17期

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辅纪
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1 中国农学通报 2013,29(17):32-36 Chinese Agricultural Science Bulletin 连翘酯苷对小鼠不同组织巨噬细胞功能的影响张永红, 芦山, 陈舒楠, 柴丽娜, 沈红, 崔德凤 ( 北京农学院动物科学技术学院, 北京 ) 摘要 : 探讨连翘酯苷 (FS) 对小鼠不同组织巨噬细胞 (Mφ) 功能的影响不同组织 Mφ 体外培养在添加 FS 和脂多糖 (LPS) 的培养基中, 通过 MTT ELISA 和 Griess 瑞氏染色检测细胞增值分泌和吞噬能力 FS 组腹腔 Mφ 与 LPS+FS 组骨髓 Mφ 吸光度 A 值极显著提高, 但 FS 组脾脏和骨髓 Mφ 以及 LPS+FS 组腹腔和脾脏 MφA 值降低明显 ;FS 显著提高环磷酰胺 (CY) 处理鼠脾脏和骨髓 Mφ 增值但明显抑制腹腔 Mφ 增殖 FS 显著抑制 Mφ 分泌肿瘤坏死因子 -α (TNF-α);FS 明显促进 LPS 刺激的腹腔 MφNO 分泌, 但脾脏 MφNO 分泌量明显减少, 且有显著剂量依赖性 ;FS 明显抑制 CY 处理鼠脾脏和骨髓 Mφ 分泌 NO FS 促进 LPS 刺激的腹腔 Mφ 吞噬鸡红细胞能力 FS 对小鼠不同组织 Mφ 增殖 TNF-α 和 NO 分泌以及吞噬能力都有影响, 这可能是 FS 调节细胞免疫功能的机制之一关键词 : 连翘酯苷 ; 小鼠 ; 巨噬细胞 ; 增殖 ; 分泌 ; 吞噬作用中图分类号 :S 文献标志码 :A 论文编号 : Effects of Forsythoside on the Functions of Different Tissue Phagocytes from Mice Zhang Yonghong, Lu Shan, Chen Shunan, Chai Lina, Shen Hong, Cui Defeng (College of Animal Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing ) Abstract: The objective was to investigate effects of forsythoside (FS) on the function of different tissue macrophages from the mice. Different tissue macrophages were in vitro cultured in media containing FS and lipopolysaccharide (LPS). Cell proliferation, secretion and phagocytic ability of macrophages were detected by MTT, ELISA, Griess and Wright-Giemsa staining method. Compared with LPS group, it was very significantly increased in absorbance values of peritoneal macrophage treated with FS and of bone marrow macrophages stimulated with FS+LPS, but decreased markedly in those of spleen and bone marrow macrophages treated with FS and of peritoneal and spleen macrophages with FS + LPS. FS significantly improved cell proliferation of spleen and bone marrow macrophages while significantly inhibited that of