第 27 卷第 4 期 2018 年 8 月 CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY Vol.27.No.4 August.2018 肝刺激因子促进过氧化氢诱导的肝星形细胞凋亡,, * ( 首都医科大学细胞生物学系肝脏保护与再生北京重点实验室, 北京 100069) 摘要 目的肝刺激因子 (hepatic stimulator substance, HSS) 可以抑制肝纤维化, 而且在肝星形细胞中表达, 但是其在肝星形细胞中的作用尚不清楚 因此本研究探讨肝刺激因子对肝星形细胞凋亡的影响, 从而为研究 HSS 抑制肝脏纤维化的机制奠定基础 方法选择人肝星形细胞系 LX-2 作为研究对象, 利用瞬时转染的方法构建过表达 HSS 的细胞模型后, 使用 2.5μmol/L H 2 O 2 刺激细胞 20min 诱导细胞凋亡 ; 利用 Hoechst 33342 染色 TUNEL 染色 Annexin V-FITC/PI 流式细胞术检测细胞凋亡,caspase 3/7 活性检测试剂盒检测 caspase 3/7 活性, 进而分析 HSS 对 LX-2 细胞凋亡的影响 结果在 H 2 O 2 刺激下, 过表达 HSS 的细胞与转染对照质粒细胞相比,Hoechst 33342 染色显示细胞凋亡数目增多,TUNEL 染色阳性细胞数增多, 流式细胞术检测 Annexin V 和 PI 双阳性细胞数显著增多,caspase 3/7 活性显著性升高 结论 HSS 可以促进 H 2 O 2 诱导的肝星形细胞凋亡 关键词 肝刺激因子, 肝星形细胞, 细胞凋亡 中图分类号 R575.2 文献标识码 A DOI:10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2018. 04. 001 Hepatic stimulator substance promotes hydrogen peroxide induced apoptosis of hepatic stellate cells Ai Weilun, Dong Lingyue, An Wei * (Department of Cell Biology,Municipal Key laboratory for Liver Protection and Regulation of Regeneration,Capital Medical University, 100069 Beijing, China) Abstract Objective Hepatic stimulator substance (HSS) expressed in hepatic stellate cells (HSC) can inhibit liver fibrosis. However, its mechanism remains unclear. This study explored the effects of HSS on HSC apoptosis, which laid the foundation for researching on the mechanism of HSS attenuating liver fibrosis. Methods An immortalized HSC cell line LX-2, which transiently overexpressed pcdna3.0-hss or pcdna3.0-vector, was used in the experiments. Twenty-minute treatment of hydrogen peroxide at 2.5 μm was used to induce apoptosis of LX-2 cells. The effects of HSS on LX-2 cell apoptosis were evaluated using multiple approaches, including Hoechst 33342 nucleus stain, TUNEL assay, Annexin V-FITC/PI stain, and caspase 3/7 Activity. Results In response to hydrogen peroxide treatment, compared with control group, LX-2 cells overexpressing HSS showed an increased apoptosis marked by higher Hoechst 33342 nucleus intensity and TUNEL positive cells, as well as significantly higher Annexin V/PI-double positive cells and caspase 3/7 activities. Keywords Hepatic stimulator substance; hepatic stellate cell; cell apoptosis 肝纤维化 (liver fibrosis) 是肝脏受损后, 胶原等细胞外基质过度堆积的病理过程 [1] 肝星形细胞 (hepatic stellate cell,hsc) 是肝脏内的非实质细 收稿日期 2018-03-22 修回日期 