Phanta

Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase P505-d1/d2/d3 www.vazyme.com Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 7.1

目录 Contents www.vazyme.com 01/ 产品概述... 02 02/ 产品组分... 02 03/ 保存条件... 02 04/ 单位定义... 02 05/ 质量控制... 02 06/ 实验流程... 03 06-1/ 普通 PCR 操作流程... 03 06-2/ 长片段扩增指南... 04 06-3/ 粗品扩增指南... 04 07/ 应用实例... 05 07-1/ 适用于各种长度片段的扩增... 05 07-2/ 稳定的粗品扩增能力... 05 07-3/ 优异的高 GC 扩增能力... 08 07-4/ 值得信赖的高保真度... 09 08/ 注意事项... 09 09/ 常见问题与解决方案... 10

01/ 产品概述 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 是 Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 的升级版本 与上一代产品相比,Phanta Max 中添加了独特的延伸因子 特异性促进因子以及平台期解抑制因子, 使其在长片段扩增能力 扩增特异性以及扩增产量方面得到了大幅度提升 使用 λdna 质粒等简单模板,Phanta Max 可以有效扩增长达 40 kb 的片段 ; 使用基因组 DNA 等复杂模板,Phanta Max 可以扩增长达 20 kb 的片段 ; 使用 cdna 模板,Phanta Max 可以有效扩增长达 10 kb 的片段 其错配率是普通 Taq 酶的 1/53, 是 Pfu 酶的 1/6 此外,Phanta Max 对 PCR 抑制剂具有良好的抵抗能力, 可用于细菌 真菌 植物组织 动物组织或全血样品的直接 PCR Phanta Max 中添加了在常温下能够抑制其 5 3 聚合酶活性和 3 5 外切酶活性的两种单克隆抗体, 可进行高特异性的热启动 PCR 扩增产物为平端, 适用于 ClonExpress 快速克隆试剂盒 (C112/C113/C114) 02/ 产品组分 组分 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 2 Phanta Max Buffer dntp Mix (10 mm each) 10 Loading buffer P505-d1 (100 U) 100 μl 2 1.25 ml 100 μl 1.25 ml P505-d2 (500 U) P505-d3 (1,000 U) 5 P505-d1 10 P505-d1 03/ 保存条件 -20 保存 避免反复冻融 04/ 单位定义 用活化的大马哈鱼精子 DNA 作为模板 / 引物,74 30 min 内, 摄入 10 nmol 的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为 1 个活性单位 (U) 05/ 质量控制 核酸内切酶残留检测 10 U 的本酶和 0.3 μg Supercoiled pbr322 DNA 在 37 下孵育 4 h,dna 的电泳谱带不发生变化 01/ 02

大肠杆菌残留 DNA 检测 :10 U 本酶中残留的核酸经 E.coli 16s rdna 特异性的 TaqMan qpcr 检测,E.coli 基因组残留低于 10 拷贝 功能检测 :50 μl PCR 体系中加入 1 U 本酶, 分别以 10 ng λdna 50 ng 质粒 DNA 100 ng 人基因组 DNA 和 HeLa 细胞 cdna 为模板, 扩增不同长度和 GC 含量的 5 个片段, 延伸设置为 30 sec/kb 35 个循环后将 1/10 PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳,EB 染色, 可见有单一的相应条带 06/ 实验流程 06-1/ 普通 PCR 操作流程 反应体系 所有操作请在冰上进行, 各组分解冻后请充分混匀, 用完之后请及时放回 -20 保存 ddh 2 O 2 Phanta Max Buffer a dntp Mix (10 mm each) 上游引物 (10 μm) 下游引物 (10 μm) Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 模板 DNA b a 2 Phanta Max Buffer 中已含有 Mg 2+, 终浓度为 2 mm up to 50 μl 25 μl x μl b 不同模板最佳反应浓度有所不同, 下表为 50 μl 体系推荐模板使用量 : 模板种类基因组 DNA 质粒或病毒 DNA cdna 模板起始量 50-400 ng 10 pg-30 ng 1-5 μl ( 不超过 PCR 反应总体积的 1/10) 反应程序 循环步骤预变性 a 变性退火 b 延伸 c 彻底延伸 56~ 30 sec/3 min 30-60 sec/kb 25-35 a. 推荐大多数模板的预变性为, 为 : 质粒或病毒 DNA 30 sec, 基因组或 cdna 3 min b. 请根据引物 Tm 值设置退火 如引物 Tm 值, 可删除退火步骤, 直接进行后续的延伸步骤 ( 两步 www.vazyme.com 法 PCR) 如果需要, 可以建立一个梯度寻找引物与模板结合的最适 此外, 退火直接决定 扩增特异性 如发现扩增特异性差, 可适当提高退火 c. 适当延长延伸有助于扩增产量的提高

