX1 异构体在白血病发病中的作用不同 本研究发现,AL 和 ALL 初治患者 水平较非恶性血液病对照组升高, 水 [8] 平与对照组比较无明显差异 LIU 等研究也发现, RUNX1a 在 AL-2 亚型和 ALL 中的表达水平高于健康对照组 这提示 RUNX1a 过表达促进了白血病的发生 发展, 但是 RUNX1b/c 可能未直接参与白血病的发病 RUNX1a RUNX1b/c 异构体在白血病中的表达不同可能是由于 RUNX1a 过表达于 CD34 + 细胞, 并且促进了 CD34 + CD45 + 造血干细胞的产生, 但 [19-20] 是 RUNX1b / c 缺乏这种功能 ; 也可能是由于 RUNX1a 缺乏维持正常的 RUNX1 功能所必需的 C 末端转录调节结构域, 因此 RUNX1a 的过表达导致了异常的造血, 但 RUNX1 异构体参与白血病发病的这 [8,21] 些机制仍需进一步研究证实 另外, 本研究还发现,AL 复发患者 水平较对照组升高,ALL 复发患者 水平以及 AL 与 ALL 复发患者 水平较对照组亦有 中国肿瘤生物治疗杂志, 2018, 25(6) 升高, 但无统计学差异 这可能与入组的复发患者病例数量太少有关, 需要扩大病例数量进一步明确急性白血病复发与 RUNX1a RUNX1b/c 的关系 关于 RUNX1a 和 RUNX1b/c 异构体与白血病疗效的关系目前未见报道, 为了进一步探讨 RUNX1a 和 的表达水平与急性白血病疗效的关系, 本研究配对分析了同一急性白血病患者初治及首疗程化疗 CR 后的 RUNX1a 和 表达水平变化, 结果发现 AL 及 ALL 患者首疗程化疗后 CR 时 RUNX1a 和 的表达水平较初治时明显降低 这提示 RUNX1a 和 RUNX1b/c mrna 表达水平与急性白血病的临床疗效相关, 可作为疾病疗效判断的指标 RUNX1 突变可导致细胞遗传学正常的 AL 预 [22] [23] 后不良 最近研究也报道了 RUNX1 高表达是细胞遗传学正常的 AL 预后不良的标志, 那么 RUNX1 异构体的表达水平是否与疾病的预后相关呢? 本研究通过分析急性白血病患者初诊时 RUNX1 异构体 RUNX1a 和 RUNX1b/c 的表达水平与半年生存率 首疗程化疗后不同缓解状态 初诊时白细胞计数以及 AL-ETO 融合基因之间的关系, 探讨了急性白血病患者 RUNX1 异构体 RUNX1a 和 RUNX1b/c 的表达水平与疾病预后的相关性 结果发现急性白血病患者初诊时 RUNX1a 和 的表达水平在死亡组与存活组之间的比较差异均无统计学意义, 提示患者初诊时 RUNX1 异构体的表达水平与半年生存率无关, 这与先前的报道 AL 患者初诊时 RUNX1-RUNX1T1 转录水平与无复发生存 总生存 [24] 率均无明显相关基本一致, 但本研究中的患者随访时间较短, 仍需要延长随访时间观察比较, 以进一步明确 RUNX1 异构体的表达水平与生存率的相关性 本研究还分析了 AL 患者首疗程化疗后 CR 与 NCR 患者初诊时 RUNX1a RUNX1b/c 的表达水平, 结果发现 CR 与 NCR 患者初诊时 RUNX1a RUNX1b/c 的表达水平无明显差异, 提示患者初诊时 RUNX1 异构体的表达水平可能与预后无关 目前认为初诊时高白细胞计数是预后不良的因素, 但本研究发现高白细胞组 RUNX1a RUNX1b/c 的表达水平虽然较非高白细胞组有升高趋势, 但差异不具有统计学意义, 说明患者初诊时 RUNX1 异构体的表达水平与白细胞计数无相关性, 也提示其表达水平可能与预后无关 单纯 AL-ETO 融合基因阳性被认为是 AL 预后良好的遗传学因素, 本研究发现,AL1-ETO 融合基因阳性的 AL 患者 RUNX1a 表达水平较阴性患者升高, 说明 AL 患者 RUNX1a 过表达与 AL1-ETO 融合基因阳性有相关性, 间接提示 RUNX1a 高表达可能

杨志刚, 等.RUNX1 异构体在急性白血病中的表达及临床意义 627 通过与 AL1-ETO 融合基因阳性相关参与 AL 发病, 但与疾病预后无关 白血病 RD 监测对于评估疗效和早期发现高 [25] 复发风险的患者至关重要, 研究发现, 对 AL-ETO 融合基因阳性的患者造血干细胞移植前后进行基于 RUNX1/RUNX1T1 转录水平的 RD 监测能够预测疾病复发风险 那么 RUNX1 的异构体 RUNX1a 和 RUNX1b/c 是否可以作为监测化疗后 RD 的有效指标, 目前尚未见报道 本研究对 13 例急性白血病患者从初治到连续两个疗程化疗后 RUNX1 异构体的表达水平进行追踪检测, 结果发现大多数患者 RUNX1a 和 RUNX1b/c 表达水平随化疗疗程 疾病的缓解而下降, 