peritoneal macrophages from mice treated with cyclophosphamide (CY). FS significantly decreased TNF-α secretion level of macrophages. FS significantly increased NO secretion level of LPS-stimulated peritoneal macrophages and reduced that of spleen macrophages and also there was a significant dose-dependence. FS significantly inhibited NO secretion levels of spleen and bone marrow macrophages from CY-treated mice but did not affect peritoneal macrophages. FS could enhance the phagocytosis of LPS-stimulated peritoneal macrophages to chicken red blood cells. FS had an impact on cell proliferation of different tissue macrophages, TNF-α and NO secretion, and phagocytic ability, which might be one of FS mechanism to regulate cellular immune function. Key words: Forsythoside(FS); mice; macrophage; proliferation; secretion; phagocytosis 基金项目 : 北京市教委项目抗菌中兽药成分组方原则及新兽药研发 (PXM2012_014207_000013), 酶抑制法检测辛辣蔬菜农药残毒时假阳性问题的研究 (KM ) 第一作者简介 : 张永红, 男,1963 年出生, 安徽人, 硕士, 主要从事中药免疫药理与兽医预防研究通信地址 : 北京农学院动科学院,Tel: , zhangyonghong@sina.com 通讯作者 : 沈红, 女,1961 年出生, 安徽人, 博士, 主要从事免疫药理研究通信地址 : 北京农学院动科学院,Tel: , shenhong912@sina.com 崔德凤, 女,1963 年出生, 北京人, 博士, 主要从事免疫学研究通信地址 : 北京农学院动科学院,Tel: , cdfffff@163.com 收稿日期 : , 修回日期 :

2 张永红等 : 连翘酯苷对小鼠不同组织巨噬细胞功能的影响 33 0 引言中药连翘为木犀科植物连翘的干燥果实, 主要含 [1] 有苯乙醇苷类挥发油类木脂素及其苷类等中国最早的神农本草经专著记载连翘性寒味辛苦无毒入肺心胆经, 具有清热解毒, 疏散风热等功 [2] [3] 效按照中药功效分类, 将其纳入清热药范畴连翘酯苷 (FS) 是连翘中一个主要的有效成分, 具有广泛的药理活性, 表现十分明显的抗氧化抗菌和抗病毒 [4] 抗炎镇痛清除自由基和减轻过氧化损伤的作用巨噬细胞是一种具有可塑性和多能性的细胞群体, 广泛存在于机体的各个脏器和组织, 在体内外不同的微环境影响下, 参与免疫炎性反应及维持内环境的稳 [5-6] 定, 表现出明显的功能差异, 这些功能不是所有的巨噬细胞在同一时间内执行, 也不是所有巨噬细胞均具 [7] 有这些功能, 因此, 巨噬细胞显示出高度的异质性巨噬细胞在形态学生物化学表型和功能等方面表现出异质性, 不同种群个体器官及组织的巨噬细胞具有异质性, 相同个体器官和组织的巨噬细胞也存在异 [8] 质性, 巨噬细胞的异质性在免疫调控中具有重要作用目前,FS 在不同组织巨噬细胞方面的研究报道较少本研究以小鼠不同组织巨噬细胞为靶点, 采用 MTT Griess ELISA 等方法分析 FS 对脂多糖刺激巨噬细胞体外增殖分泌细胞因子和吞噬功能等功能的影响, 探讨其免疫学效应及免疫作用机制 1 材料与方法 