06-2/ 长片段扩增指南 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 具有卓越的长片段扩增能力 扩增特异性以及扩增产量, 在扩增长片段时, 若推荐程序不能有效扩增, 可尝试下表所示 Touch Down 两步法 PCR: 循环步骤 预变性 3 min 变性延伸 92 74 60 sec/kb 5 变性延伸 60 sec/kb 5 变性延伸 70 60 sec/kb 5 变性延伸 68 60 sec/kb 25 彻底延伸 68 请使用高质量的模板, 若产量较低可适当提高模板投入量 ; 推荐使用长引物 06-3/ 粗品扩增指南 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 对许多 PCR 抑制剂具有良好的抵抗能力, 可用于细菌 真菌 植物组织 动物组织或全血样品的直接 PCR 下表为已成功扩增的粗品列表: 样品类型全血滤纸干血清培养细胞酵母细菌霉菌精液浮游生物植物组织小鼠尾巴食品 扩增方式直接扩增直接扩增直接扩增直接扩增直接扩增直接扩增直接扩增直接扩增直接扩增裂解后吸取裂解液扩增裂解后吸取裂解液扩增 推荐操作方式 (50 μl 体系 ) 吸取 1-5 μl 作为扩增模板剪取 1-2 mm 2 滤纸作为扩增模板取少量细胞作为扩增模板挑取单克隆或 菌液作为扩增模板挑取单克隆或 菌液作为扩增模板挑取少量作为扩增模板挑取少量作为扩增模板挑取少量作为扩增模板剪取 1-2 mm 2 组织作为扩增模板吸取 1-5 μl 裂解液作为扩增模板吸取 1-5 μl 裂解液作为扩增模板 样品裂解液制备过程 : 动物组织 / 食品 取少量样品浸泡于 100 μl Lysis Buffer 中, 补加 Proteinase K 至终浓度为 200 μg/ml( 自备 ) 60 10 min 10 min 充分混匀后室温离心取上清 Lysis Buffer:20 mm Tris-HCl, 100 mm EDTA, 0.1% SDS, ph 8.0 如实验需要, 可依据上述配方自行配制 03/ 04

07/ 应用实例 07-1/ 适用于各种长度片段的扩增以人基因组 DNA 为模板, 使用 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 分别扩增 0.6 kb 1.0 kb 2.6 kb 3.0 kb 4.0 kb 5.1 kb 6.2 kb 7.1 kb 8.5 kb 10.6 kb 17.8 kb 20.3 kb 21.4 kb 目标片段 所有扩增引物 Tm 值均为 60 左右 ( 使用 Primer Premier 5 计算 ) 反应体系配制以及反应程序如下: 反应体系 ddh 2 O 2 Phanta Max Buffer dntp Mix (10 mm each) 100 ng /μl 人基因组 DNA 上游引物 (10 μm) 下游引物 (10 μm) Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase up to 50 μl 25 μl 反应程序 循环步骤预变性变性退火延伸彻底延伸 60 3 min 30 sec/kb 35 扩增产物电泳结果 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 07-2/ 稳定的粗品扩增能力 M M: DL15 000 DNA Marker 1: 0.6 kb 2: 1.0 kb 3: 2.6 kb 4: 3.0 kb 5: 4.0 kb 6: 5.1 kb 7: 6.2 kb 8: 7.1 kb 9: 8.5 kb 10: 10.6 kb 11: 17.8 kb 12: 20.3 kb 13: 21.4 kb www.vazyme.com 1. 以 EDTA 采血管采集的人类全血 ( 来源于 Vazyme 实验室 ) 为模板, 分别使用 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase A 公司高效率高保真酶 B 公司高效率高保真酶扩增 1,295 bp 的目标片段 ; 另外使用 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 扩增更长的目的片段, 如 3,276 bp 和 8,513 bp 所有扩增引物 Tm 值均为 60 左右 ( 使用 Primer Premier 5 计算 ) 反应体系配制以及反应程序如下 :

