HiPure Plant DNA Kits 广谱性植物 DNA 抽提试剂盒 从各种植物样品中提取植物 DNA
目录 简介 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 原理 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 试剂盒组成 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 3 保质期 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 4 方案 1: 植物 DNA 小量抽提 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 5 方案 2: 植物 DNA 中量抽提 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 7 方案 3: 植物 DN A 大量抽提 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 9 方案 4: 植物 DNA 纯化方案 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 11 常见问题回答 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 12 版本 : 2010-01 第 1 页共 12 页
简介 HiPure Plant DNA Kits 为植物组织 DNA 抽提提供一种快速可靠的方法 试剂盒采用硅胶 柱纯化技术和经典的 CTAB/ 氯仿抽提技术, 适合于从各种植物样品 ( 包括常规, 多糖和多酚类 ) 中快速提取高纯度的植物 DNA 得到的 DNA 可直接用于 PCR, SSR, AFLP, RAPD 以及 Southern blot 等实验 该系列提供了三种规格, 以满足不同的需求 试剂盒 Mini Kit Midi Kit Maxi Kit 编号 D3161 D3162 D3163 新鲜样品 <100 mg 0.5-1 g 2-5 g 干燥样品 <20 mg 0.1-0.2 g 0.5-1 g 结合能力 100 µg 500 µg 2 mg 柱型 1.5 ml 柱 15 ml 柱 50 ml 柱 样品类型 植物和真菌类样品 原理 HiPure 硅胶柱是采用高结合力的玻璃纤维滤膜为基质 滤膜在高浓度离子化剂 ( 如盐酸胍或异硫氰酸胍 ) 条件下, 可通过氢键和静电等物理作用吸附核酸, 而蛋白质或其它杂质不被吸附而去除 吸附了核酸的滤膜经洗涤去除蛋白质和盐, 最后可以用低盐缓冲液 ( 如 Buffer TE) 或水, 洗脱出滤膜上吸附的核酸 得到的核酸纯度高, 可直接用于各种下游实验 HiPure Plant DNA Kit 基于硅胶柱纯化方式 样品在含 CTAB 裂解液中匀浆裂解,DNA 释放到裂解液中, 用氯仿抽提去除多糖 蛋白质等杂质, 得到上清液并加入结合液, 转移至柱子中过滤,DNA 被吸附上柱子的膜上, 而蛋白质等杂质则不被吸附而去除 柱子经 Buffer GW1 和 Buffer GW2 洗涤去除盐分, 最后 DNA 被 Elution Buffer (10Mm Tris, ph8.5) 洗脱 洗脱的 DNA 可直接用于 PCR Southern blot RAPD 等实验 第 2 页共 12 页
组成 HiPure Plant DNA Mini Kit 产品编号 D3161-01 D3161-02 D3161-03 纯化次数 10 次 50 次 250 次 HiPure DNA Mini Columns II 10 50 250 2ml Collection Tubes 10 50 250 Buffer PTL 10 ml 40 ml 180 ml Buffer PBL 10 ml 20 ml 180 ml Buffer GW1 4.4 ml 13 ml 110 ml Buffer GW2 5 ml 20 ml 2 x 50 ml RNase Solution 60 µl 300 µl 1.4 ml Elution Buffer 3 ml 20 ml 60 ml 