Order: 010-59822688 Toll-free: 800-990-6057 /400-810-6057 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD 版本号 : EP170330 TIANSeq DNA Library Prep Kit ( ion torrent) TIANSeq DNA 文库构建试剂盒 (ion torrent 平台 ) 目录号 :NG104 产品内容 产品组成 End-Repair Mix Ligation/Nick Repair Mix NG104-01 (24 rxn) 24 支 24 支 储存条件试剂盒中 End-Repair Mix 和 Ligation/Nick Repair Mix 可于室温下 (15~25 ) 保存, 保质期为一年 试剂盒中未使用完的组份 ( 末端修复 连接 / 切刻修复试剂冻干粉 ) 经自封铝箔袋封装后可在室温条件下保存 铝箔袋开封后请勿丢弃其中的干燥剂, 并在 2 个月内用完所有组份 本产品仅供科研使用 请勿用于医药 临床治疗 食品及化妆品等用途
产品简介 TIANSeq DNA Library Prep Kit for ion torrent 是专门针对于 ion torrent 高通量测序平台所优化的 DNA 文库构建试剂盒 由末端修复 (End-Repair Mix) 和连接 / 切刻修复 (Ligation/Nick Repair Mix) 两个模块构成 与同类试剂不同的是 : 本产品所含有的模块均为一管式包装, 且经特殊工艺加工呈冻干粉状, 极大增强了试剂稳定性, 可在室温条件下运输, 保存和实验操作, 省去了体系配制, 低温保藏等繁琐操作, 使得操作更加简便, 文库转化效率更高 适用范围 : 适用于 ion torrent 高通量测序平台 DNA 文库构建 适用样本量 :10 ng~1 µg DNA 推荐使用的其他试剂 1. TIANSeq Fragmentation Module (NG305-01/02) 2. TIANSeq NGS Library Amplification Module (NG304-01/02) 3. BECKMAN Agencourt AMPure XP 磁珠 产品特点 1. 冻干粉形式, 单管酶促反应, 一管完成一步反应 2. 高文库转化效率, DNA 样本起始量可低至 10 ng 3. 操作简便, 省去体系配制, 低温保藏等步骤 注意事项请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项 1. 操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染 2. 请使用不含 RNA 酶或 DNA 酶的枪头 EP 管进行试验 3. 试验开始前, 请清洁操作台, 并使用 RNA 酶及 DNA 酶清除试剂, 如 RNase Away (Molecular BioProducts, Inc) 处理台面 确保没有 RNA 酶和 DNA 的污染 4. 进行文库扩增前, 请确保 PCR 仪已经调试好并处于稳定的状态 5. 试验前请仔细阅读说明书, 如果需要暂停试验, 或者无需立即进行下游试验 可根据说明书推荐将试验产物保存于 -20 并安排后续试验 6. 若使用本公司 TIANSeq Fragmentation Module (NG305-01/02) 进行 DNA 片段化, 由于该产品所进行的片段化过程为酶促反应, 故片段化过程对反应温度 反应时间 体系配制以及 DNA 上样量等因素较为敏感 强烈推荐用户按照本说明书所述步骤及优化的反应参数 ( 如反应时间等 ) 进行试验 2
