Plant Leaf Direct PCR Kit Plant Leaf Direct PCR Kit Plant Leaf Direct PCR Kit-UNG For plant leaves containing low polysaccharide and polyphenol components Plant Leaf Direct PCR Plus Kit Plant Leaf Direct PCR Plus Kit-UNG For plant leaves containing high polysaccharide and polyphenol components For performing PCR directly from Plant leaves without prior DNA purification. Research use only. Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 1/22
目 录 产品介绍........ 3 产品特点............ 4 试剂盒应用............. 4 产品质量控制............ 4 试剂盒内容.......... 5 试剂盒组分信息.......... 6 储存条件...... 7 注意事项............ 7 直接 PCR 实例电泳图........... 8 操作前准备事项............. 9 实验材料和设备........... 9 安全性.............. 9 操作指南......... 10 植物叶片直接 PCR 操作步骤......... 11 多糖多酚植物叶片直接 PCR 操作步骤........ 15 对照反应............... 17 操作示意图.............. 18 植物叶片直接 PCR 操作示意图............ 18 多糖多酚植物叶片直接 PCR 说明.......... 19 问题分析指南............... 20 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 2/22
产品介绍 本产品采用独特的裂解缓冲液体系, 能够快速的从植物 ( 如 : 水稻 小麦 烟草 玉米 大豆 油菜等 ) 的叶片样本中释放出基因组 DNA, 用于 PCR 反应 裂解缓冲液处理叶片时, 叶片无需研磨或剪碎处理, 因此特别适合大规模基因检测 裂解缓冲液释放基因组 DNA 过程可以在 5-10min 内完成, 不需要其他去蛋白 RNA 或者次生代谢产物的过程, 即可将释放出的微量 DNA 作为模板进行 PCR 反应 2 Leaf PCR Easy TM Mix 具有很强的 PCR 反应抑制物耐受性, 能直接以植物材料的裂解产物为模板, 进行高效特异性扩增 该试剂包含公司专门针对直接 PCR 反应改造的 D-Taq DNA Polymerase dntps MgCl 2 反应缓冲液 PCR 反应增强剂 优化剂和稳定剂 与直接裂解液配合使用能够快速简便地对样品进行检测, 并具有灵敏度高 特异性强 稳定性好等特点 2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG) 在 2 Leaf PCR Easy TM Mix 的基础上用 dutp 替代了 dttp, 并同时加入能够降解含有 dutp 模板的 UNG 酶 (Uracil-N-glycosylase) 在 PCR 反应前, 利用 UNG 酶降解含有尿嘧啶的 PCR 产物,UNG 酶对不含有尿嘧啶的模板不会造成任何影响, 从而保证扩增的特异性和准确性, 防止了大规模基因检测时可能出现的 PCR 产物污染问题 D-Taq DNA polymerase 是 Foregene 为直接 PCR 反应专门研制出的 DNA polymerase D-Taq DNA polymerase 对多种 PCR 反应抑制剂具有极强的的耐受性 在各种复杂反应体系中均能高效扩增痕量的 DNA, 扩增速度可达 2Kb/min, 特别适合进行直接 PCR 反应 根据植物样本差异, 该产品分为两个大类 : 植物直接 PCR 试剂盒 (Plant Leaf Direct PCR Kit) 和多糖多酚植物直接 PCR 试剂盒 (Plant Leaf Direct PCR Plus Kit); 在 PCR 检测阶段, 客户也可以根据实验需求, 选用普通的 2 Leaf PCR Easy TM Mix 或是具有防 PCR 扩增产物污染作用的 2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG) Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 3/22