说明书 1 1 1 HiPure Plant DNA Midi Kit 产品编号 D3162-01 D3162-02 D3162-03 纯化次数 2 次 10 次 50 次 HiPure DNA Midi Columns II 2 10 50 15ml Collection Tubes 2 10 50 Buffer PTL 15 ml 60 ml 270 ml Buffer PBL 10 ml 30 ml 120 ml Buffer GW1 10 ml 40 ml 170 ml Buffer GW2 20 ml 20 ml 2 x 50 ml RNase Solution 70 µl 400 µl 1.8 ml Elution Buffer 10 ml 30 ml 100 ml 说明书 1 1 1 第 3 页共 12 页
组成 HiPure Plant DNA Maxi Kit 产品编号 D3163-01 D3163-02 D3163-03 纯化次数 2 次 10 次 50 次 HiPure DNA Maxi Columns II 2 10 50 50ml Collection Tubes 2 10 50 Buffer PTL 35 ml 150 ml 2 x 1220 ml Buffer PBL 20 ml 60 ml 220 ml Buffer GW1 25 ml 70 ml 200 ml Buffer GW2 20 ml 50 ml 2 x 50 ml RNase Solution 200 µl 1.2 ml 5.5 ml Elution Buffer 3 ml 20 ml 100 ml 说明书 1 1 1 保质期 HiPure Plant DNA Kits 可在室温下 (15-25 ) 干燥保存 12 个月 RNase Solution 室温运输, 收到产品保存于 2-8oC Buffer PTL1 和 Buffer PBL2 在低温贮藏中可能会有沉淀析出,65 水浴 30 分钟使之溶解 第 4 页共 12 页
方案 1. 植物 DNA 小量提取 (D3161) 该方案适合于从 100mg 新鲜 / 冻藏植物样品, 20mg 干燥植物 / 种子样品提取高纯度的总 DNA 纯化的 DNA 包括基因组 DNA 和叶绿体 DNA 以下离心条件都在室温下进行 准备材料和工具 无水乙醇 (96-100%) 小型离心管 ( 14,000 x g) 65 水浴锅 氯仿 / 异戊醇 (24:1) 2- 疏基乙醇 ( 可选 ) PVP-40 按瓶子标签所示, 用无水乙醇稀释 Buffer GW1, 并于室温保存 按瓶子标签所示, 用无水乙醇稀释 Buffer GW2, 并于室温保存 操作流程 : 1. 用液氮把植物样品研磨成粉末, 转移 50-100mg 新鲜 / 冻藏样品或 15-20mg 干燥样品至 2ml 离心管中 注 : 除液氮研磨外, 也可以将用珠磨仪 ( 如 FastPrep-24,2010 Gene Grinder) 或机械匀浆器进行匀浆 采用珠磨仪匀浆时, 我们推荐使用 2ml 植物匀浆管, 该匀浆管包含数粒钢珠和菱角锋利石石, 能高效地对植物样品进行分散研磨 正确使用组织用量, 才能获得理想结果 过量样品会造成柱子堵塞, 而引起产量和纯度下降 由于植物样品 DNA 和其它代谢物质含量差异很大 初次实验时, 我们推荐使用 50mg 新鲜 /15mg 干燥样品, 根据实验结果再调整组织用量 若样品用量超过新鲜 100mg/ 干燥 30mg 时,Buffer PTL1 须按比例增加 2. 立即加入 600 µl Buffer PTL/2-Me 和 5 µl RNase Solution 至样品中 剧烈涡旋使样品充分分散 65ºC 水浴 15-30 分钟, 期间颠倒混匀 2-3 次 注 : 使用前, 按 1 ml Buffer PTL 加入 20 µl 2- 疏基乙醇 该混合液可在室温放置 2 周 若植物样品富含多酚类物质, 还加入 PVP-40 至 Buffer PTL1/2-Me 至终浓度为 2%(W/V), 振荡使 PVP-40 充分溶解 PVP-40 可以结合多酚类物质, 减少多酚类物质对 DNA 的损伤 Buffer PTL/2-Me/PVP-40 混合液可以在室温放置 2 周 第 5 页共 12 页