2018-08-10 基金项目 国家自然科学基金资助(31571182) 作者简介 艾伟伦, 男 (1991 年 ), 汉族, 硕士研究生 * 通讯作者 (To whom correspondence should be addressed): anwei@ccmu.edu.cn 胞, 其活化是肝纤维化进程中细胞外基质最主要的 来源 HSC 活化并进而转分化为肌成纤维样细胞 的特征包括细胞的增殖 趋化 凋亡抑制和细胞外 基质的分泌 [3] 研究显示促进活化型 HSC 凋亡能够 减少活化型 HSC 的数量, 从而最终减轻肝脏纤维 化 [2] 因此认识其活化特征并探寻参与其中的关键 分子是研究肝纤维化细胞学机制的关键 肝刺激因 子 (hepatic stimulator substance,hss) 是从肝部分 切除术后初断乳的大鼠再生肝中提取的一种生物活 性蛋白 [4], 能够刺激肝脏再生, 并保护肝脏免受毒物 [2]
308 第 27 卷 损伤 [5] HSS 与细胞凋亡关系密切, 例如, 在非酒 精性脂肪肝病 (nonalcoholic steatohepatitis,nash) 模型中, 肝细胞的凋亡伴随着 HSS 表达的降低, 这 提示 HSS 与肝细胞凋亡存在密切的关系 [6] 此外, HSS 能够减少肝细胞内质网应激引起的损伤, 抑制 肝细胞凋亡 [7] 除肝细胞外,HSS 还在 HSC 中表达 [8] 然而,HSS 与 HSC 的凋亡之间的相关性仍然不 明 因此本实验建立 HSS 过表达 HSC 细胞模型后, 利用过氧化氢 (hydrogen peroxide,h 2 O 2 ) 构建活化 型 HSC 的凋亡模型 [9], 以此探究 HSS 对活化型 HSC 凋亡的影响 1 实验细胞和主要试剂 材料和方法 人肝星形细胞 LX-2 细胞系, 其表型为活化型 HSC( 本实验室保存 ) DMEM(Dulbecco s modified Eagle medium) Opti-MEM 培养基和胎牛血清 (fetal bovine serum,fbs)( 美国 Gibco 公司 ) 胰蛋白酶和蛋白酶抑制剂 ( 美国 sigma 公司 ) 细 胞裂解液 ( 北京索莱宝科技有限公司 ) pcdna3.0 质粒 (Invitrogen TM )( 美国 Thermo Fisher 公司 ) pcdna3.0-hss 质粒系本实验室前期构建 [7] 转染 试剂 (FuGENE HD)( 美国 Promega 公司 ) 兔 抗 HSS/ALR 多克隆抗体 兔抗 GAPDH 多克隆抗 体和山羊抗兔 IgG 抗体 ( 美国 proteintech 公司 ) Caspase-Glo 3/7 Assay 试剂盒 ( 美国 Promega 公 司 ) Hoechst 33342 荧光染料 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 荧光染料 Annexin V-FITC 细胞 凋亡检测试剂盒和一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试 剂盒 ( 红色荧光 )( 上海碧云天生物技术公司 ) 2 细胞培养和瞬时转染 LX-2 细胞系培养于 37,5% CO 2 培养箱中, 使 用含有 10%FBS 的 DMEM 培养过程中,3d 换液一 次, 待融合至 80%~90% 进行传代 将生长状态良好 的 LX-2 细胞按 2 10 5 个 / 孔接种于六孔塑料细胞培 养板中 培养 22h 至融合达 90%, 进行瞬时转染 取 4 支无菌 Eppendorf 管, 分别加入 Opti-MEM 培养基 100µl 然后向其中 2 支分别加入 2µg pcdna3.0-hss 和 pcdna3.0 质粒, 涡旋混匀, 室温静置 5min; 剩 余两只分别加入 6µl 转染试剂, 涡旋混匀, 室温静 置 5min 分别将各组质粒与转染试剂混匀, 室温静 置 20min 吸弃培养板中细胞培养液, 并用 PBS 轻柔洗去剩余培养基 将上述转染试剂和质粒混合液加入培养板中, 并添加含有 10% FBS 的 DMEM 至每孔液体终体积 2ml 转染 18h, 弃去含有转染试剂的培养基, 加入含有 10% FBS 的 DMEM 培养 3d 转染后的两组细胞, 分别命名为 HSS-Tr 组 (HSS 过表达组 ) 和 Vector-Tr( 质粒对照组 ) 转染完毕后, PBS 轻柔洗去培养板中培养基 2 次, 随后每孔加入含有 2.5μmol/L H 2 O 2 和 10% FBS 的 DMEM 1ml, 培养细胞 20min 厚, 收集细胞, 进行凋亡检测 3 Western blot 鉴定转染效率细胞转染完成后, 弃去培养基, 用 PBS 轻柔清洗培养板中剩余培养基 2 次 每孔加入 4 预冷的新鲜加入蛋白酶抑制剂的细胞裂解液 100µl 使用细胞刮刀将细胞收集至 Eppendorf 管中, 冰上裂解 30min, 每隔 10min 涡旋 30s, 共 3 次 4 12000r/min 离心 10min 后收集上清液, 用 BCA 法测定蛋白质浓度, 制备样本,99 变性 5min, 立即置于冰上, 进行 SDS- 聚丙烯酰氨凝胶电泳 (SDS-PAGE) 电泳后利用电转印的方法将蛋白质转移至 0.22µm PVDF 膜上, 步骤详见本实验室已发表文章 [10] 将膜放入 15ml 含有 5% 脱脂奶粉的 1 TBST 