Animal Tissue Direct qpcr Kit-SYBR Green I Cat.No.DQS-0111T/01111/01112/01113 Animal Tissue Direct qpcr Kit(UNG)-SYBR Green I Cat.No.DQS-0112T/01121/01122/01123 For animal tissue direct qpcr using 10mg tissue For performing qpcr directly from animal tissue without prior DNA purification Research use only Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 1/16
目录 产品介绍........ 3 产品特点........... 4 试剂盒应用............. 4 产品质量控制............ 4 试剂盒内容.......... 5 试剂盒组分信息.......... 6 储存条件...... 7 注意事项............ 7 操作前准备事项............. 8 实验材料和设备............... 8 安全性.............. 8 操作指南......... 9 动物组织直接 qpcr 操作步骤......... 9 对照反应............... 11 操作示意图.............. 12 问题分析指南............... 13 Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 2/16
产品介绍 本产品采用独特的裂解缓冲液体系, 可以快速的从动物组织样本中释放出基因组 DNA, 用于 qpcr 反应, 因此特别适合大规模基因检测 裂解缓冲液释放基因组 DNA 过程在 65 条件下 10-30 min 内完成, 不需要其他去蛋白 RNA 等 PCR 抑制剂的过程, 即可将释放出的微量 DNA 作为模板进行 qpcr 反应 2 qpcr Easy TM Mix-SYBR 具有很强的 PCR 反应抑制物耐受性, 能直接以动物组织的裂解混合液为模板, 进行高效特异性扩增 该试剂包含 Taq DNA 聚合酶 dntps MgCl 2 反应缓冲液 PCR 优化剂和稳定剂以及优化配比的 SYBR Green I 与裂解缓冲液配合使用能够快速简便地对样品进行检测, 并具有灵敏度高 特异性强 稳定性好等特点 2 qpcr Easy TM Mix(UNG)-SYBR 在 2 qpcr Easy TM Mix-SYBR 的基础上用 dutp 替代了 dttp, 并同时加入能够降解含有 dutp 模板的 UNG 酶 (Uracil-N-glycosylase) 在 PCR 反应前, 利用 UNG 酶降解含有尿嘧啶的 PCR 产物,UNG 酶对不含有尿嘧啶的模板不会造成任何影响, 从而保证扩增的特异性和准确性, 防止了大规模基因检测时可能出现的 PCR 产物污染问题 Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 3/16
产品特点 无需进行费时而昂贵的 DNA 纯化 样品需求量小, 只需 5-10mg 动物组织即可 无需研磨 破碎等特殊处理, 操作简便 优化的 qpcr 体系, 使 PCR 具有更高的特异性 更强的 PCR 反应抑制物耐受性 防污染 PCR 体系 2 qpcr Easy TM Mix(UNG)-SYBR, 有效消除由 PCR 产物所引起的污染, 保证扩增的特异性和准确性 试剂盒应用 适用范围 : 多种动物组织 样本裂解释放的 DNA: 仅用作 PCR 模板 试剂盒可用于以下用途 : 转基因鉴定 基因分型等 产品质量控制 按照福际生物试剂盒质量检测体系标准, 每一批次的动物组织直接 qpcr 系列试剂盒 -SYBR Green I 都严格进行多次测试, 确保每一批次试剂盒质量的可靠性和稳定性 Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 4/16
试剂盒内容 Animal Tissue Direct qpcr Kit-SYBR Green I 动物组织直接 qpcr 试剂盒 -SYBR Green I 试剂盒组成 DQS-0111T DQS-01111 DQS-01112 DQS-01113 50 次 200 次 500 次 2000 次 Part I Part II Buffer QAL 5ml 20ml 50ml 100ml 2 Foregene Protease 220μl 880μl 1.1ml 2 8.8ml 2 qpcr Easy TM Mix-SYBR 500μl 1ml 2 1.7ml 3 1.7ml 12 50 ROX Reference Dye 100μl 400μl 1ml 2 1ml 4 说明书 1 份 1 份 1 份 1 份 Animal Tissue Direct qpcr Kit(UNG)-SYBR Green I 动物组织直接 qpcr 试剂盒 (UNG)-SYBR