20期

中国农学通报 2012,28(20):5862 Chinese Agricultural Science Bulletin 连翘酯苷对内毒素作用下 RAW264.7 细胞功能的影响 芦山, 陈舒楠, 官佳懿, 沈红 ( 北京农学院动物科学技术学院, 北京 102206) 摘要 : 为探讨连翘酯苷 (FS) 对内毒素 (LPS) 作用下 RAW264.7 细胞增殖 分泌 NO 和 TNFα 吞噬功能的影响 收集处于对数生长期细胞, 用含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养细胞, 在培养液中分别加入脂多糖 (LPS) 以及不同浓度 40 80 160 µg/ml 的 FS 共培养 采用 MTT 法检测细胞增殖,Griess 和 ELISA 法分别检测 RAW 264.7 细胞分泌 NO 和 TNFα 量, 染色法检测细胞吞噬能力 结果表明 : 低 中剂量 FS 可显著促进细胞增殖, 而中和高剂量 FS 可缓解 LPS 对细胞的刺激作用 ; 与 LPS 组比较,FS 对 LPS 刺激的 RAW 264.7 细胞分泌 NO 影响不明显, 但中 高剂量 FS 明显促进 RAW 264.7 细胞分泌 ;LPS 与 FS 均能提高巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力 FS 对 RAW264.7 细胞增殖 分泌 NO 和 TNFα 以及吞噬功能都有影响, 结果提示这可能是连翘酯苷调节细胞免疫功能的机制之一 关键词 : 连翘酯苷 ;RAW264.7; 免疫功能中图分类号 :S853.74 文献标志码 :A 论文编号 :20120656 Effects of Forsythoside on Cell Functions of RAW 264.7 Stimulated by LPS Lu Shan, Chen Shunan, Guan Jiayi, Shen Hong (College of Animal Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206) Abstract: To investigate the effects of Forsythoside (FS) on proliferation, NO secretion, TNFα secretion and phagocytosis of RAW 264.7 cells stimulated by LPS. RAW 264.7 cells in the logarithmic phase were collected and cultured in RPMI1 640 containing 10% fetal blood serum in vitro and the stimulant Lipopolysaccharide (LPS). Different FS concentrations of 40, 80, 160 μg/ml were added individually in culture medium. Cell proliferation was detected by MTT, ELISA and Griess methods were detected TNFα and NO levels, and cell phagocytosis were analyzed by staining. The results showed that low and medium dose of FS could significantly promoted RAW 264.7 cell proliferation, and the proliferation of cells stimulated by LPS was alleviated at medium and high dose of FS. Compared with LPS group, NO level secreted from LPSstimulated RAW 264.7 cells treated with FS had not significant effect, but cells secretion of TNFα was markedly promoted by high dose