中, 室温摇床封闭 1h 按照 1:2500 的稀释比例将兔抗 HSS/ALR 多克隆抗体或兔抗 GAPDH 多克隆抗体加入到 0.5% 脱脂奶粉中, 配制第一抗体工作液 PVDF 膜浸于第一抗体工作液中 4 摇床过夜 1 TBST 漂洗 10min, 重复 3 次 按照 1:4000 的稀释比例将山羊抗兔 IgG 抗体加入到 0.5% 脱脂奶粉中, 配制第二抗体工作液 PVDF 膜浸于第二抗体工作液中, 室温摇床孵育 1h,1 TBST 漂洗 10min, 重复 4 次, 使用化学发光仪 (C-DiGit Blot Scanner, 美国 Li-Cor 公司 ) 显影 显影后的数字化图片, 通过软件 Image J 进行强度分析, 从而获得 HSS 和 GAPDH( 内参 ) 表达量的数据 最终通过比较二者表达量, 从而获得定量结果 4 Hoechst 33342 染色按照文献所述进行操作 [11], 具体步骤如下 : 充分弃去 H 2 O 2 处理后细胞的培养基, 使用 PBS 轻柔洗去培养基 2 次, 充分弃去后每孔加入 10μg/ml Hoechst 33342,37 培养箱中染色 30min 用 PBS 轻柔洗去染色液 2 次, 充分弃去后每孔加入 1ml PBS 应用
第 4 期艾伟伦等. 肝刺激因子促进过氧化氢诱导的肝星形细胞凋亡 309 荧光显微镜 (FW4000, 德国 Leica 公司 ) 观察和拍摄图片, 每个样本随机拍摄 6 个视野 注意拍摄图片时, 应保证曝光度和对比度保持一致 随后使用 Image J 软件计算每张图片 ( 相同放大倍数下 ) 总细胞数和 Hoechst 阳性细胞数 5 TUNEL 细胞凋亡实验按 1 10 4 个细胞的比例将细胞接种于 96 孔细胞培养板中常规培养 24h H 2 O 2 处理细胞后, 充分弃去培养基,4% 多聚甲醛固定 30min, 随后 0.5% Triton X-100 室温孵育 5min;PBS 洗涤 3 次, 每次 5min 按 1:9 的比例避光混合 TdT 酶和荧光标记液, 配制 TUNEL 检测液 充分弃去各孔 PBS, 每孔加入 TUNEL 检测液 50μl,37 孵育 60min 后加入 DAPI 复染 5min PBS 洗涤细胞 3 次 荧光显微镜观察和拍摄图片每个样本随机拍摄 6 个视野 拍摄图片时, 保证曝光度和对比度保持一致 随后使用 Image J 软件计算每张图片 ( 相同放大倍数下 )TUNEL 细胞阳性细胞数 6 Annexin V-FITC/PI 染色流式细胞术将 H 2 O 2 处理后的细胞用 PBS 洗涤 3 次后, 收集细胞于 Eppendorf 管中 室温,800r/min 离心 5min, 收集细胞 用 1ml 4 预冷的 PBS 重悬细胞, 室温 800r/min 离心 5min, 充分弃去上清后加入 195μl 的 Binding Buffer 悬浮细胞沉淀 加入 5μl Annexin V- FITC 和 5μl PI 避光染色 25min 流式细胞分析仪 (D3130,ACEA Biosciences 公司 ) 分析检测 7 Caspase 3/7 活性检测按照试剂盒说明书进行操作, 步骤如下 : 按 1 10 4 个细胞的比例将细胞接种于 96 孔细胞培养板中常规培养 24h H 2 O 2 处理细胞后, 充分弃去培养基, 使用 PBS 轻柔洗去培养基 2 次, 每孔加入 100μl caspase 3/7 活性检测液和 100μl DMEM, 振荡混匀, 37 反应 30min 后,800r/min 离心 5min, 收集上清液至不透光塑料检测板中, 使用 96 孔板荧光检查仪 (Glo-Max TM,Promega 公司 ) 测定荧光素酶活性 8 统计学分析所有实验数据以平均值 ± 标准差表示 采用 SPSS 16.0.2 统计软件对实验结果进行分析, 两组间比较采用 Student t 检验 ; 多组间比较采用单因素方差分析 (ANOVA),P<0.05 被认为有显著性差异 各个实验至少重复 3 次 结果 Western blot 检测显示, 转染 pcdna-hss 的 LX- 2 细胞 (HSS-Tr 组 ) 内 HSS 水平显著高于转染空载体的 LX-2 细胞 (Vector-Tr 组 )( 图 1), 说明瞬时转染后, 过表达 HSS 的 LX-2 细胞模型构建成功, 可用于下一步的实验 图 1 Western blot 实验检测转染效率 A, 代表性 Western blot 结果 ;B,Western blot 检测结果统计学分析 ; *P<0.05(n=3) Fig. 1 Transfection efficiency was confirmed by Western blotting. A, representative results of Western blot.; B, statistical analysis of Western blot results. *P<0.05 (n=3) 为明确 HSS 对 H 2 O 2 诱导 HSC 凋亡的作用, 应用 Hoechst 33342 染色检测了过表达 HSS 对 H 2 O 2 诱导 HSC 凋亡的影响 将细胞分成 4 组, 实验组的 Vector-Tr 和 HSS-Tr 细胞分别给予 2.5μmol/L H 2 O 2 刺激 20min; 对照组为 Vector-Tr 和 HSS-Tr 细胞分别添加等体积双蒸水处理 20min 加入 Hoechst 33342 染液对活细胞进行染色后荧光显微镜下观察发现, HSS-Tr 组 ( 过表达 HSS) 的 H 2 O 2 处理细胞中 Hoechst 33342 染色阳性细胞百分比 (38.13%±4.15%) 显著高于 Vector-Tr 组 ( 转染空载体 ) 的 H 2 O 2 处理细胞中 Hoechst 33342 染色阳性细胞百分比 (28.35%±1.83%)( 图 2)