反应体系 ddh 2 O 2 Phanta Max Buffer dntp Mix (10 mm each) 全血 * 上游引物 (10 μm) 下游引物 (10 μm) Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase up to 50 μl 25 μl x μl * 全血添加量分别为 4 μl 反应程序 循环步骤 预变性变性退火 * 延伸彻底延伸 60 /63 /70 3 min 30 sec/kb 35 * 扩增 1.3 kb 3.6 kb 8.5 kb 目标片段时退火分别是 60 63 70 扩增产物电泳检测结果 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase A 公司高效率高保真酶 B 公司高效率高保真酶 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase M DL15,000 DNA Marker 1 1.3 kb( 血液 ) 2 1.3 kb( 血液 ) 3 1.3 kb(4 μl 血液 ) 4 1.3 kb( 血液 ) 5 3.6 kb( 血液 ) 6 8.5 kb( 血液 ) * 使用 A B 公司高保真酶扩增时使用各自说明书推荐 M 1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 M 4 5 6 M 的条件 2. 以番茄叶 稻叶 精米 ( 来源于 Vazyme 实验室 ) 为模板, 以稻叶纯化基因组 DNA( 来源于 Vazyme 实验室 ) 为阳性对照, 分别使用 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase A 公司高效率高保真酶 B 公司高效率高保真酶扩增 1.3 kb 目标片段 所有扩增引物 Tm 值均为 60 左右 ( 使用 Primer Premier 5 计算 ) 反应体系配制以及反应程序如下: 反应体系 ddh 2 O 2 Phanta Max Buffer dntp Mix (10 mm each) 植物组织 * 上游引物 (10 μm) 下游引物 (10 μm) Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase * 推荐使用植物组织直径为 0.3-3 mm up to 50 μl 25 μl x μl 05/ 06

M M 反应程序 循环步骤预变性变性退火延伸彻底延伸 60 3 min 30 sec/kb 35 扩增产物电泳检测结果 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase A 公司高效率高保真酶 B 公司高效率高保真酶 M DL 5,000 DNA Marker 1 番茄叶 2 稻叶 3 精米 4 稻叶纯化基因组 DNA * 使用 A B 公司高保真酶扩增时使用各自说明书推荐的条件 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 1 2 3 4 3. 以小鼠尾巴 ( 来源于 Vazyme 实验室 ) 裂解液为模板, 分别使用 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase A 公司高效率高保真酶 B 公司高效率高保真酶扩增 2.5 kb 目标片段 所有扩增引物 Tm 值均为 60 左右 ( 使用 Primer Premier 5 计算 ) 反应体系配制以及反应程序如下: 反应体系 ddh 2 O 2 Phanta Max Buffer dntp Mix (10 mm each) 小鼠尾巴裂解液上游引物 (10 μm) 下游引物 (10 μm) Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase up to 50 μl 25 μl 反应程序 www.vazyme.com 循环步骤预变性变性退火延伸彻底延伸 60 3 min 30 sec/kb 35