of FS. FS could enhanced macrophage phagocytosis to chicken red blood cells. FS might had an impact on proliferation, NO and TNFa secretion, and phagocytic ability of RAW 264.7 cells, which might be one of mechanisms of FS to regulate cellular immune function. Key words: Forsythoside; RAW 264.7; cell function 0 引言 中药连翘为木犀科植物连翘 (Forsythia suspense) 的干燥果实, 其性寒 味辛苦 无毒 入肺 心 胆经具有 [1] 清热解毒, 疏散风热的功效 80 年代初,Nishibe 等分 别从连翘的叶子和果实中分离得到连翘酯苷 A 与连翘 酯苷, 并证明二者为同一物质, 此后, 连翘酯苷作为中 基金项目 : 北京市教委项目 连翘提取物抗猪传染性胃肠炎病毒药效作用的研究 (KM200910020006) 第一作者简介 : 芦山, 男,1986 年出生, 河北人, 硕士, 主要从事免疫药理研究 通信地址 :102206 北京农学院动科学院,Tel:01080799469,Email: lushan86@126.com 通讯作者 : 沈红,1961 年出生, 女, 安徽人, 博士, 主要从事免疫药理 通信地址 :102206 北京农学院动科学院,Tel:01080799469,Email: shenhong912@sina.com 收稿日期 :20120301, 日期 :20120604

芦山等 : 连翘酯苷对内毒素作用下 RAW264.7 细胞功能的影响 59 药连翘的主要活性成分, 逐渐成为研究热点, 其主要药 理作用如下 : [2] 抗菌 : 王宏军等通过体内外实验发现连翘酯苷 对链球菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑制作用 ; 冯 [3] 淑怡等通过实验发现连翘酯苷能较强的抑制绿脓杆 [4] 菌 大肠杆菌及金色葡萄球菌 ; 高淑娟等研究发现连 [5] 翘可以强力的摧毁细菌内毒素 抗病毒 : 毛东有等 发现连翘酯苷可诱导小鼠产生干扰素 α (IFNα); 胡克 [67] 杰等通过体外实验研究发现连翘酯苷可抑制柯萨奇 病毒 B 组 3 型与 7 型 腺病毒 3 型与 7 型以及合胞病毒, 并能使人外周血白细胞生成 IFNα, 从而达到多种免 [8] 疫调节作用, 协同其抗菌 抗病毒作用 ; 马元元等发现 连翘酯苷能够显著上调感染了 PCV2 的小鼠 IFNα 和抗 病毒蛋白 Mx1 的表达, 且高剂量给药 12 h 后发挥显著 [9] 的抗 PCV2 病毒作用 ; 李华伟等研究发现连翘酯苷可 诱导 CEK 细胞表达 IFNα 并上调其表达量, 且能正向调 [10] 节 JAKSTAT 信号通路 免疫调节 :Liu 等研究发现 连翘酯苷对 Con A 诱导的淋巴细胞转化具有显著的促 进作用, 说明其能增强免疫 上述研究表明连翘酯苷 具有十分明显的抗菌 抗病毒以及免疫调节作用, 其中 北京农学院的吴国娟及其实验室成员通过对连翘酯苷 多年的研究, 处于国内该领域研究的领先水平 目前, 关于连翘酯苷对巨噬细胞免疫功能影响的 研究还未见报道 本研究以小鼠单核巨噬细胞白血病 细胞 RAW 264.7 为靶细胞, 探讨连翘酯苷对 LPS 刺激 的巨噬细胞增殖 分泌 NO 和 TNFα 以及吞噬功能的 影响 1 材料与方法 1.1 材料 连翘酯苷标准品, 购自辽宁省生物医药研发中心 ; RAW 264.7 由中科院动物所提供 ;RPMI 1640 培养基 ( 美国 HyClone 公司 ); 胎牛血清 (FBS)( 杭州四季青公 司 );LPS( 美国 Sigma 公司 );MTT( 美国 Sigma 公司 ); TNFα 试剂盒 ( 武汉博士德公司 ); 其余试剂均为国产 分析纯 1.2 方法 1.2.1 实验分组收集对数期 RAW 264.7, 用含 10% 胎 牛血清的 PMI 1640 培养基调整细胞悬液浓度至 1 10 6 个 /ml, 空白对照组为只加含 10% 胎牛血清的 RPMI l640 完全培养液,LPS 