310 第 27 卷 图 2 HSS 对 H 2 O 2 诱导的细胞凋亡影响的 Hoechst 33342 染色检测 A, Hoechst 33342 染色, 箭头示 Hoechst 33342 阳性细胞 ; 比例尺, 50μm;B, Hoechst 33342 染色阳性细胞百分比的统计学分析 ; 共进行 3 次独立实验, 每组细胞随机拍照 6 个视野 ;*P<0.05 Fig. 2 Hoechst 33342 stain to evaluate the effect of HSS on cell apoptosis induced by hydrogen peroxide. A, representative images of Hoechst 33342 stain. White arrows pointed at Hoechst 33342-positive cells; scale bar, 50μm;. B, statistical analysis of Hoechst 33342 positive cells. Graph represented the average of 3 independent repeats. Each group had 6 randomly selected fields; *P<0.05 为进一步验证 Hoechst 染色实验结果, 应用红色 荧光标记的 TUNEL 染色液检测了 H 2 O 2 刺激后各组 细胞的凋亡情况 荧光显微镜观察 TUNEL 染色和 DAPI 复染的细胞显示, 与 Vector-Tr 组 H 2 O 2 处理细 胞相比,HSS-Tr 组 H 2 O 2 处理细胞 TUNEL 阳性细胞 显著性增多 ( 图 3) 图 3 HSS 对 H 2 O 2 诱导的细胞凋亡影响的 TUNEL 染色检测 A,TUNEL 染色,DAPI 复染, 箭头示 TUNEL 染色阳性细胞 ; 比例尺,50μm; B,TUNEL 染色阳性细胞百分比的统计学分析 ; 共进行 3 次独立实验, 每组细胞随机拍照 6 个视野 ;*P<0.05 Fig. 3 TUNEL staining to show the effect of HSS on cell apoptosis induced by hydrogen peroxide. A, representative images of TUNEL staining. White arrows pointed at TUNEL-positive cells; scale bar, 50μm;. B, statistical analysis of TUNEL positive cells. Graph represented the average of 3 independent repeats. Each group had 6 randomly selected fields; *P<0.05 进一步应用 Annexin V-FITC/PI 流式细胞术检测显示, H 2 O 2 刺激后, 与 Vector-Tr 组细胞相比, 过表达 HSS 的 LX-2 细胞晚期凋亡 (Annexin V 和 PI 双阳性 ) 数目显著性增加 ; 与此对应, 正常细胞 (Annexin V 阴性 PI 阳性 ) 数目则显著性减少, 而 早期凋亡细胞 (Annexin V 阳性 PI 阴性 ) 无明显差 异 ( 图 4)
第 4 期艾伟伦等. 肝刺激因子促进过氧化氢诱导的肝星形细胞凋亡 311 图 4 HSS 对 H 2 O 2 诱导的细胞凋亡影响的 Annexin V-FITC/PI 流式细胞术检测 A, 细胞凋亡的 Annexin V-FITC/PI 流式细胞术分析代表性结果 ;B, 凋亡细胞数的统计学分析 ;*P<0.05(n=3) Fig. 4 Annexin V-FITC/PI stain measured by flow cytometry exhibited the influence of HSS on cell apoptosis induced by hydrogen peroxide. A, representative images of Annexin V-FITC/PI stain detected by flow cytometry; B, statistical analysis of apoptosis. Graph represented the average of 3 independent repeats; *P<0.05 (n=3) 为了明确 HSS 是否通过影响调控细胞凋亡的关键分子 caspase3/7 而促进 H 2 O 2 诱导的细胞凋亡, 利用 Caspase-Glo 3/7 Assay 试剂盒分析了细胞内 caspase 3 和 caspase 7 活性 在 H 2 O 2 刺激后,Vector-Tr 组和 HSS-Tr 组细胞中 caspase 