Green I 试剂盒组成 DQS-0112T DQS-01121 DQS-01122 DQS-01123 50 次 200 次 500 次 2000 次 Part I Part II Buffer QAL 5ml 20ml 50ml 100ml 2 Foregene Protease 220μl 880μl 1.1ml 2 8.8ml 2 qpcr Easy TM Mix(UNG)-SYBR 500μl 1ml 2 1.7ml 3 1.7ml 12 50 ROX Reference Dye 100μl 400μl 1ml 2 1ml 4 说明书 1 份 1 份 1 份 1 份 Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 5/16
试剂盒组分信息 Buffer QAL: 提供动物组织裂解反应所需的环境 Foregene Protease: 在 Buffer QAL 环境下, 裂解动物组织, 释放基因组 DNA 2 qpcr Easy TM Mix-SYBR: 包含福际生物特别改造的 Taq DNA Polymerase dntps MgCl 2 反应缓冲液 优化配比的 SYBR Green I PCR 反应增强剂 优化剂以及稳定剂等 qpcr 反应时, 只需将适当的裂解混合液 引物 ddh 2 O 添加到 2 qpcr Easy TM Mix-SYBR 中即可用于 qpcr 反应 2 qpcr Easy TM Mix(UNG)-SYBR: 在 2 qpcr Easy TM Mix-SYBR 的基础上用 dutp 替代了 dttp, 并同时加入能够降解含有 dutp 模板的 UNG 酶, 从而能够有效防止 PCR 扩增产物污染 ROX Reference Dye: 只使用在 ABI Stratagene 等公司的荧光定量 PCR 仪上, 用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差 ( 具体用量见表 1) Roche Bio-Rad Eppendorf 等荧光定量 PCR 仪时不必使用 ( 当使用以上未提及仪器时, 请参考仪器的说明书或与仪器厂家联系进行确认是否需要加入 ROX Reference Dye 进行校正 ) 表 1: 不同荧光定量 PCR 仪中 ROX Reference Dye 的用量 荧光定量 PCR 仪 ABI PRISM7000/7300/7700/ 7900HT/Step One 等 ROX Reference Dye 终浓度 5 ( 如 20μl 体系, 加入 2μl 50 ROX Reference Dye) ABI 7500/7500 Fast 和 Stratagene Mx3000P/Mx3005P/Mx4000 等 1 ( 如 20μl 体系, 加入 0.4μl 50 ROX Reference Dye) Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 6/16
储存条件 1. 输运条件 全程低温冰盒运输, 保证试剂盒 Part I Part II 处于 <4 状态 2. 保存条件 本试剂盒 Part I 保存在 2-8 试剂 Buffer QAL, 在干燥条件下, 可保存 12 个月 ; 如需保存更长时间可置于 2 8 注意 : 若低温保存, 溶液容易产生沉淀 在使用前务必将试剂盒内的溶液在室温中放置一段时间, 必要时可在 37 水浴中预热 10 分钟, 以溶解沉淀, 混匀后再使用 试剂 Foregene Protease, 为保证其更好的活性和稳定性, 请保存于 4 本试剂盒 Part II 保存在 -20 试剂 2 qpcr Mix, 若频繁使用, 也可置于 4 短期保存 ( 限 10 天内用完 ) 试剂 50 ROX Reference Dye,-20 避光保存 注意事项 :( 请务必在使用试剂盒前仔细阅读注意事项 ) 注意实验用具的清洁以及实验的操作手法, 避免样本间的交叉污染 请尽量使用新近采取的动物组织样本进行实验, 若组织样本存储较长时间, 请避免样本反复冻融 若 Buffer QAL 有沉淀析出, 可放置于 37 待沉淀消失, 并摇匀溶液后再使用 Foregene Protease 具有独特配方, 请置于 4 存储, 切勿置于 -20 2 qpcr Mix 应避免反复冻融, 否则会影响 PCR 效率 2 qpcr Mix 含有 SYBR Green I, 请避光保存 2 qpcr Mix 冻存后可能会产生白色或淡黄色的沉淀 为了避免沉淀导致溶液成分不均匀, 试剂解冻后于室温条件下, 轻柔上下颠倒混匀数次直至完全溶解, 轻微离心后再使用 Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 7/16