对照组为含 1 µg/ml LPS 的 l640 完全培养液,FS 组为含 0 40 80 160 μg/ml 连 翘酯苷的 RPMI l640 完全培养液,FS+LPS 组为含 0 40 80 160 μg/ml 连翘酯苷与 1 µg/ml LPS 的 l640 完 全培养液 所有实验重复 3 次 1.2.2 MTT 法检测细胞增殖将 1 10 6 个 /ml 巨噬细胞悬液接种于 96 孔细胞培养板上, 每孔加入 200 µl 细胞悬液, 按照实验设计分组, 每个样品 3 个重复孔 培养 24 h 后, 每孔加入 MTT 8 μl(5 mg/ml) 继续孵育 4 h, 弃去上清, 然后每孔加入 150 μl DMSO 溶解 MTT 甲簪沉淀, 用微型振荡器振荡混匀, 变色后用酶联免疫检测仪测定 570 nm 波长处的吸光度 A 570 nm 1.2.3 Griess 试剂法检测 NO 分泌将 1 10 6 个 /ml 巨噬细胞悬液接种于 96 孔细胞培养板上, 每孔加入 200 µl 细胞悬液, 按照实验设计分组, 每个样品 3 个重复孔 加药培养 24 h 后, 吸取培养液上清 100 µl 至酶标板中, 加入等体积的 Griess 试剂, 室温反应 5 min 后测定 490 nm 的吸光值 用浓度为 0~100 µmol/l 的 NaNO 2 绘制标准曲线, 根据 NaNO 2 标准曲线计算细胞培养上 清液中 NO 2 的浓度 1.2.4 ELISA 法检测 TNFα 的分泌将 1 10 6 个 /ml 巨噬细胞悬液接种于 96 孔细胞培养板上, 每孔加入 200 µl 细胞悬液, 按照实验设计分组, 每个样品 3 个重复孔 取加药培养 24 h 的细胞培养液上清, 按 TNFα ELISA 试剂盒说明书进行检测 1.2.5 瑞氏 吉姆萨染色法检测吞噬能力取对数生长期 RAW 264.7 细胞, 收集巨噬细胞悬液, 离心后细胞计数 用 RPMI 1640 完全培养液调整活细胞数至 2 10 5 个 /ml 将细胞加入 6 孔板 ( 板内事先放入盖玻片 ),2 ml/ 孔, 细胞数 4 10 5 个 / 孔 在 5% CO 2 细胞培养箱中 37 贴壁 4 h, 吸弃原有培养基, 向各孔分别加入含 FS LPS FS+LPS 的培养液,FS 终浓度为 20 μg/ml, LPS 终浓度为 1 μg/ml, 另设空白对照孔, 培养 24 h 鸡翅下静脉采血, 制备新鲜鸡红细胞, 加入 PBS, 1700 r/5 min,pbs 重复离心两次, 用无血清的 1640 调整细胞浓度为 2 10 6 个 /ml 6 孔板中巨噬细胞加药培养 24 h 后, 吸弃上清, 加入 37 预温的无菌 PBS, 轻轻冲洗 2 次 吸弃 PBS, 加入含有 2 10 6 个 /ml 鸡红细胞的 RPMI1640 2 ml/ 孔 37,5% CO 2 培养箱共同孵育 2.5 h 将 6 孔培养板中待检测孔培养液吸弃,PBS 洗 3 次取出盖玻片, 待表面稍干, 加入甲醇固定 10 min, 晾干 用 Wright 染液将盖玻片覆盖, 约 30 s 后, 加入 2~3 滴 Gimsa 染液 1~2 min 后, 逐滴加磷酸盐缓冲液, 直至膜面上染色液形成表面张力为止, 染色 15 min,ddh 2O 冲洗至无继续褪色为止 显微镜观察, 计数 200 个细胞, 计算吞噬率 : 吞噬百分率 =200 个吞噬细胞中吞噬鸡红细胞的吞噬细胞数 /200 个吞噬细胞 l00%

60 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 2 结果与分析实验数据以均值 ± 标准差 ( ±s) 表示, 采用 t 检验分析比较各组数据, 方差不齐时用 t' 检验,*P<0.05 为差异显著,**P<0.01 为差异极显著 2.1 FS 对 LPS 作用下 RAW264.7 细胞增殖的影响采用 MTT 法对 RAW 264.7 细胞增殖进行分析, 结果见图 1 从图 1 知, 与空白对照组比较,LPS 组 A 570 nm 明显降低, 而 40 80 μg/ml FS 低 中 2 个浓度处理组 A 570 nm 显著提高 ; 与 LPS 组相比,LPS+FS 中 高 2 个浓度处理组 A 570 nm 显著降低 结果显示 : 巨噬细胞经 LPS 处理后, 细胞增殖能力显著下降, 低 中 2 个浓度 FS 