产品特点 无需进行费时而昂贵的 DNA 纯化 样品需求量小, 直径 2mm(1mg) 的叶片即可进行实验 无需研磨 破碎叶片等特殊处理, 操作简便 优化的 PCR 体系, 使 PCR 具有更高的特异性 更强的 PCR 反应抑制物耐受性 防污染 PCR 体系 2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG), 有效消除由 PCR 产物所引起的污染, 保证扩增的特异性和准确性 试剂盒应用 适用范围 : 多种植物叶片 样本裂解释放的 DNA: 仅用作 PCR 模板 试剂盒可用于以下用途 : 转基因植株鉴定 植物基因分型等 产品质量控制 按照福际生物试剂盒质量检测体系标准 (FOREGENE s Total Quality Management System), 每一批次的植物叶片直接 PCR 系列试剂盒都严格进行多次测试, 确保每一批次试剂盒质量的可靠性和稳定性 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 4/22
试剂盒内容 试剂盒组成 Plant Leaf Direct PCR Kit 植物叶片直接 PCR 试剂盒 TP-0211T TP-02111 TP-02112 TP-02113 50 次 200 次 500 次 2000 次 Buffer P1 3ml 10ml 25ml 100ml Part I Buffer P2 3ml 10ml 25ml 100ml 6 DNA Loading Buffer 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 4 Part II 2 Leaf PCR Easy TM Mix 500μl 1ml 2 1.7ml 3 1.7ml 12 说明书 1 份 1 份 1 份 1 份 Plant Leaf Direct PCR Kit-UNG 植物叶片直接 PCR 试剂盒 (UNG) TP-0212T TP-02121 TP-02122 TP-02123 试剂盒组成 50 次 200 次 500 次 2000 次 Part I Buffer P1 3ml 10ml 25ml 100ml Buffer P2 3ml 10ml 25ml 100ml 6 DNA Loading Buffer 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 4 Part II 2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG) 500μl 1ml 2 1.7ml 3 1.7ml 12 说明书 1 份 1 份 1 份 1 份 Plant Leaf Direct PCR Plus Kit 多糖多酚植物叶片直接 PCR 试剂盒 TP-0213T TP-02131 TP-02132 TP-02133 试剂盒组成 50 次 200 次 500 次 2000 次 Buffer PS1 2ml 8ml 20ml 80ml Part I Buffer P2 3ml 10ml 25ml 100ml 6 DNA Loading Buffer 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 4 Part II Buffer PS2 500μl 2ml 5ml 20ml 2 Leaf PCR Easy TM Mix 500μl 1ml 2 1.7ml 3 1.7ml 12 说明书 1 份 1 份 1 份 1 份 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 5/22
Plant Leaf Direct PCR Plus Kit-UNG 多糖多酚植物叶片直接 PCR 试剂盒 (UNG) TP-0214T TP-02141 TP-02142 TP-02143 试剂盒组成 50 次 200 次 500 次 2000 次 Buffer PS1 2ml 8ml 20ml 80ml Part I Buffer P2 3ml 10ml 25ml 100ml 6 DNA Loading Buffer 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 4 Part II Buffer PS2 500μl 2ml 5ml 20ml 2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG) 500μl 1ml 2 1.7ml 3 1.7ml 12 说明书 1 份 1 份 1 份 1 份 试剂盒组分信息 Buffer P1 Buffer PS1: 提供植物叶片裂解反应所需的环境 Buffer PS2: 补充提供多糖多酚植物叶片裂解反应所需的环境 Buffer P2: 中和裂解产物, 使其不影响后续 PCR 反应 2 Leaf PCR Easy TM Mix: 包括福际生物特别改造的热启动 Taq DNA Polymerase dntps MgCl 2 反应缓冲液 PCR 反应增强剂 优化剂以及稳定剂等 PCR 反应时, 只需将适当的裂解混合液 引物 ddh2o 添加到 2 Leaf PCR Easy TM Mix 中即可用于 