3. 加入 600µl 氯仿 / 异戊醇 (24:1), 涡旋混匀 30 秒 4. 室温下,12,000 x g 离心 5 分钟 转移上清液至新的离心管中 5. 加入等倍体积 Buffer PBL 至上清液中 涡旋混匀 30 秒 6. ( 可选 ) 加入 0.5 倍体积的无水乙醇至样品中 涡旋混匀 30 秒 注 : 加入乙醇可以提取高产量, 但若样品多糖类物质含量比较高, 省略这一步能有效去除多糖类 的物质 7. 把 DNA 柱装在收集管中 转移混合液 (<700µl) 至柱子中 8,000 x g 离心 30-60 秒 8. ( 若混合液超过 700µl) 倒弃滤液把柱子装回收集管 把剩余上清液转移至柱子中 8,000 g 离心 30-60 秒 9. 倒弃滤液把柱子装回收集管 加入 500 µl Buffer GW1( 已用无水乙醇稀释 ) 至柱子中 8,000 g 离心 30-60 秒 注 :Buffer GW1 在使用之前须用无水乙醇进行稀释 按瓶子标签指示进行稀释 10. 倒弃滤液把柱子装回收集管 加入 650 µl Buffer GW2( 已用无水乙醇稀释 ) 至柱子中 8,000 g 离心 30-60 秒 注 :Buffer GW2 在使用之前须用无水乙醇进行稀释 按瓶子标签指示进行稀释 11. 倒弃滤液把柱子装回收集管 加入 650 µl Buffer GW2( 已用无水乙醇稀释 ) 至柱子中 8,000 g 离心 30-60 秒 12. 倒弃滤液把柱子装回收集管 10,000 x g 离心 2 分钟去除柱子中残留的乙醇 13. 将柱子转移至新的 1.5ml 离心管中 加入 50-100 µl 预热到 65ºC Elution Buffer 至柱子的膜中央 室温静置 3 分钟 10,000 g 离心 1 分钟 14. 再加入 50-100 µl 预热到 65ºC Elution Buffer 至柱子的膜中央 室温静置 3 分钟 10,000 g 离心 1 分钟 15. 丢弃 DNA 结合柱, 把 DNA 保存于 -20 第 6 页共 12 页
方案 2. 植物 DNA 中量提取 (D3162) 该方案适合于从 0.5-1g 新鲜 / 冻藏植物样品 或 125-250mg 干燥植物 / 种子样品中提取高纯度的总 DNA 纯化的 DNA 包括基因组 DNA 和叶绿体 DNA 以下离心都在室温下进行 准备材料和工具 无水乙醇 (96-100%) 灭菌 15ml 离心管和移液枪头 中型离心管 ( 5,000 x g) 65 水浴锅 氯仿 / 异戊醇 (24:1) 2- 疏基乙醇 ( 可选 ) PVP-40 按瓶子标签所示, 用无水乙醇稀释 Buffer GW1, 并于室温保存 按瓶子标签所示, 用无水乙醇稀释 Buffer GW2, 并于室温保存 操作流程 : 1. 用液氮把植物样品研磨成细小的粉末 转移 0.5-1g 新鲜样品或 125-250mg 干燥样品至 15ml 离心管中 注 : 正确使用组织用量, 才能获得理想结果 过量样品会造成柱子堵塞, 而引起产量和纯度下降 由于植物样品 DNA 和其它代谢物质含量差异很大 初次实验时, 我们推荐使用 500mg 新鲜样品或 125mg 干燥样品, 根据实验结果再调整组织用量 2. 立即加入 5ml Buffer PTL/2-Me 和 30µl RNase Solution 至样品中 立即涡旋使样品充分分散 65ºC 水浴 30 分钟, 期间涡旋混匀 3-5 次 注 : 使用前, 按 1 ml Buffer PTL 加入 20 µl 2- 疏基乙醇 该混合液可在室温放置 2 周 若植物样品富含多酚类物质, 称取一定量的 PVP-40, 加到 Buffer PTL1/2-Me 至终浓度为 2%(W/V), 振荡使 PVP-40 充分溶解 PVP-40 可以结合多酚类物质, 减少多酚类物质对 DNA 的损伤 Buffer PTL/2-Me/PVP-40 混合液可以在室温放置 2 周 第 7 页共 12 页