单独作用于巨噬细胞, 可显著促进细胞增殖 ; 低浓度 FS+ LPS 组细胞增殖显著低于对照组, 但与 LPS 组差异不显著, 中 高浓度 FS 与 LPS 共同作用则可显著加剧 LPS 对巨噬细胞增殖的抑制作用,FS 浓度与活细胞数量呈反比 吸光度值 组别浓度 vs 0(a<0.05,b<0.01), vs LPS (c<0.01),vs 40(d<0.05,e<0.01),vs 80 (f<0.05,g<0.01);40(ac) 80(cd) 160(ef) 代表 FS(μg/mL);40(a) 80(bce) 160(bceg) 代表 LPS+FS(μg/mL) 图 1 不同浓度连翘酯苷对 RAW 264.7 细胞增殖的影响 2.2 FS 对 LPS 作用下 RAW264.7 分泌 NO 的影响 采用 Griess 试剂法对细胞分泌 NO 情况进行分 析, 结果见图 2 由图 2 知, 与空白对照组相比,LPS 组 NO 2 浓度显著上升,40 μg/ml FS 处理组 NO 2 浓度显著 下降而 160 μg/ml FS 处理组 NO 2 浓度显著上升 ; 与 LPS 组相比,3 个浓度 FS+LPS 处理组 NO 2 浓度均显著 降低, 但均高于空白对照组 结果显示 LPS 作用后的巨噬细胞分泌 NO 显著增加, 低浓度 FS 单独作用于巨噬细胞, 可显著抑制 NO 分泌, 中等浓度 FS 处理组差异不显著, 高浓度 FS 处理组 NO 分泌显著增加 ;FS+ LPS 各组 NO 分泌量均高于空白对照组而低于 LPS 组, 其中低浓度 FS+LPS 组显著高于中 高浓度 FS+ NO2 浓度 /μm 组别浓度 vs 0(a<0.01),vs LPS (b<0.01),vs 40(c<0.01),vs 80 (d<0.01)vs,160 (e<0.01),lps+40(f<0.01);40(ab) 80(bc) 160(abd) 代表 FS(μg/mL);40(abc) 80(bdf) 160(abef) 代表 LPS+FS(μg/mL) 图 2 连翘酯苷对 LPS 作用下 RAW264.7 分泌 NO 的影响

芦山等 : 连翘酯苷对内毒素作用下 RAW264.7 细胞功能的影响 61 LPS 组 2.3 FS 对 LPS 作用下 RAW264.7 分泌 TNFα 的影响采用 ELISA 法对细胞分泌 TNFα 的情况进行分析, 结果如图 3 由图 3 知, 与空白对照组相比,LPS 组 TNFα 分泌量显著上升, 各浓度的 FS 也能促进 TNFα 的分泌, 其中 80 μg/ml 的 FS 促进作用最明显, 但各组效果均低于 LPS 组 ; 与 LPS 组相比, 各浓度 FS+LPS 处理组 TNFα 分泌量均有所升高, 且与 FS 浓度呈线性相关, 其中只有高浓度组与 LPS 组相比差异显著 肿瘤坏死因子浓度 组别浓度 vs 0(a<0.01),vs LPS (b<0.01),vs 40(c<0.01);40(ab) 80(acb) 160(ab) 代表 FS(μg/mL) 图 3 连翘酯苷对 LPS 作用下 RAW264.7 分泌 TNFα 的影响 2.4 FS 对 RAW264.7 吞噬功能的影响采用瑞氏 吉姆萨染色法对巨噬细胞的吞噬能力进行分析, 结果见图 4 由图 4 可知, 与对照组相比较, LPS 处理组吞噬率显著上升,FS 处理组与 LPS+FS 处理组吞噬率也显著提高, 各组间吞噬率差异并无统计学意义 由结果可知,LPS 与 FS 均能大幅提高 RAW 264.7 的吞噬功能,FS 与 LPS 合用对 RAW 264.7 吞噬能力的影响与两药单独作用时无显著差别 吞噬百分率 处理组图 4 连翘酯苷对 RAW264.7 吞噬能力的影响 3 结论与讨论有研究表明巨噬细胞主要通过凋亡来实现其清除病原微生物等生物学功能, 并可根据需要介导或抑制自身及其他细胞凋亡, 从而在免疫调节中发挥重要 作用 [1112] 革兰氏阴性菌的脂多糖 (lipopolysaccharide LPS) 又叫内毒素 (ednotoxin), 它通过一氧化氮 (NO) 和 活性氧诱导巨噬细胞的凋亡, 一定浓度的 NO 是 MΦ 凋 亡信息传导通路中的关键环节 LPS 刺激巨噬细胞产生 NO 和大量的活性氧, 而活性氧也能导致 MΦ 的凋亡 [13] 肿瘤坏死因子 α (TNFα) 主要由单核 巨噬细胞分 泌, 能杀伤和抑制肿瘤细胞, 