PCR 反应 2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG): 在 2 Leaf PCR Easy TM Mix 的基础上用 dutp 替代了 dttp, 并同时加入能够降解含有 dutp 模板的 UNG 酶, 从而能够有效防止 PCR 扩增产物污染 6 DNA Loading Buffer: 该 Loading Buffer 中不含有 SDS 建议在进行琼脂糖凝胶电泳时, 配搭使用试剂盒附赠的 6 DNA Loading Buffer, 以便取得好的电泳结果 切勿使用含有 SDS 的 Loading Buffer, 否则在电泳时会在泳道中有一大团拖尾亮光, 影响实验结果 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 6/22
储存条件 1. 输运条件 全程低温冰盒运输, 保证试剂盒 Part II 处于 <4 状态 2. 保存条件 本试剂盒 Part I 保存在常温或 2-8 试剂为 Buffer P1&Buffer P2( 或 Buffer PS1&Buffer P2) 6 DNA Loading Buffer 试剂在干燥条件下, 可保存 12 个月 ; 如需保存更长时间可置于 2 8 注意 : 若低温保存,Buffer P1( 或 Buffer PS1) 溶液容易产生沉淀 在使用前务必将试剂盒内的溶液在室温中放置一段时间, 必要时可在 37 水浴中预热 10min, 待沉淀消失, 并摇匀溶液后再使用 本试剂盒 Part II 保存在 -20 试剂为 2 Leaf PCR Easy TM Mix ( 或 2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG)) Buffer PS2( 仅限多糖多酚系列 若频繁使用, 也可置于 4 短期保存 ( 限 10 天内用完 ) 注意事项 :( 请务必在使用试剂盒前仔细阅读注意事项 ) 直接法只适合于多糖多酚含量低的植物叶片样本, 多糖多酚样本请采用裂解法 注意实验用具的清洁以及实验的操作手法, 避免样本间的交叉污染 请尽量使用植物新鲜幼嫩叶片进行实验 若选用成熟的叶片, 请避免使用叶片主脉部位组织 若 Buffer P1 或 Buffer PS1 有沉淀析出, 可放置于 37 待沉淀消失, 并混匀溶液后再使用 Buffer PS2 应避免长时间暴露在空气中, 使用后需置于 -20 保存 若频繁使用, 也可置于 4 短期保存 ( 限 10 天内用完 ) 2 Leaf PCR Mix 应避免反复冻融, 否则会影响 PCR 效率 如果环境温度过高,2 Leaf PCR Mix 可能会变浑浊, 可置于冰上放置 1-2min, 待溶液澄清, 上下颠倒混匀 3-5 次后再使用 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 7/22
电泳检测时, 切勿使用含有 SDS 的 Loading Buffer, 否则在电泳时会在泳道中出 现一大团拖尾亮带, 影响实验结果 直接 PCR 实例电泳图 植物叶片直接 PCR 系列试剂盒可以处理多种植物叶片, 提供的 2 Leaf PCR Mix 有很强的 PCR 反应抑制物耐受性和检测灵敏度高 扩增特异性强 使用试剂盒裂解混合液作为模板扩增相关基因,1.5% 琼脂糖凝胶电泳分析, 见下图 : Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 8/22
操作前准备事项 使用本试剂盒前, 请务必仔细阅读说明书 植物叶片直接 PCR 系列试剂盒操作简单 方便 快速, 说明书提供了整个试剂盒的完整信息和正确使用方法 请在使用前准备 好必要的实验材料和设备 实验材料和设备 各种来源的植物叶片 ( 新鲜的 冷冻保存的 ) 1.5ml 无菌离心管 0.2ml 无菌 PCR 管 台式离心机 ( 13,400 g) PCR 仪 95 水浴或金属浴 移液器等 安全性 本产品仅供科研使用, 请勿用于医药 临床医疗 食品及化妆品等用途 使用化学品时, 穿戴合适的实验服, 手套, 防护眼镜等 Buffer P1 Buffer PS1 含 SDS: 刺激性 致敏性 Buffer P1 Buffer PS1 含 NaOH: 刺激性 致敏性 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 9/22
操作指南 本说明书根据实验材料差异, 分别提供了植物叶片和多糖多酚叶片快速释放 DNA, 并 进行 PCR 检测的方法 客户可根据自己的实验材料, 按照相应的实验说明进行操作 材料取用说明 直接法 : 可使用打孔器 ( 或剪刀 ) 剪取直径 2-3mm 叶片组织置于 PCR 反应体系即可 若选用成熟的叶片, 请避免使用叶片主脉部位组织 裂解法 : 可使用打孔器 ( 或剪刀 ) 剪取直径 5-7mm 叶片组织置于裂解液中裂解 若选用成熟的叶片, 请避免使用叶片主脉部位组织 预防样本间交叉污染 为了避免样本间交叉污染, 每次取样后都需要将取样器材的刃口或与样本直接接触的部位浸入 2% 次氯酸钠溶液中, 反复洗刷数次进行清洗, 然后用干净的纸巾擦干残余液体后再进行使用 为了试验方便, 也可准备多个取样器材, 在使用完后进行统一清洗, 确保每一单独样本均使用的是无污染的取样器材 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 10/22