操作步骤一 DNA 片段化本试剂盒不包含 DNA 片段化相关试剂 对于 DNA 的片段化过程, 客户可在超声处理 化学处理和酶处理等常用方法中选择, 具体操作请参考相关产品说明 推荐产品为天根 TIANSeq Fragmentation Module (NG305-01/02) 试剂盒, 当然也可选择其他相关产品 二 末端修复 1. 沿锡箔纸封口袋顶部切口位置撕开试剂包装袋 2. 取出一支管盖呈蓝色的 1.5 ml 离心管用于末端修复反应 每支 1.5ml 离心管中所含的冻干粉试剂可供一次文库构建反应使用 3. 如有需要, 可瞬时离心以确保冻干粉聚集于离心管底 4. 按下表建立末端修复反应体系 : 组分双链 DNA(ds DNA) 片段 (10 ng-1000 ng) ddh 2 O 总体系 用量 X μl 100-X μl 100 μl 5. 用移液器轻柔吸打 6~8 次混匀反应体系 6. 25 孵育 20 min 7. 使用 AMPure @ XP 磁珠纯化末端修复产物 8. 纯化开始前将 AMPure @ XP 磁珠平衡至室温 9. 使用前将 AMPure @ XP 磁珠涡旋使其充分悬浮 10. 若反应管与磁力架不兼容, 可将末端补平反应液转移至与磁力架兼容的离心管中 注 : 此离心管须能够容纳 500 μl 液体 11. 每 100 μl 末端修复反应液中加入 180 μl AMPure @ XP 磁珠, 吸打混匀至少 5 次 12. 室温放置 5 min 13. 将含磁珠的反应液置磁力架上 3 min, 待溶液变清澈 3
13. 用移液器小心吸除上清, 注意在吸入上清的过程中不要扰动磁珠, 除去上清后管底剩余少量液体不影响后续试验 14. 保持反应管置于磁力架上, 向反应管管底轻柔加入 500 μl 80% 乙醇 ( 注意不要扰动磁珠 ), 室温孵育 30 sec 15. 小心去除 80% 乙醇 (~500 μl), 不要扰动磁珠 16. 用 80% 乙醇重复洗涤一次 ( 步骤 15-16) 17. 将反应管瞬时离心后置于磁力架上, 使用 <20 μl 量程的移液器小心去除管底残留的乙醇 18. 将反应管开盖置于磁力架上, 室温干燥 10~15 min 注 : 本试剂盒的操作流程需要在下一个模块 ( 连接 / 切刻修复过程 ) 进行之前将末端修复产物与接头进行预混, 因此在磁珠干燥期间请计算预混末端修复产物与接头过程中所需的 DNA 量 (X) 预混末端修复产物与接头的体系如下表所示 组分末端修复得到的 DNA 纯化产物接头溶液总体系 用量 X+2.5 μl Y μl 102.5 μl 注 : 本产品中不包含接头溶液, 一般情况下, 建议接头的加入量为文库 DNA 摩尔量的 10 倍 也可参考接头供应商的说明书操作 19. 将反应管从磁力架上取下, 加入 (X+2.5) μl 洗脱缓冲液 (10 mm Tris-HCl, ph8.0; 10mM Tris, 0.1 mm EDTA, ph 8.0 或者去离子水 ) 用移液器吸打使磁珠悬浮 20. 加入 Y μl 接头溶液 (Y 值计算方法参照上表所示 ), 混匀后将反应管置于磁力架上 3 min, 待溶液澄清, 小心吸取上清至新离心管 注 : 为了防止文库 DNA 片段的相互连接或接头自连, 此步纯化得到的文库 DNA 片段必须先与适量接头溶液混合后才可添加至 Ligation/Nick Repair Mix 冻干粉中 21. 立刻进入连接 / 切刻修复程序或将产物保存于 -20 ( 末端修复产物可在 -20 保存 7 天 ) 4
三 连接 / 切刻修复 1. 沿锡箔纸封口袋顶部切口位置撕开试剂包装袋 2. 取出一支管盖呈红色的 1.5 ml 离心管用于末端修复反应 每支 1.5 ml 离心管中所含的冻干粉试剂可供一次文库构建反应使用 3. 如有需要, 可瞬时离心以确保冻干粉聚集于离心管底 4. 取 100 μl 末端补平 DNA 与接头溶液的混合物, 添加至红色反应管中 5. 用移液器轻柔吸打 6~8 次混匀反应体系 6. 25 孵育 15 min 后, 再于 65 下处理 5 min 7. 使用 AMPure @ XP 磁珠纯化末端修复产物 8. 纯化开始前将 AMPure @ XP 磁珠平衡至室温 9. 