3/7 活性均显著性升高, HSS-Tr 组细胞升高更为显著 ( 图 5) 图 5 HSS 对 caspase3/7 活性影响的统计学分析 *P<0.05(n=3) Fig. 5 Statistical analysis for the effect of HSS on cell caspase3/7 activity. *P<0.05 (n=3) 讨论活化型 HSC 数目的减少是改善肝纤维化最具特点的特征之一 [3] 减少活化型 HSC 的数目, 可减少 胶原等细胞外基质的分泌 [3,12] 活化型 HSC 的减少可 以通过促进细胞的凋亡实现 文献报道, 活化的 HSC 能够表达一系列与细胞凋亡相关的受体, 例如 TNF receptor 1(TNFR1),p75NTR 和 TRAIL 受体 [13] 此外, 静脉注射聚乙二醇化 TRAIL 能够促进活化型 HSC 的凋亡, 减少四氯化碳所致的肝纤维化 [14] 这 均说明, 活化型 HSC 的凋亡在改善肝纤维化的过程 中具有重要的意义 然而, 对于 HSC 的凋亡的研究还十分有限 我 们有必要找寻其他的活性蛋白促进活化型 HSC 的 凋亡, 为治疗肝纤维化提供实验依据 已证实 HSS 在 HSC 中表达, 而且 23 kd 形式主要表达在线粒体 的膜间隙 [15] 在肝细胞中,HSS 扮演者守护者的角 色 但是, 其在肝非实质细胞中的作用和功能仍不 明了 在大鼠 HSC 细胞系 HSC-T6 中, HSS 能够 减少 α-sma 在 mrna 水平的表达, 减少胶原的分 泌 [8], 但目前尚缺少对 HSS 效应的机制研究 由于 LX-2 细胞具有较高的转染效率 [16], 因此, 我们在本 实验中, 采取了相同的研究方法, 向 LX-2 细胞中 瞬时转染 pcdna3.0-hss,pcdna3.0-vector 质粒 Western blot 实验验证了本实验中过表达 HSS 的 LX- 2 细胞模型的建立成功 细胞程序性死亡过程中的氧化应激反应能导致 活性氧簇 (reactive oxygen species,ros) 的累积
312 第 27 卷 H 2 O 2 诱导 HSC 凋亡的模型, 已经广泛运用在细胞凋亡的机制研究之中 [9] 我们利用这一模型, 证实在活化型 HSC 中,H 2 O 2 能够上调 caspase 3 和 caspase 7 的活性, 增加活化型 HSC 的凋亡 Caspase 3 和 caspase 7 是细胞凋亡的执行者, 能够抑制 DNA 的修复作用, 同时启动 DNA 的降解 [17] 我们的实验结果进一步证实, 在 H 2 O 2 诱导 LX-2 细胞凋亡的模型中,HSS 能够增加 caspase 3/7 活性, 促进 LX-2 细胞的凋亡 此外, 利用 Annexin V-FITC 和 PI 共染实验, 通过流式细胞仪分析, 可以区分早期细胞凋亡和晚期细胞凋亡 实验证实,HSS 能够增加晚期细胞凋亡的数量, 即 Annexin V(+)PI(+) 数目显著性增多 此外,Hoechst 33342 细胞凋亡检测和 TUNEL 染色均证实了相同的结果 然而,HSS 通过何种途径增加 LX-2 细胞的凋亡, 仍然不明 值得一提的是, 线粒体通透性转变孔的持续开放, 促使线粒体膜电位的下降, 导致氧化磷酸化解偶联, 最终导致细胞的凋亡 [18,19] 由于 23 kd 的 HSS 定位在线粒体的膜间隙, 因此,HSS 可能通过影响线粒体的膜通透性或者影响线粒体膜电位, 从而激活细胞程序性死亡 参考文献 [1] Lo RC, Kim H. Histopathological evaluation of liver fibrosis and cirrhosis regression. Clin Mol Hepatol, 2017, 23(4): 302-307. [2] Lee YA, Wallace MC, Friedman SL. Pathobiology of liver fibrosis: a translational success story. Gut, 2015, 64(5): 830-841. [3] Tsuchida T, Friedman SL. Mechanisms of hepatic stellate cell activation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2017, 14(7): 397-411. [4] LaBrecque DR, Pesch LA. Preparation and partial characterization of hepatic regenerative stimulator substance (SS) from rat liver. J Physiol, 1975, 248:273-84. [5] Gupta P, Venugopal SK. Augmenter of liver regeneration: A key protein in liver regeneration and pathophysiology. Hepatol Res, 2018,48(8): 587-596. [6] Jiang Y, Zhao M, An W. Increased hepatic apoptosis in high-fat diet-induced NASH in rats may