1.1 材料脂多糖 (LPS) 噻唑蓝 (MTI) 和环磷酰胺 (CY) 均购自美国 Sigma 公司, 连翘酯苷 (FS) 购自中国兽药监察所, 肿瘤坏死因子 -α (TNF-α) 试剂盒购自华明生物公司,RPMI1640 培养基和胎牛血清 (FCS) 购自美国 Gibco-BRL 公司,Griess 试剂本实验室配置, 酶标仪为美国 Bio-RAD 公司产品, 二氧化碳培养箱 ( 日本 SANYO) 健康 6~8 周龄雌性昆明小鼠购自军事医学科学院实验动物中心 1.2 方法实验分组将收集的不同组织巨噬细胞分组, 对照组为只加含 10% 胎牛血清的 RPMll640 完全培养液, LPS 组为含 1 mg/l LPSl640 完全培养液,(LPS+FS) 组为 1 mg/l LPS+ 不同浓度 FS ( mg/l)1640 完全培养液 ; 环磷酰胺处理组为小鼠腹腔注射环磷酰胺 (40 mg/kg), 连续注射 7 天所有实验重复 3 次, 每组 3 个重复小鼠不同组织巨噬细胞收集和培养腹腔巨噬细胞 : 参照文献 [7] 制备小鼠腹腔巨噬细胞,RPMI1640 培养液调节细胞浓度为 L, 备用脾脏巨噬细胞 : 取小鼠颈椎脱臼致死, 无菌操作剥取出脾脏, 置于加有 RPMI1640 培养液和滤器的培养皿内, 用注射器柄将其磨碎, 收集于离心管,1500 r/min 离心 5 min, 弃上清, 加入红细胞裂解液消化红细胞, 用培养液终止反应, 1500 r/min 离心 5min, 弃上清, 加入培养液反复洗 3 次, 培养液重悬细胞加入细胞培养皿, 置于 37 5% CO 2 培养箱中培养 2~4 h, 去除未贴壁细胞, 收集贴壁细胞 1500 r/min 离心 5 min, 弃上清, 培养液重悬细胞, 调整细胞浓度为 L, 备用 : 取小鼠颈椎脱臼致死, 无菌操作剥取胫骨股骨髂骨, 剔去肌肉组织, 剪去两端的骨骺, 吸取 5 ml RPMI1640 培养液的注射器从骨髓腔一端插入, 反复冲洗骨髓腔收集骨髓细胞于离心管, 后与上述制备脾脏巨噬细胞方法相同将 L 巨噬细胞悬液, 接种于 96 孔细胞培养板上, 每孔加入 200 µl 细胞悬液和不同浓度药物, 在 37 5% CO 2 的培养箱里培养 24 h MTT 法分析细胞增殖将 L 巨噬细胞悬液, 接种于 96 孔细胞培养板上, 每孔加入 200 µl 细胞悬液和不同浓度药物, 在 37 5% CO 2 的培养箱里培养 24 h, 弃去上清液, 每孔加入 8 µl MTT, 继续培养 4 h, 然后每孔加入 100 µl DMSO, 振荡 10 min 后, 酶标仪以 630 nm 为参比波长, 测定 570 nm 处的吸光值 ELISA 测定肿瘤坏死因子 -α (TNF-α) 将 /L 巨噬细胞悬液, 接种于 96 孔细胞培养板上, 每孔加入 200 µl 细胞悬液和 FS(80 mg/l), 在 37 5% CO 2 的培养箱里培养 24 h, 收集各组细胞上清液, 用 TNF-α ELISA 试剂盒测定, 实验操作按试剂盒说明进行 Griess 法测定 NO 收集各组细胞上清 100 µl 至酶标板中, 加入 100 µl Griess 试剂, 室温反应 15 min 后, 酶标仪测定 540 nm 吸光值与此同时, 用浓度为 0~100 µmol/l 的 NaNO 2- 绘制标准曲线, 根据标准曲线计算细胞上清液中 NO 2- 的浓度巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力分析将腹腔巨噬细胞悬液 /L 加入预先有盖玻片的 6 孔细胞板中, 在 37 5% CO 2 培养箱里贴壁培养 2 h, 然后每组加 FS (80 mg/l) 和 LPS 继续培养 24 h, 备用 ; 鸡翅下静脉采血制备新鲜鸡红细胞, 加入 PBS 稀释,1500 r/min 离心 5 min,pbs 重复洗 2 次, 用 1640 培养液调整细胞浓度为 /L, 加入备用的 6 孔板中与巨噬细胞共培养 2~ 4 h; 吸弃培养液,PBS 洗 3 次, 取出盖玻片, 待表面稍干后加入甲醇固定 10 min, 晾干后用瑞氏 - 吉姆萨染液将盖玻片覆盖, 染色 15 min,pbs 冲洗 ; 显微镜观察, 计算巨噬细胞吞噬鸡红细胞百分率统计学分析实验数据以平均数 ± 标准差表示, 采用 t 检验分析比较各组数据, 方差不齐时用 t' 检验,