复发时又明显上升甚至超过初治时的表达水平 这可能是因为化疗药物直接杀伤清除白血病细胞减少了肿瘤细胞负荷从而降低 RUNX1 的表达量, 这项结果与同一急性白血病患者初诊与 CR 时配对分析结果一致, 均提示 RUNX1 异构体的表达水平与临床疗效相关, 有望作为白血病 RD 监测指标之一 对于本研究中存在少数患者在 R CR 时 RUNX1 异构体表达水平高于初治时的情况, 追踪患者临床资料发现这些患者检测时均处于细菌或病毒感染活动期, 随着感染因素去除, 其表达水平亦随之下降 推测某些病原体感染可能会影响 RUNX1 表达水平, 甚至可能通过 RUNX1 的过表达而导致白血 [26-27] 病发生 发展 这一推测在最近报道的动物实验研究中也初步得到证实, 该研究发现病原体感染的存在可以诱导 Sca1-ETV6-RUNX1 小鼠发展为 B 细胞 ALL 因此, 关于 RUNX1 与病原体感染的关系以及在白血病发病中的作用值得进一步研究 综上所述, 本研究发现 RUNX1a 异构体参与了急性白血病的发病, 并且与 AL 的复发相关 ; RUNX1a 和 表达水平可能与急性白血病的预后无关, 但与临床疗效相关, 可作为疾病疗效判断的指标 ; 动态监测 RUNX1a 和 RUNX1b/c 异构体的表达水平可以作为化疗后 RD 监测的有效指标, 用于评估疗效 早期识别复发风险 [ 参考文献 ] [1] VOON D C, HOR YT, ITO Y. The RUNX complex: reachig beyod haematopoiesis ito immuity[j]. Immuology, 2015, 146(4): 523-536. DOI: 10.1111/imm.12535. [2] ICHIKAWA, YOSHII A, NAKAGAWA, et al. A role for RUNX1 i hematopoiesis ad myeloid leukemia[j]. It J Hematol, 2013, 97(6):726 734. DOI: 10.1007/s12185-013-1347-3. [3] SOOD R, KAIKUBO Y, LIU. Role of RUNX1 i hematological maligacies[j]. Blood, 2017, 129(15): 2070-2082. DOI: 10.1182 / blood-2016-10-687830. [4] COHEN-SOLAL K A, BOREGOWDA R K, LASFAR A. RUNX2 ad the I3K /AKT axis reciprocal activatio as a drivig force for tumor progressio[j]. ol Cacer, 2015, 14(3): 137-147. DOI: 10. 1186/s12943-015-0404-3. [5] CHUANG L S, ITO Y. RUNX3 is multifuctioal i carciogeesis of multiple solid tumors[j]. Ocogee, 2010, 29(18): 2605-2615. DOI: 10.1038/oc.2010.88. [6] IYOSHI H, SHIIU K, KOU T, et al. t(8;21) breakpoits o chromosome 21 i acute myeloid leukemia are clustered withi a limited regio of a sigle gee, AL1[J]. roc Natl Acad Sci U S A, 1991, 88(116):10431 10434. [7] TANAKA T, TANAKA K, OGAWA S, et al. A acute myeloid leukemia gee, AL1, regulates hemopoietic myeloid cell differetiatio ad trascriptioal activatio atagoistically by two alterative spliced forms[j]. EBO J, 1995, 14(2): 341-350. [8] LIU X, HANG Q, HANG D E, et al. Over expressio of a isoform of AL1 i acute leukemia ad its potetial role i leukemogeesi[j]. Leukemia, 2009, 23(4): 739-745. DOI: 10.1038 / leu. 2008.350. [9] TSUUKI S, HONG DL, GUTA