操作前准备事项 使用本试剂盒前, 请务必仔细阅读说明书 动物组织直接 qpcr 系列试剂盒操作简单 方便 快速, 说明书提供了整个试剂盒的完整信息和正确使用方法 请在使用前准备好必要的实验材料和设备 实验材料和设备 各种来源的动物组织 ( 新鲜的 冷冻保存的 ) 1.5ml 或 2ml 无菌离心管 0.2ml 无菌 PCR 管 台式离心机 ( 13,400 g) 荧光定量 PCR 仪 金属浴 移液器等 安全性 本产品仅供科研使用, 请勿用于医药 临床医疗 食品及化妆品等用途 使用化学品时, 穿戴合适的实验服, 手套, 防护眼镜等 Foregene Protease: 增敏剂, 刺激性 Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 8/16
操作指南 预防样本间交叉污染 为了避免样本间交叉污染, 每次取样后都需要将取样器材的刃口或与样本直接接触的部位浸入 2% 次氯酸钠溶液中, 反复洗刷数次进行清洗, 然后用干净的纸巾擦干残余液体后再进行使用 为了实验方便, 也可准备多个取样器材, 在使用完后进行统一清洗, 确保每一单独样本均使用的是无污染的取样器材 操作说明 : 动物组织直接 qpcr 操作步骤 A. 样本 DNA 释放 1. 根据准备取用的组织块大小, 按照每 100μl Buffer QAL 加入 4μl Foregene Protease 的比例配制成裂解液, 轻微涡旋混匀后加入离心管中 注意 : Buffer QAL 与 Foregene Protease 混合后不宜长期保存, 配制后请尽快使用 2. 剪取 5-10mg 动物组织放入上述离心管中, 轻微涡旋混匀, 确保裂解液能够浸没组织 3. 65 孵育 10-30min, 然后 95 处理 5min 注意 : 65 孵育, 一般只需 10min 即可满足多数 PCR 需求 若需要的 DNA 量较大或样品较难酶解, 可以将时间延长至 30min( 其间每间隔 10min 涡旋振荡一次以帮助裂解 ) 4. 短暂离心, 转移上清至新的离心管,4 ( 可保存 20 天 ) 或 -20 放置备用或直接用于 PCR 扩增 B. qpcr 反应鉴定 1. 将 2 qpcr Mix 和其它冻存组分置于冰上解冻, 单独混匀后置于冰上待用 注意 : 解冻后的 2 qpcr Mix 可能会出现白色或淡黄色沉淀, 可于室温条件下, 轻柔上下颠倒混匀数次直至完全溶解 ( 请勿使用涡旋仪振荡混匀 ), 轻微离心后再使用 Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 9/16
2. 在离心管中按比例加入反应所需的 2 qpcr Mix (ROX) 引物 H 2 O 制备成 PCR 预混液 ( 见表 2) 置于涡旋仪上充分涡旋混匀后, 瞬时离心将预混液集于管底, 并分装至适当的 PCR 反应管中 3. 取适量的 A 步骤得到的裂解混合液作为模板加入上述配制的 qpcr 体系中 ( 已分装到 PCR 管中的 PCR 体系 ) 注意 : 以裂解产物作为模板时, 加入量以 PCR 体系的 5-10% 之间最佳, 不能超过 20% 如 20μl 的 PCR 体系中, 加入 1-2μl 裂解产物即可, 但不能超过 4μl 4. 将反应管放入荧光定量 PCR 仪, 根据优化好的 PCR 条件 ( 退火温度等 ) 进行 PCR 反应 ( 见表 3) 注意 : 尽量使用优化后的条件进行 PCR 反应, 可以得到更好的结果 表 2:qPCR 反应体系配制 PCR 体系添加内容 20μl 反应体系 50μl 反应体系终浓度 2 qpcr Mix 1* 10μl 25μl 1 50 ROX Reference Dye - - 2* Forward Primer (10μM) 0.5μl 1.25μl 0.25μM 3* Reverse Primer (10μM) 0.5μl 1.25μl 0.25μM 3* DNA 模板 4* Xμl Xμl ddh 2 O( 灭菌蒸馏水 ) Add to 20μl Add to 50μl 1*: 根据试剂盒的不同,2 qpcr Mix 分别为 :2 qpcr Easy TM Mix-SYBR 或 2 qpcr Easy TM Mix(UNG)-SYBR 2*: 根据不同的荧光定量 PCR 仪, 选择合适终浓度的 ROX Reference Dye 常见荧光定量 PCR 仪的 最适 ROX Reference Dye 浓度参照组分信息中表 1( 第 6 页 ) 3*: 通常引物终浓度为 0.25μM 可以得到较好结果 反应性能较差时, 可以在 0.1-0.5μM 范围内调整 引物浓度 4*: 裂解产物作为 PCR 模板, 加入量在 PCR 体系 5-10% 之间最佳, 实际操作可进行模板加入量条件 摸索, 找到最佳模板用量 表 3:qPCR 反应条件 步骤 温度 时间 循环数 内容 1 37 5 min 1 UNG 酶处理 1* 2 95 5 min 1 灭活 UNG 酶 & 预变性 3 94 10sec 35-40 变性 Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 10/16