be associated with downregulation of hepatic stimulator substance. J Mol Med (Berl), 2011, 89(12): 1207-1217. [7] Zhang J, Li Y, Jiang S, et al. Enhanced endoplasmic reticulum SERCA activity by overexpression of hepatic stimulator substance gene prevents hepatic cells from ER stress-induced apoptosis. Am J Physiol Cell Physiol, 2014, 306(3): C279-290. [8] Wu X, Liu G, Mu M, et al. Augmenter of Liver Regeneration Gene Therapy Using a Novel Minicircle DNA Vector Alleviates Liver Fibrosis in Rats. Hum Gene Ther, 2016, 27(11): 880-891. [9] Zhao S, Luo H, Kan G, et al. The protective role of autophagy in Heterocephalus glaber hepatic stellate cells exposed to H 2 O 2 or nutritional stress. Cell Physiol Biochem, 2014, 34(2): 463-73. [10] Dong LY, Sun G, Jiang L, et al.epidermal growth factor down-regulates the expression of human hepatic stimulator substance via CCAAT/enhancer-binding protein β in HepG2 cells. Biochem J, 2010, 431(2):277-87. [11] Lu W, Feng L, Zhang Y, et al. mir-15a induces cell apoptosis by targeting BCL2L2 and BCL2 in HPV-positive hypopharyngeal squamous cell carcinoma. Oncology Reports, 2016, 36(4):2169. [12] Scott L. Friedman. Hepatic Stellate Cells: Protean, Multifunctional, and Enigmatic Cells of the Liver. Physiol Rev, 2008, 88(1): 125-172. [13] Pellicoro A, Ramachandran P, Iredale J P, et al. Liver fibrosis and repair: immune regulation of wound healing in a solid organ. Nature Reviews Immunology, 2014, 14(3): 181-194. [14] Oh Y, Park O, Swierczewska M, et al. Systemic PEGylated TRAIL treatment ameliorates liver cirrhosis in rats by eliminating activated hepatic stellate cells. Hepatology, 2016, 64(1): 209-223. [15] Lisowsky T, Lee JE, Polimeno L, et al. Augmenter of liver regeneration protein is a sulfhydryl oxidase. Dig Liver Dis, 2001, 33(2): 173-180. [16] Xu L, Hui AY, Albanis E, et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut, 2005, 54(1): 142-51 [17] Kuribayashi K, Mayes PA, El-Deiry WS. What are caspases 3 and 7 doing upstream of the mitochondria? Cancer Biol Ther, 2006, 5(7): 763-765. [18] Halestrap AP, MeStay GP, Clarke SJ. The permeahility transition pore complex: another view. Biochimie, 2002, 84(2-3): 153-166. [19] Ajith TA. Role of mitochondria and mitochondria targeted agents in non-alcoholic fatty liver disease. Clin Exp Pharmaco Physiol, 2017, 45(5): 413-421.