植物叶片直接 PCR 操作步骤 针对多糖多酚含量低的植物叶片, 如 : 小麦叶片 水稻叶片 玉米叶片等 试剂盒根据不同实验需要, 提供了两种操作方法 直接法仅需要将一小片植物组织直接加入 PCR 反应体系即可 ; 裂解法则是将少量含有植物组织的裂解产物加入 PCR 反应体系 其中裂解法适合目的片段较长, 扩增难度较大, 以及需要以同一样本进行多次 PCR 扩增的实验 一 直接法 ( 仅限多糖多酚含量低的植物叶片样本 ) 1. 在 200μl PCR 管内加入相应的 2 Leaf PCR Easy TM Mix 或 2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG), 再添加对应的引物, 并用 ddh 2 O 使其稀释为 1 (PCR 体系配制见下表 1) 2. 剪取 1-2mg 叶片碎块 ( 直径 2-3mm) 加入配制好的 1 PCR 反应体系中 注意 : 确保叶片碎块完全被 PCR 反应液浸没, 切勿加入过量叶片组织 3. 根据优化好的 PCR 条件 ( 退火温度等 ) 进行 PCR 反应 2 Leaf PCR Easy TM Mix 反应条件见下表 2-1;2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG) 反应条件见下表 2-2 注意 : 尽量使用优化后的条件进行 PCR 反应, 可以得到更好的结果 4. 琼脂糖凝胶电泳检测结果 注意 : 建议使用随试剂盒提供的 6 DNA Loading Buffer, 切勿使用含有 SDS 的 Loading Buffer 进行电泳 表 1:PCR 反应体系配制 PCR 体系添加内容用量终浓度 2 Leaf PCR Mix 1 * 10μl 25μl 1 Forward Primer (10μM) 0.5μl 1μl 0.2-0.25μM 2 * Reverse Primer (10μM) 0.5μl 1μl 0.2-0.25μM 2 * 叶片组织 (DNA 模板 ) 1-2mg ( 直径 2-3mm) 2-3mg ( 直径 3-3.5mm) ddh 2 O ( 灭菌蒸馏水 ) 9μl 23μl Total Volume 20μl 50μl 1*: 根据试剂盒的不同,2 Leaf PCR Mix 分别为 :2 Leaf PCR Easy TM Mix 或 2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG) 2*: 通常引物终浓度为 0.2μM 可以得到较好结果 反应性能较差时, 可以在 0.1-0.5μM 范围内调整引 物浓度 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 11/22
注意 : 此体系配制仅作参考, 实验室可根据 PCR 体系大小, 调整叶片组织的用量, 切勿加入过量 叶片组织 配制好 PCR 反应体系, 置于涡旋仪上涡旋混匀, 瞬时离心将反应液集于管底 表 2-1:2 Leaf PCR Easy TM Mix 反应条件 步骤 温度 时间 循环数 内容 1 94 3min 1 预变性 2 94 10sec 变性 3 50-65 20sec 35-40 引物退火 4 72 x min (2kb/min) 1 * 延伸 5 72 5min 1 终延伸 表 2-2:2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG) 反应条件 步骤 温度 时间 循环数 内容 1 50 5min 1 UNG 酶处理 2 94 5min 1 灭活 UNG 酶 & 预变性 3 94 10sec 变性 4 50-65 20sec 35-40 引物退火 5 72 x min (2kb/min) 1 * 延伸 6 72 5min 1 终延伸 1*:1kb 以内的 DNA 片段, 建议延伸时间为 30sec 注意 : 此表 PCR 条件仅供参考 PCR 反应条件视模板 引物等的结构条件不同而各异 在具体操 作中需要根据模板类型 目的片段大小 扩增片段的碱基序列和引物的 GC 含量及长短等具体情况 来设计最佳的反应条件, 包括退火温度, 延伸时间等 二 裂解法 A: 样本 DNA 释放 (PCR 模板预制 ) 1. 剪取 5-10mg 叶片组织 ( 直径 5-7mm) 到 200μl 或 1.5ml 离心管中 注意 : 切勿加入过量叶片组织 2. 加入 50μl Buffer P1, 确保裂解液能够完全浸没叶片组织 3. 盖好离心管盖, 将其置于 PCR 仪或金属浴中,95 裂解 10min 注意 : 加热后, 如果管壁上液体较多, 可瞬时离心将液体收集到离心管底部 4. 加入 50μl Buffer P2, 用微量移液器吹打或者涡旋混匀 5. 所得裂解混合液可 4 保存 (5 天以内 ) 或直接作为模板进行 PCR 反应 若需要 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 12/22