3 34 中国农学通报 * P<0.05 为差异显著, ** P<0.01 为差异极显著 2 结果与分析 2.1 FS 对 LPS 刺激的不同组织巨噬细胞增殖的影响采用 MTT 法对 LPS 刺激下的不同组织巨噬细胞增殖进行分析, 由图 1 知, 与对照组 (C) 比较,LPS 处理腹腔巨噬细胞吸光度 (A 值 ) 明显降低, 而 LPS 处理脾脏和 A 值明显升高 ;FS 浓度为 80 mg/l 处理腹腔巨噬细胞 A 值极显著高于 LPS 组, 而 FS 处理脾脏和 A 值明显低于 LPS 组 ; 与 LPS 组比较,LPS+FS 组腹腔和脾脏巨噬细胞腹腔巨噬细胞脾脏巨噬细胞图 1 连翘酯苷对小鼠不同组织巨噬细胞增殖的影响 A 值明显降低, 但 LPS+FS 组 A 值极显著增加 2.2 FS 对 LPS 刺激的不同组织巨噬细胞分泌 NO 和 TNF-α 的影响采用 Griess 法对不同组织巨噬细胞分泌 NO 量分析, 与 LPS 组比较,FS+LPS 组腹腔巨噬细胞分泌 NO 量明显增加, 而脾脏巨噬细胞分泌 NO 量明显减少, 分泌 NO 量与对照组接近, 而 LPS 明显提高了巨噬细胞 NO 的分泌, 不同浓度 FS 组之间巨噬细胞分泌 NO 量增加且有显著性差异, 而且具有剂量依赖性 ( 图 2) 与 LPS 组比较,FS 组不同组织巨噬细胞分泌 TNF-α 量显著降低,LPS+FS 组脾脏巨噬细胞 TNF-α 量增加, 而腹腔和 TNF-α 量减少, 但差异不显著结果表明 FS 可减缓 LPS 刺激的腹腔和分泌 TNF-α 的作用, 但 FS 提高 LPS 刺激的脾脏巨噬细胞分泌 TNF-α( 图 3) 2.3 FS 对 LPS 刺激的不同组织巨噬细胞吞噬功能的影响通过姬姆萨染色法对巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力分析, 与对照组比较,LPS 组细胞吞噬率明显增加, 而 FS 明显提高了 LPS 刺激的腹腔巨噬细胞吞噬率 ( 图 4) 2.4 FS 对环磷酰胺处理的小鼠不同组织巨噬细胞增殖和分泌 NO 的影响与对照组比较,FS 组腹腔注射环磷酰胺小鼠的脾脏和 A 值极显著增加, 并呈现 FS 剂量依赖性增加, 腹腔巨噬细胞 A 值也明显增加, 但低于脾脏和 A 值, 结果表明细胞存活率高,FS 促进细胞增殖 ( 图 5) Griess 法检测腹腔注射环磷酰胺小鼠的不同组织巨噬细胞分泌 NO 量, 与对照组比较, 结果 FS 影响腹腔巨噬细胞 NO 分泌量的减少不明显, 但 FS 组脾脏和分泌 NO 量显著减少 ( 图 6)

4 张永红等 : 连翘酯苷对小鼠不同组织巨噬细胞功能的影响 35 腹腔巨噬细胞脾脏巨噬细胞浓度浓度 FS/(µg/mL) FS/(µg/mL) 浓度 FS/(µg/mL) 图 2 连翘酯苷对小鼠不同组织巨噬细胞分泌 NO 的影响浓度腹腔巨噬细胞脾脏巨噬细胞吞噬百分率图 3 连翘酯苷对小鼠不同组织巨噬细胞分泌 TNF-α 的影响 3 结论与讨论国内外研究表明,FS 有多种药理学活性, 对于抵抗细菌和病毒感染调节细胞因子活性清除自由基 [10] 提高机体的抗氧能力有重要作用胡克杰等研究发现连翘酯苷是迄今为止从连翘属植物中发现的抗菌活性最强的成分之一, 并且是连翘的主要特征性成分, 有很强的抗菌活性, 抗菌谱广, 对多种革兰氏阳性菌阴 [11] 性菌均有抑制作用 ; 高淑娟等通过体外试验发现连翘有很强的破坏细菌内毒素作用,FS 通过直接破坏内图 4 连翘酯苷对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响毒素以拮抗其作用本实验结果显示 FS 单独使用对腹腔巨噬细胞没有损害作用, 但对脾脏和增殖有一定影响,FS 明显减轻 LPS 对腹腔和脾脏巨噬细胞影响,FS 能显著提高免疫抑制鼠脾脏和增值, 这可能有部分骨髓和脾脏巨噬细胞未完全分化成熟,LPS 和 FS 成为刺激剂, 促进其分化成熟研究认为 :LPS 为内毒素具有复杂的生物活性, 能和免疫系统相互作用, 引起大量的抗炎症因子生成并释放, 对机体免疫有重要作用巨噬细胞是一种非特