R, et al. Isoform-specific potetiatio of stem ad progeitor cell egraftmet by AL1/RUNX1[J]. LoS Oe, 2007, 4(14):880-896. DOI: 10.1371/joural.pmed.0040172. [10] TSUUKI S, SETO. Expasio of fuctioally defied mouse hematopoietic stem ad progeitor cells by a short isoform of RUNX1 / AL1[J]. Blood, 2012, 119(3): 727-735. DOI: 10.1182 / blood-2011-06-362277. [11] RAN D, SHIA WJ, LO C, et al. RUNX1a ehaces hematopoietic lieage commitmet from huma embryoic stem cells ad iducible pluripotet stem cells[j]. Blood, 2013, 121(15): 2882-2890. DOI: 10.1182/blood-2012-08-451641. [12] GUO H, A O, SECK N A, et al. Rux1 deletio or domiat ihibitio reduces Cebpa trascriptio via coserved promoter ad distal ehacer sites to favor moopoiesis over graulopoiesis[j]. Blood, 2012, 119(19): 4408-4418. DOI: 10.1182 / blood-2011-12- 397091. [13] WOLYNIEC K, WOTTON S, KILBEY A, et al. RUNX1 ad its fusio ocoprotei derivative, RUNX1-ETO, iduce seescece-like growth arrest idepedetly ofreplicative stress[j]. Ocogee, 2009, 28(27): 2502-2512.DOI: 10.1038/oc.2009.2502. [14] WOTTON S F, BLYTH K, KILBEY A, et al. RUNX1 trasformatio of primary embryoic fibroblasts is revealed i the absece of p53[j]. Ocogee, 2004, 23(32): 5476-5486. DOI: 10.1038/oc.2004.5476. [15] VARDIAN J W, THIELE J, ARBER D A, et al. The 2008 revisio of the World Health Orgaizatio (WHO) classificatio of myeloid eoplasms ad acute leukemia: ratioale ad importat chages[j]. Blood, 2009, 114(5):937-951. DOI: 10.1182/blood-2009-03-209262. [16] SILVA F, OROLLI B, STORLAI C T, et al. Idetificatio of RUNX1/AL1 as a classical tumor suppressor gee[j].ocogee, 2003,22(4):538-547. DOI: 10.1038/sj.oc.1206141. [17] GOYAA S, SCHIBLER J, CUNNINGHA L, et al. Trascriptio factor RUNX1 promotes survival of acute myeloid leukemia cells[j]. J Cli Ivest, 2013, 123(104): 3876-3888. DOI: 10.1172 / JCI68557. [18] GOYAA S, HUANG G, KUROKAWA, et al. osttraslatioal modificatios of RUNX1 as potetial aticacer targets[j]. Ocogee, 2015, 34: 3483-3492. DOI: 10.1038/oc.2014.305

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