长期保存, 可以将裂解混合液置于 -20 进行保存 B:PCR 反应鉴定 1. 取适量的 A 步骤处理好的裂解混合液添加到 2 Leaf PCR Easy TM Mix 或 2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG), 再添加相应的引物, 并用 ddh 2 O 使其稀释为 1 (PCR 体系配制见下表 3) 注意 : 模板量占 PCR 体系的 10-20% 之间最佳, 不宜超过 30%( 如 20μl 的 PCR 体系中, 加入 2-4μl 裂解液即可, 不宜超过 6μl) 2. 将 PCR 体系混匀, 根据优化好的 PCR 条件 ( 退火温度等 ) 进行 PCR 反应 2 Leaf PCR Easy TM Mix 反应条件见下表 4-1;2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG) 反应条件见下表 4-2 注意 : 尽量使用优化的 PCR 条件进行 PCR 反应, 可以得到更好的结果 3. 琼脂糖凝胶电泳检测结果 注意 : 建议使用随试剂盒提供的 6 DNA Loading Buffer, 切勿使用含有 SDS 的 Loading Buffer 进行电泳 表 3:PCR 反应体系配制 PCR 体系添加内容用量终浓度 2 Leaf PCR Mix 1 * 10μl 25ul 1 Forward Primer (10μM) 0.5μl 1μl 0.2-0.25μM 2 * Reverse Primer (10μM) 0.5μl 1μl 0.2-0.25μM 2 * 裂解混合液 (DNA 模板 ) 4μl 10μl ddh 2 O ( 灭菌蒸馏水 ) 5μl 13μl Total Volume 20μl 50μl 1*: 根据试剂盒的不同,2 Leaf PCR Mix 分别为 :2 Leaf PCR Easy TM Mix 或 2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG) 2*: 通常引物终浓度为 0.2μM 可以得到较好结果 反应性能较差时, 可以在 0.1-0.5μM 范围内调整引物浓度 注意 : 此体系配制仅作参考, 实验室可根据需要调整 PCR 体系大小, 添加适当比例的裂解混合液即可 配制好 PCR 反应体系, 置于涡旋仪上涡旋混匀, 瞬时离心将反应液集于管底 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 13/22
表 4-1:2 Leaf PCR Easy TM Mix 反应条件 步骤温度时间循环数内容 1 94 3min 1 预变性 2 94 10sec 变性 3 50-65 20sec 35-40 引物退火 4 72 x min (2kb/min) 1 * 延伸 5 72 5min 1 终延伸 表 4-2:2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG) 反应条件 步骤 温度 时间 循环数 内容 1 50 5min 1 UNG 酶处理 2 94 5min 1 灭活 UNG 酶 & 预变性 3 94 10sec 变性 4 50-65 20sec 35-40 引物退火 5 72 x min (2kb/min) 1 * 延伸 6 72 5min 1 终延伸 1*:1kb 以内的 DNA 片段, 建议延伸时间为 30sec 注意 : 此表 PCR 条件仅供参考 PCR 反应条件视模板 引物等的结构条件不同而各异 在具体操 作中需要根据模板类型 目的片段大小 扩增片段的碱基序列和引物的 GC 含量及长短等具体情况 来设计最佳的反应条件, 包括退火温度, 延伸时间等 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 14/22
多糖多酚植物叶片直接 PCR 操作步骤 针对多糖多酚含量高的植物叶片组织, 如 : 棉花叶片 香蕉叶片 A: 样本 DNA 释放 (PCR 模板预制 ) 1. 将 50μl 裂解液 (40μl Buffer PS1 和 10μl Buffer PS2) 加入 200μl 或 1.5ml 离心管中 注意 : 由 Buffer PS1 和 Buffer PS2 配制成的裂解液最好现配现用 ; 若需短时间保存, 可以将混合液置于 4 保存, 保存时间不宜超过 6h 2. 剪取 5-10mg 叶片组织 ( 直径 5-7mm) 到含有上述裂解液的离心管中, 确保裂解液能够完全浸没叶片组织注意 : 切勿加入过量叶片组织 3. 