促进中性粒细胞吞噬, 抗 感染, 引起发热, 诱导肝细胞急性期蛋白合成, 促进髓 样白血病细胞向巨噬细胞分化, 是重要的炎症因子, 并 参与某些自身免疫病的病理损伤, 它通过与其相应的 细胞表面受体结合, 激活受体偶联的 G 蛋白信号转导 途径, 将凋亡信号向下游传导, 此外,TNFα 还可以通 过影响细胞内核转录因子 (NFκB) 的产生或失活, 进一 步活化巨噬细胞凋亡相关的信号转导通路, 促进巨噬 细胞凋亡 [14] 连翘酯苷具有抗氧化的作用, 并且可以 抗内毒素, 这种作用是通过直接摧毁内毒素对其进行 [15] 拮抗而非抑制其活性 由本实验可知,FS 对于 RAW264.7 分泌 TNFα 具有显著的促进作用 ;FS 单独 作用于 RAW 264.7 时, 低浓度的 FS 抑制 NO 分泌, 促 进细胞的增殖, 而高浓度时则促进 NO 分泌, 并降低活 细胞数, 这可能是由于 NO 及 TNFα 诱导的细胞凋亡 有关 FS 作用于 LPS 刺激的 RAW 264.7 时, 一方面通 过摧毁 LPS 对其拮抗, 抑制其诱导的 NO 分泌 ; 另一方 面通过促进细胞分泌 TNFα, 活化细胞凋亡通路, 减少 活细胞数 无论 LPS 还是 FS, 均可以通过激活巨噬细

62 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 胞而加强其吞噬能力 由此可见, 连翘酯苷对于巨噬细胞免疫功能的调节作用包括多个方面, 是十分复杂的 本实验为更好地阐明连翘酯苷的免疫调节机理提供新的线索和理论依据 参考文献 [1] Nashibe S, Kazuko O, Hiroki T, et al.the structure of forsythiaside isolated from Forsythis suspensea[j].chem.pharm.bull,1982,30(3): 10481050. [2] 王宏军, 蒋红, 吴国娟. 连翘酯苷在体外与体内的抑菌效果研究 [J]. 中国饲料,2005(10):2627. [3] 冯淑怡, 李先荣, 孙建宁. 连翘酯苷抗感染 解热作用研究 [J]. 现代生物医学进展,2006,6(10):7375. [4] 高淑娟, 戴锡珍, 要华民. 几种清热解毒中药抗内毒素作用的比较实验 [J]. 天津中医,1992(3):42. [5] 毛东有, 杨明, 吴国娟, 等. 连翘酯苷对小鼠的急性毒性及体内诱生 IFNα 的研究 [J]. 动物医学进展,2009,30(6):1517. [6] 胡克杰, 曲福君, 孙考祥, 等. 连翘酯甙体外诱生人外周血白细胞中 α 干扰素的实验研究 [J]. 中国中医药科技,2004,11(6):355356. [7] 胡克杰, 徐凯建, 王跃红, 等. 连翘酯甙体外抗病毒作用的实验研究 [J]. 中国中医药科技,2001,8(2):89. [8] 马元元, 李华伟, 吴国娟, 等. 连翘酯苷对 IFNα 和 Mx1 表达的影响 [J]. 中国农业科学,2010,43(15):32373243. [9] 李华伟, 张羽璐, 吴国娟, 等. 连翘酯苷对鸡 IFNα 和 JAKSTAT 信号通路相关因子的影响 [J]. 中国农业科学,2011,44(18):39033908. [10] Liu D L, Zhang Y, Xu S X, et al. Phenylethanoid glycosides from Forsythia suspensa Vahl[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,1998,7(2):103105. [11] 蒯守刚, 俞用芳, 朱启贯. 巨噬细胞研究进展 [J]. 中国实验诊断学, 2008,12(2):266267. [12] 吴淑燕, 周正宇. 细菌感染诱导巨噬细胞凋亡的机制 [J]. 国外医学流行病学传染病学分册,2002,29(4):236239. [13] 周正宇, 吴淑燕, 薛智谋. 细菌感染与小鼠巨噬细胞凋亡 [J]. 上海实验动物科学,2002,22(4):249253. [14] 杨爱婵, 李素平, 穆进军. 肿瘤坏死因子致巨噬细胞凋亡分子机制的研究 [J]. 中国医学研究与临床,2007(3):3841. [15] 刘金. 连翘酯苷的提取分离及活性研究 [D]. 山西 : 山西大学,2006.