使用前将 AMPure @ XP 磁珠涡旋使其充分悬浮 10. 若反应管与磁力架不兼容, 可将末端补平反应液转移至与磁力架兼容的离心管中 ( 注意 : 此离心管须能够容纳 500 μl 液体 ) 11. 对于 100 bp 读长的文库, 则每 100 μl 连接 / 切刻修复反应液中加入 140 μl AMPure @ XP 磁珠 ; 对于 200-300 bp 读长的文库, 则每 100 μl 连接 / 切刻修复反应液中加入 180 μl AMPure @ XP 磁珠 吸打 5 次混匀 12. 室温放置 5 min 13. 将含磁珠的反应液置磁力架上 3 min, 待溶液变清澈 14. 用移液器吸除上清 注意在吸入上清的过程中不要扰动磁珠, 除去上清后管底剩余少量液体不影响后续试验 15. 保持反应管置于磁力架上, 向反应管管底轻柔加入 500 μl 80% 乙醇 ( 注意不要扰动磁珠 ), 室温孵育 30 sec 16. 小心去除 80% 乙醇 (~500 μl), 不要扰动磁珠 17. 用 80% 乙醇重复洗涤一次 ( 步骤 15-16) 18. 将反应管瞬时离心后置于磁力架上, 使用 <20 μl 量程的移液器小心去除管底残留的乙醇 19. 将反应管开盖置于磁力架上, 室温干燥 5 min 磁珠干燥期间请计算片段筛选过程中所需的 DNA 量 (Z) 5
注 : 由于不同的片段选择方法所需的上样量不同, 用户可以根据后续片段筛选方法确定连接 / 切刻修复产物的的洗脱体积 (Z+2.5 μl) 其中, 推荐 Z 的取值范围为 :20 Z 100 如果不进行片段筛选, 则推荐再次使用 AMPure @ XP 磁珠进行纯化以降低接头污染 (50 μl 接头连接产物加入 50 μl 磁珠,Z=50 μl) 如果不明确如何选择 Z 值, 请参阅说明书第四部分 20. 将反应管从磁力架上取下, 加入 (Z+2.5) μl 洗脱缓冲液 (10 mm Tris-HCl, ph8.0; 10mM Tris, 0.1 mm EDTA, ph 8.0 或者去离子水 ) 用移液器吸打使磁珠悬浮 21. 将反应管置于磁力架上 3 min, 待溶液澄清 小心吸取上清至新离心管 22. 小心吸取上清 Z μl 至新离心管, 直接进入说明书第四部分或将产物保存于 -20ºC( 接头连接后的 DNA 产物可在 -20 ºC 保存 7 天 ) 四 片段筛选若使用 ion torrent 平台进行测序或进行基因组测序, 文库 DNA 片段平均大小应为 200-390 bp( 包含接头 ) 片段筛选步骤即旨在特异性地回收得到这部分片段, 而去除过大或过小的双链及单链 DNA 片段 以下是常用的片段筛选方法, 以及使用这些方法时所需要的连接产物体积 (Z) 1. 琼脂糖凝胶回收 (Z=20 μl); 2. Sage Science Pippin PrepTM(Z=30 μl); 3. Life TechnologiesTM E-Gel @ SizeSelectTM Gels(Z=20 μl); 4. 基于磁珠的片段筛选方法 (Z=100 μl) 注 : 片段筛选步骤一般在接头连接后进行, 以控制文库中 DNA 片段大小 但用户也可以根据自身需要在末端修复完成后即进行片段筛选 五 文库扩增本试剂盒不含 PCR 试剂及引物 用户需要自行选择 PCR 试剂, 并根据文库 DNA 上样量确定扩增循环数 PCR 结束后, 可使用 AMPure @ XP 磁珠 (Cat# A63881) 对产物进行纯化, 并使用凝胶电泳 Qubit @ qpcr 以及 Angilent 生物分析仪对纯化后的 DNA 文库进行分析 推荐试剂为 TIANGEN 的 TIANSeq NGS Library Amplification Module (NG304), 但相关引物需要客户自己准备 6
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