盖好离心管盖, 将其放置于 PCR 仪或金属浴中,95 裂解 5-10min 注意 : 若材料多酚含量非常高 ( 裂解 10 min, 裂解液颜色呈棕黄色或棕红色 ), 可以缩短裂解时间至 5min 加热后, 如果管壁上液体较多, 可瞬时离心将液体收集到离心管底部 4. 加入 50μl Buffer P2, 用微量移液器吹打或涡旋混匀 5. 所得裂解混合液可 4 保存 (5 天以内 ) 或直接作为模板进行 PCR 反应 若需要长期保存, 可以将裂解混合液置于 -20 进行保存 B:PCR 反应鉴定 1. 取适量的 A 步骤处理好的裂解混合液添加到 2 Leaf PCR Easy TM Mix 或 2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG), 再添加相应的引物, 并用 ddh 2 O 使其稀释为 1 (PCR 体系配制见下表 5) 注意 : 模板量占 PCR 体系的 5-10% 之间最佳, 不宜超过 20%( 如 20μl 的 PCR 体系中, 加入 1-2μl 裂解液即可, 不宜超过 4μl) 2. 将 PCR 体系混匀, 根据优化好的 PCR 条件 ( 退火温度等 ) 进行 PCR 反应 2 Leaf PCR Easy TM Mix 反应条件见下表 6-1;2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG) 反应条件见下表 6-2 注意 : 尽量使用优化的 PCR 条件进行 PCR 反应, 可以得到更好的结果 3. 琼脂糖凝胶电泳检测结果 注意 : 建议使用随试剂盒提供的 6 DNA Loading Buffer, 切勿使用含有 SDS 的 Loading Buffer 进行电泳 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 15/22
表 5:PCR 反应体系配制 PCR 体系添加内容 用 量 终浓度 2 Leaf PCR Mix 1 * 10μl 25ul 1 Forward Primer (10μM) 0.5μl 1μl 0.2-0.25μM 2 * Reverse Primer (10μM) 0.5μl 1μl 0.2-0.25μM 2 * 裂解混合液 (DNA 模板 ) 2μl 5μl ddh 2 O ( 灭菌蒸馏水 ) 7μl 18μl Total Volume 20μl 50μl 1*: 根据试剂盒的不同,2 Leaf PCR Mix 分别为 :2 Leaf PCR Easy TM Mix 或 2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG) 2*: 通常引物终浓度为 0.2μM 可以得到较好结果 反应性能较差时, 可以在 0.1-0.5μM 范围内调整引 物浓度 注意 : 此体系配制仅作参考, 实验室可根据需要调整 PCR 体系大小, 添加适当比例的裂解混合液 即可 配制好 PCR 反应体系, 置于涡旋仪上涡旋混匀, 瞬时离心将反应液集于管底 表 6-1:2 Leaf PCR Easy TM Mix 反应条件 步骤 温度 时间 循环数 内容 1 94 3min 1 预变性 2 94 10sec 变性 3 50-65 20sec 35-40 引物退火 4 72 x min (2kb/min) 1 * 延伸 5 72 5min 1 终延伸 表 6-2:2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG) 反应条件 步骤 温度 时间 循环数 内容 1 50 5min 1 UNG 酶处理 2 94 5min 1 灭活 UNG 酶 & 预变性 3 94 10sec 变性 4 50-65 20sec 35-40 引物退火 5 72 x min (2kb/min) 1 * 延伸 6 72 5min 1 终延伸 1*:1kb 以内的 DNA 片段, 建议延伸时间为 30sec 注意 : 此表 PCR 条件仅供参考 PCR 反应条件视模板 引物等的结构条件不同而各异 在具体操作 中需要根据模板类型 目的片段大小 扩增片段的碱基序列和引物的 GC 含量及长短等具体情况来 设计最佳的反应条件, 包括退火温度, 延伸时间等 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 16/22
PCR 对照反应 在 PCR 结果分析时, 不管是阳性结果或阴性结果, 如果没有对照反应, 我们都不能确定结果是否可靠 为了便于后续实验结果的分析, 我们建议在进行 PCR 时, 设置阳性和阴性 PCR 对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰 A: 阳性对照 选用容易扩增的样本保守基因的引物和采用纯化的样本 DNA 作为模板进行阳性对照反 应以确定 PCR 反应体系和条件的正确性以及 2 Leaf PCR Mix 有效性 其反应体系的配 制见下表 7 表 7: 对照 PCR 反应体系配制 PCR 体系添加内容 用 量 终浓度 2 Leaf PCR Mix 1 * 10μl 25ul 1 