4 60-66 2* 20-30sec 退火 / 延伸 / 荧光采集 5 65-95 仪器默认设置绘制溶解曲线 1*: 可选步骤, 使用 2 qpcr Easy TM Mix(UNG)-SYBR 时, 通过该步骤有效去除污染 ; 若使用 2 qpcr Easy TM Mix-SYBR 可跳过该步骤 2*: 推荐退火 / 延伸温度为 60 在具体操作中, 需要根据目的片段大小 扩增片段的碱基序列和引物的 GC 含量及长短等具体情况在 60-66 范围内优化 若两步法 PCR 反应性能较差时, 可变更为三步法 PCR 程序 PCR 对照反应 在 qpcr 结果分析时, 不管是阳性结果或阴性结果, 如果没有对照反应, 我们都不能确定结果是否可靠 为了便于后续实验结果的分析, 我们建议在进行 PCR 时, 设置阳性和阴性 PCR 对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰 A: 阳性对照 采用纯化的样本 DNA(50-200ng) 作为模板, 加入 PCR 预混液作为阳性对照, 以确定 qpcr 反应体系和条件的正确性以及 2 qpcr Mix 有效性 B: 阴性对照 建议在每次实验过程中都加入除 DNA 模板外的 PCR 反应体系作为阴性对照, 以监控 实验过程中是否存在污染 Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 11/16
操作示意图 Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 12/16
问题分析指南 以下针对动物组织直接 qpcr 系列试剂盒在动物组织直接 qpcr 实验中可能遇到的问题进行分析, 希望能对您的实验有所帮助 另外, 对于在操作说明和问题以外的其他实验或技术上的问题, 我们设有专门的技术支持帮助您 如有任何需要可联系我们 : 028-83361257 或 E-mali:Tech@foregene.com 正对照 待测样本均无目的片段的扩增信号或 Ct 值过大 1. 荧光定量 PCR 仪的设置不正确 建议 : 确保荧光定量 PCR 仪在荧光的采集步骤 种类以及检测位置等参数设置正确, 然后再进行实验 2. PCR 试剂保存不当失去活性 建议 :2 qpcr Mix 应保存于 -20, 使用时避免反复冻融 若使用频繁, 可在 4 短时间存放 3. qpcr 反应条件不合适 建议 : 使用推荐的 PCR 程序进行实验 必要时, 以纯化 DNA 为模板对反应条件进行优化后, 再进行大规模检测 4. 扩增产物过长 建议 :PCR 扩增产物长度以 60bp~200bp 为宜, 不能超过 300bp 5. 引物浓度不合适 建议 : 适当调整反应体系中引物的浓度 6. 引物设计问题 建议 : 尝试重新设计引物进行检查 实验重复性差 1. 未引入校正系统 建议 : 根据各自荧光定量 PCR 仪的要求, 进行系统校正 2. 加样误差 建议 : 规范使用微量移液器, 使用硅化处理后的枪头进行加样 3. 反应管侧壁残留液体或有气泡 建议 : 进行扩增反应之前, 将完成加样的反应管进行瞬时离心, 仔细检查反应管内是否有气泡残留 4. 模板浓度太低或抑制物浓度过高 Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 13/16
建议 : 适当调整模板用量 5. 反应体系过小 建议 : 适当增大 PCR 反应体系 溶解曲线出现多峰 1. 退火温度偏低 建议 : 使用三步法进行实验, 并对退火温度做一个梯度摸索 2. 引物浓度偏高 建议 : 适量降低引物用量 通常引物终浓度为 0.25μM 可以得到较好结果 反应性能较差时, 可以在 0.1-0.5μM 范围内调整引物浓度 3. 模板浓度太低或抑制物浓度过高 建议 : 适当调整模板用量 正对照扩增信号正常, 待测样本无目的片段的扩增信号或 Ct 值过大 1. 样本及其裂解产物保存不当或保存时间过久,DNA 基因组已经降解 建议 : 尽量使用新鲜样本, 制备好的裂解产物尽快进行 qpcr 检测 2. 裂解产物中抑制物过多 建议 : 在 PCR 反应体系 5-10% 范围内优化模板加入量 3. PCR 循环数不足 建议 : 适当增加 PCR 的循环数, 推荐在 35-40 循环为佳 空白对照出现目的片段的扩增曲线 1. 操作工具或试剂污染 建议 : 实验所有试剂或器材均应高压灭菌 操作时应小心轻柔, 防止将样品吸入加样枪内或溅出离心管外 2. 样本间交叉污染 建议 : 每个取样器只对一个样本使用 ; 或取完一个样本后, 将取样器刃口浸入 2% 的次氯酸钠溶液中, 反复涮洗, 然后用干净的纸巾擦干残液 3. PCR 产物污染 建议 : 如果实验室经常检测同类型样本, 最好使用含 UNG 防 PCR 产物污染系统的试剂盒进行实验 Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 14/16
使用 ROX 燃料校正后的荧光信号不正常 1. ROX Reference Dye 加入量过多或过少 建议 : 根据表 1 的推荐用量的 ROX Reference Dye 2. 荧光定量 PCR 颜色校正不准确 建议 : 根据荧光定量 PCR 说明进行重新校正 Copyright Foregene 2016/04. All rights reserved. 15/16
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