3. 加入 5 ml 氯仿 / 异戊醇 (24:1), 剧烈涡旋 60 秒混匀 室温静置 5 分钟 4. 4,000 x g 离心 15 分钟 小心转移上清液至新的离心管中 5. 加入等倍体积 Buffer PBL 至上清液中 涡旋混匀 30 秒 6. ( 可选 ) 加入 0.5 倍体积的无水乙醇至样品中 涡旋混匀 30 秒 注 : 加入乙醇可以提取高产量, 但若样品多糖类物质含量比较高, 省略这一步能有效去除多糖类 的物质 7. 把 DNA 中量柱装在收集管中 转移 4ml 混合液至柱子中,4,000 x g 离心 3 分钟 8. 倒弃滤液把柱子装回收集管 把剩余混合液转移至柱子 4,000 x g 离心 3 分钟 重复此步直到所有混合液都转移至柱子中并过滤 9. 倒弃滤液把柱子装回收集管 加入 3ml Buffer GW1( 已用无水乙醇稀释 ) 至柱子中, 4,000 x g 离心 3 分钟 注 :Buffer GW1 在使用之前须用无水乙醇进行稀释 按瓶子标签指示进行稀释 10. 倒弃滤液把柱子装回收集管 加入 3ml Buffer GW2( 已用无水乙醇稀释 ) 至柱子中, 4,000 x g 离心 3 分钟 注 :Buffer GW2 在使用之前须用无水乙醇进行稀释 按瓶子标签指示进行稀释 11. 倒弃滤液把柱子装回收集管 加入 3ml Buffer GW2( 已用无水乙醇稀释 ) 至柱子中, 4,000 x g 离心 3 分钟 12. 倒弃滤液把柱子装回收集管 4,000 x g 离心 15 分钟去除柱子中残留的乙醇 13. 将柱子转移至新的 15ml 离心管中 加入 400µl 预热到 65ºC Elution Buffer 至柱子的膜中央 室温静置 5 分钟 4,000 x g 离心 3 分钟 14. 再加入 400µl 预热到 65ºC Elution Buffer 至柱子的膜中央 室温静置 5 分钟 4,000 x g 离心 3 分钟 15. 丢弃 DNA 结合柱, 把 DNA 保存于 -20 或 -80 第 8 页共 12 页
方案 3. 植物 DNA 大量提取 (D3163) 该方案适合于从 2-5g 新鲜 / 冻藏植物样品 或 0.3-1g 干燥的植物样品, 种子提取高纯度的总 DNA 纯化的 DNA 包括基因组 DNA 和叶绿体 DNA 以下离心都在室温下进行 准备材料和工具 无水乙醇 (96-100%) 灭菌 50ml 离心管和移液枪头 中型离心管 ( 5,000 x g) 65 水浴锅 氯仿 / 异戊醇 (24:1) 研钵和液氮 2- 疏基乙醇 ( 可选 ) PVP-40 按瓶子标签所示, 用无水乙醇稀释 Buffer GW1, 并于室温保存 按瓶子标签所示, 用无水乙醇稀释 Buffer GW2, 并于室温保存 操作流程 : 1. 用液氮把植物样品研磨成细小的粉末 转移 2-5g 新鲜样品或 0.3-1g 干燥样品至 50ml 离心管中 注 : 正确使用组织用量, 才能获得理想结果 过量样品会造成柱子堵塞, 而引起产量和纯度下降 由于植物样品 DNA 和其它代谢物质含量差异很大 初次实验时, 我们推荐使用 2.5g 新鲜样品或 500mg 干燥样品, 根据实验结果再调整组织用量 2. 立即加入 18ml Buffer PTL/2-Me 和 100µl RNase Solution 至样品中 立即涡旋使样品充分分散 65ºC 水浴 60 分钟, 期间涡旋混匀 3-5 次 注 : 使用前, 按 1 ml Buffer PTL 加入 20 µl 2- 疏基乙醇 该混合液可在室温放置 2 周 若植物样品富含多酚类物质, 称取一定量的 PVP-40, 加到 Buffer PTL1/2-Me 至终浓度为 2%(W/V), 振荡使 PVP-40 充分溶解 PVP-40 可以结合多酚类物质, 减少多酚类物质对 DNA 的损伤 Buffer PTL/2-Me/PVP-40 混合液可以在室温放置 2 周 3. 加入 18 ml 氯仿 / 异戊醇 (24:1), 剧烈涡旋 60 秒混匀 室温静置 5 分钟 第 9 页共 12 页