Forward Primer (10μM) 2 * 0.5μl 1μl 0.2-0.25μM Reverse Primer (10μM) 2 * 0.5μl 1μl 0.2-0.25μM Template(DNA) 3 * Xμl Xμl 100-200ng ddh 2 O ( 灭菌蒸馏水 ) (9-X)μl (23-X)μl Total Volume 20μl 50μl 1*: 根据试剂盒的不同,2 Leaf PCR Mix 分别为 :2 Leaf PCR Easy TM Mix 或 2 Leaf PCR Easy TM Mix(UNG) 2*: 引物可选用该样本比较容易扩增的保守基因的引物, 如 β-actin 基因 叶绿体基因组上的保守序 列等 ( 请确保这些引物的可用性 ) 3*: 可选用样本纯化的 DNA, 也可根据实验需要, 自行选择 B: 阴性对照 PCR 反应体系被污染会导致 PCR 结果出现假阳性, 需要设置阴性对照来排除 取 ddh 2 O 作为模板, 用目的基因引物进行 PCR 扩增, 以排除 PCR 体系是否被污染或实验是否有其他污染源 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 17/22
操作示意图 普通植物叶片直接 PCR 操作示意图 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 18/22
多糖多酚植物叶片直接 PCR 操作示意图 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 19/22
问题分析指南 以下针对植物叶片直接 PCR 系列试剂盒在实验中可能遇到的问题进行分析, 希望能对您的实验有所帮助 另外, 对于在操作说明和问题以外的其他实验或技术上的问题, 我们设有专门的技术支持帮助您 如有任何需要可联系我们 :028-66070618 或 E-mali: Tech@foregene.com 在试剂盒的使用过程中往往会遇到许多问题, 比如 : 没有 PCR 扩增产物 PCR 特异 性差等, 以下就分别对使用植物叶片直接 PCR 系列可能会遇到的问题进行分析 建议 在进行直接 PCR 的同时设置阳性对照或阴性对照以便后续分析实验结果 正对照 待测样本均无条带 1. PCR 反应体系或反应条件不合适 建议 : 使用梯度 PCR 摸索 PCR 最佳反应条件 2. PCR 试剂保存不当失去活性 建议 :2 Leaf PCR Mix 应保存于 -20, 使用时避免反复冻融 若使用频繁, 可在 4 短时间存放 3. 引物设计问题 建议 : 尝试重新设计引物进行检查 正对照有目的条带, 待测样本无条带或条带弱 1. 叶片中多糖多酚含量较高, 裂解混合液呈棕黄色甚至棕红色 建议 : 使用多糖多酚植物叶片直接 PCR 试剂盒 (Plant Leaf Direct PCR Plus Kit) 2. 裂解液 中和液加入比例不当, 裂解混合液影响 PCR 体系的 ph 值 建议 : 正常条件下, 中和后的裂解混合液的 ph 应该在 7-8 左右 ( 裂解产物和 Buffer P2 严格按照 1:1 的量进行中和 ) 3. 样本裂解混合液保存不当或保存时间过久,DNA 基因组已经降解 建议 : 裂解液可在 4 保存 5 天, 尽量使用新制备的裂解液混合液进行 PCR 4. 裂解混合液中抑制物过多 建议 : 在 PCR 反应体系 5-20% 范围内优化模板加入量 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 20/22
5. PCR 循环数不足 建议 : 适当增加 PCR 的循环数, 推荐在 35-40 循环为佳 因为模板复杂, 一般 PCR 反应要比用纯化的 DNA 模板多 5-10 个循环为佳 非特异性扩增 1. 退火温度偏低 建议 : 适当提高退火温度 2. PCR 循环数过多 建议 : 适当降低循环次数, 推荐在 35-40 循环为佳 3. 引物浓度偏高 建议 : 适量降低引物用量 通常引物终浓度为 0.2μM 可以得到较好结果 反应性能较差时, 可以在 0.1-0.5μM 范围内调整引物浓度 4. 模板加入量过多 建议 : 配制 PCR 反应体系时, 适量减少模板加入量 空白对照出现目的条带 1. 操作工具或试剂污染 建议 : 实验所有试剂或器材均应高压灭菌 实验时应规范操作, 避免在加样操作中溶液倒吸或飞溅 2. 样本间交叉污染 建议 : 每个取样器只对一个样本使用 ; 或取完一个样本后, 将取样器刃口或与样本直接接触的部位浸入 2% 的次氯酸钠溶液中, 反复涮洗数次进行清洗, 然后用干净的纸巾擦干残液后再进行使用 3. PCR 产物污染 建议 : 如果实验室检测同类型样本多, 最好使用 UNG 防 PCR 产物污染系统的试剂盒进行实验 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 21/22
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