扩增产物电泳检测结果 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase A 公司高效率高保真酶 B 公司高效率高保真酶 M DL 5 000 DNA Marker 1-6 目标片段均为 2.5 kb M 1 2 M 3 4 M 5 6 M 07-3/ 优异的高 GC 扩增能力 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 能够高效扩增常规聚合酶无法正常扩增的高 GC 片段 以人基因组为模板扩增 654 bp 900 bp 800 bp 1,200 bp 1,400 bp 426 bp 目标片段, 各扩增子 GC 含量均高于 68% 依据检测结果可知, 在默认条件下均可以高效扩增 所有扩增引物 Tm 值均为 60 左右 ( 使用 Primer Premier 5 计算 ) 反应体系配制参照 06-1 反应程序如下表 : 反应程序 循环步骤预变性变性延伸彻底延伸 3 min 45 sec/kb 35 扩增产物电泳检测结果 M DL 2,000 DNA Marker 1 654 bp,68.1% GC Content 2 900 bp,69.4% GC Content 3 800 bp,71.3% GC Content 4 1,200 bp,73.5% GC Content 5 1,400 bp,74.7% GC Content M 1 2 3 4 5 6 6 426 bp,76.8% GC Content 07/ 08

07-4/ 值得信赖的高保真度 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 具有超高的扩增保真性, 其保真度是 Taq DNA Polymerase 的 53 倍,Pfu DNA Polymerase 的 6 倍, 显著优于同类产品 下图为 LacI 分析方法测定 (Cline et al., Nucleic Acids Research,24: 3546-3551(1996)) 的不同聚合酶的扩增保真度比较 80 70 69 Fidelity Compared to Taq 60 50 40 30 20 10 0 53 Phanta Max Phanta EVO 52 51 Phanta Q5 11 12 PrimerSTAR GXL KOD FX 8 Pfu 1 Taq 08/ 注意事项 www.vazyme.com 1. 请使用高质量的模板 2. 请勿使用 dutp 和带有尿嘧啶的引物和模板 3. 如实验需要, 可适当提高 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 的使用量, 但 50 μl 体系内酶量建议不要超过 2 U 4. Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 具有较强的校对活性 因此, 如扩增产物需要进行 TA 克隆, 加 A 之前必须进行 DNA 纯化 5. 为了防止 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 的校对活性降解引物, 在配置反应体系时请最后加入聚合酶 6. 引物设计 : 引物 3 端最后一个碱基最好为 G 或者 C; 引物 3 端最后 8 个碱基应避免出现连续错配 ; 引物 3 端应避免出现发夹结构 ; 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不超过 1 为佳,Tm 值调整至 55-65 为佳 ( 引物 Tm 值推荐使用 Primer Premier 5 进行计算 ); 引物额外附加序列, 即与模板非配对序列, 不应参与引物 Tm 值计算 ; 引物的 GC 含量控制在 40%-60% 之间 ; 引物 A G C T 整体分布要尽量均匀, 避免使用 GC 或者 AT 含量高的区域 ;

引物内部或者两条引物之间避免有 5 个碱基以上的互补序列, 两条引物的 3 端避免有 3 个碱基以上的互补序列 ; 引物设计完毕请使用 NCBI BLAST 功能检索引物特异性, 以避免非特异性扩增产生 09/ 常见问题与解决方案 无产物或产物量少 引物退火引物浓度延伸模板纯度模板使用量酶使用量 优化引物设计设置退火梯度, 找到合适的退火适当提高引物浓度适当增加延伸至 30 sec/kb-1 min/kb 增加至 35-40 个循环使用高纯度模板使用量可参照反应体系推荐量并适量增加适当调整高保真酶的使用量 有杂带或弥散条带引物退火引物浓度延伸反应程序模板纯度模板使用量酶使用量 优化引物设计尝试提高退火并设置退火梯度降低引物浓度至终浓度为 0.2 µm 有大于目标条带的杂带时可适当减少延伸减少至 25-30 个循环使用两步法或 Touch down PCR 程序使用高纯度模板使用量参照反应体系推荐量调整或适当减少适当减少高保真酶的使用量 09/ 10

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