4. 4,000 x g 离心 15 分钟 小心转移上清液至新的离心管中 5. 加入等倍体积 Buffer PBL 至上清液中 涡旋混匀 30 秒 6. ( 可选 ) 加入 0.5 倍体积的无水乙醇至样品中 涡旋混匀 30 秒 注 : 加入乙醇可以提取高产量, 但若样品多糖类物质含量比较高, 省略这一步能有效去除多糖类的物质 7. 把 HiPure gdna 大量柱装在收集管中 转移混合液 (<20ml) 至柱子中 4,000 x g 离心 5 分钟 8. 倒弃滤液把柱子装回收集管 把剩余混合液转移至柱子 4,000 x g 离心 5 分钟 重复此步直到把所有混合液都转移至柱子中过滤完毕 9. 倒弃滤液把柱子装回收集管 加入 10ml Buffer GW1( 已用无水乙醇稀释 ) 至柱子中 4,000 x g 离心 5 分钟 10. 倒弃滤液把柱子装回收集管 加入 15ml Buffer GW2( 已用无水乙醇稀释 ) 至柱子中 4,000 x g 离心 5 分钟 11. 倒弃滤液把柱子装回收集管 加入 15ml Buffer GW2( 已用无水乙醇稀释 ) 至柱子中 4,000 x g 离心 5 分钟 12. 倒弃滤液把柱子装回收集管 加入 15ml 无水乙醇至柱子中 4,000 x g 离心 5 分钟 13. 倒弃滤液把柱子装回收集管 4,000 x g 离心 10 分钟去除柱子中残留的乙醇 14. 将柱子转移至新的 50ml 离心管中 加入 700µl 预热到 65ºC Elution Buffer 至柱子的膜中央 室温静置 5 分钟 4,000 x g 离心 5 分钟 15. 再加入 700µl 预热到 65ºC Elution Buffer 至柱子的膜中央 室温静置 5 分钟 4,000 x g 离心 5 分钟 16. 丢弃 DNA 结合柱, 把 DNA 保存于 -20 第 10 页共 12 页
方案 4. DNA 纯化该方案适合于从各种粗制的植物 DNA 样品中进一步纯化 DNA 该流程采用高盐法介异过柱结合, 无需醇类介异, 因而可效去除粗制 DNA 样品中的色素, 多糖类物质, 蛋白质等杂质 得到的基因组 DNA 纯度高, 可直接用于各种敏感的运用 DNA 的回收率约为 50-60% A. 小量 DNA 纯化 (<20µg) 1. 短暂离心 DNA 产物 用灭菌水将样品体积调整至 350µl 2. 加入 350µl Buffer PBL, 涡旋或颠倒混匀 3. 短暂离心收集管壁上的液滴 按方案 1 的第 7-15 步进行操作 B. 中量 DNA 纯化 (<100µg) 1. 短暂离心 DNA 产物 用灭菌水将样品体积调整至 1.5ml 2. 加入 1.5ml Buffer PBL, 涡旋或颠倒混匀 3. 短暂离心收集管壁上的液滴 按方案 2 的第 7-15 步进行操作 C. 大量 DNA 纯化 (<500µg) 1. 短暂离心 DNA 产物 用灭菌水将样品体积调整至 5ml 2. 加入 5ml Buffer PBL, 涡旋或颠倒混匀 3. 短暂离心收集管壁上的液滴 按方案 3 的第 7-16 步进行操作 第 11 页共 12 页
常见问题解答 该列表可能有利于解决提取过程所碰到的问题 此外,HiPure 的技术人员也可以随时为您提供服务, 若您对试剂盒存在问题或建议, 或您在分子生物学碰到问题, 都请您联系我们 我们将竭尽能力为您排 扰难解 现象柱子堵塞转移上清液时带有太多沉淀裂解液非常粘稠离心速度太低加入氯仿后, 混匀不够 DNA 产量低样品匀浆不充分样品裂解不充分不正确的结合条件产生絮状沉淀时, 没有打散洗脱效率不够 Buffer GW2 中乙醇没有加入或加入量不够柱子没有空甩 原因及解决方法在下一次提取过程中, 转移上清液时不要吸到沉淀物 若吸到沉淀物, 可把上清液再离心一次 某些植物样品中含有丰富的粘液和高分子多糖, 会让裂解液变得非常粘稠 减少样品用量或加入 Buffer PTL 的用量 提高离心速度在下次制备时, 加入氯仿时一定要剧烈振荡混匀 充分混匀时, 溶液变成均一的乳白状 用液氮将样品研磨细小的粉末状 或延长珠磨仪的研磨时间和速度 加入 Buffer PTL 后, 没有让植物样品充分分散 而涡旋无法让样品充分分散, 可用移液枪吸打几次 计算上清液的体积, 加入正确的 Buffer PBL 和无水乙醇 当加入 Buffer PBL 和无水乙醇时, 有些样品会产生明显的絮状沉淀物, 必须用移液枪吸打尽量打散沉淀物 洗脱时 Elution Buffer 预热至 65, 并加到膜中央, 室温放置 3 分钟 Elution Buffer 的洗脱体积不够 按说明书或瓶子标签所示, 加入正确的乙醇 柱子必须空甩 2-3 分钟以去除膜上残留的乙醇 第 12 页共 12 页
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