5 36 中国农学通报脾脏巨噬细胞腹腔巨噬细胞浓度脾脏巨噬细胞腹腔巨噬细胞异性免疫细胞, 能吞噬和消灭外来异物以及自身衰老死亡的细胞, 在免疫反应中起到了递呈抗原, 调节免疫反应等重要作用 [12] NO 是巨噬细胞发挥吞噬功能的基本条件, 激活的巨噬细胞能分泌 NO, 随着 NO 的增加, 巨噬细胞吞噬功能增强,FS 能促进腹腔巨噬细胞分泌 NO, 影响巨噬细胞的吞噬功能, 增强机体的免疫作用 [13] 本实验结果 FS 明显抑制 LPS 刺激的脾脏巨噬细胞分泌 NO, 但促进腹腔巨噬细胞分泌 NO, 此外,FS 明显促进 LPS 刺激的腹腔巨噬细胞的吞噬功能, 其促进趋势与 FS 促进腹腔巨噬细胞 NO 的分泌趋势相同图 5 连翘酯苷对腹腔注射环磷酰胺小鼠不同组织巨噬细胞体外增殖的影响 TNF-α 主要由单核细胞和巨噬细胞分泌产生, 是一个多功能的细胞因子, 在感染炎症和自身免疫疾病中具有重要的调节作用 [14], 已知关节炎, 强直性脊柱炎, 败血症等免疫系统疾病与 TNF-α 过量释放密切相关, 以 TNF-α 为靶点的抗体可用于治疗多种自身免疫性疾病 [15] 研究发现 FS 不仅能诱发 IFN- 的产生, 而且 [4] [16] 对 TNF-α IL-6 也有一定的调控作用 Jiang 等通过大鼠心肌损伤模型研究 FS 对心脏的保护作用和抗炎机理, 结果表明 FS 可降低血清 TNF-α IL-6 的含量, 下调核因子 κb 及其抑制蛋白 I-κB 的表达, 减轻外周血淋巴细胞浸润和组织损伤本实验发现 FS 处理的巨噬细胞分泌 TNF-α 量极少, 而 LPS 显著提高巨噬细胞分泌 TNF-α,FS 抑制 LPS 刺激的腹腔和 TNF-α 的分泌量, 但促进 LPS 对脾脏巨噬细胞的作用, 使 TNF-α 的分泌量提高, 结果提示 FS 对不同组织巨噬细胞抗 LPS 的效应不一样, 可能 FS 直接中和或催毁 LPS, 也可能干扰 LPS 跨膜信号转导, 与转导通路下游产物 TNF-α mrna 的表达有关, 影响巨噬细胞活化综上所述, 从细胞反应水平看 FS 能抑制 LPS 刺激的不同组织巨噬细胞增殖 NO 和 TNF-α 的分泌, 影响腹腔巨噬细胞的吞噬功能, 研究结果提示 FS 有显著的抗 LPS 作用, 可能与直接中和内毒素并阻断内毒素的作用, 影响 LPS 刺激巨噬细胞活化的级联反应等参考文献 [1] 李倩, 冯卫生. 连翘的化学成分研究进展 [J]. 河南中医学院学报, 2005,20(1): [2] 中华人民共和国药典委员会编. 中华人民共和国药典 [M]. 北京 : 化学工业出版社,2005,117. [3] 张炜, 张汉明, 郭美丽, 等. 连翘的药理学研究 [J]. 中国现代应用药学杂志,2000,17(1):7-9 [4] 刘文博, 李德朋, 张桂林, 等. 连翘酯苷药理活性研究进展 [J]. 中国畜牧兽医,2011,38(7): [5] Gordon S. Macrophage heterogeneity and tissue lipids[j].j. Clin Invest,2007,117: [6] 李康, 郭强, 王翠妮, 等. M1 和 M2 型巨噬细胞表型的比较分析 [J]. 现代免疫学, (3): [7] 尹华华, 朱京慈, 李磊. 巨噬细胞的异质性 [J]. 细胞与分子免疫学杂志,2004,20(4): [8] Laskin D L, Weinberger B, Laskin J D. Functional heterogeneity in liver and lung macrophages[j]. J Leukoc Biol,2001,70(2): [9] 鄂征. 组织培养及分子细胞学技术 [M]. 北京 : 北京出版社出版, 1995,128. 图 6 连翘酯苷对腹腔注射环磷酰胺小鼠不同组织巨噬细胞体外分泌 NO 的影响 [10] 胡克杰, 徐凯建, 王栋, 等. 连翘酯苷体外抗病毒作用的实验研究 [J]. 中国中医药研究,2001,8(2): [11] 高淑娟. 几种清热解毒中药抗内毒性作用的比较实验 [J]. 天津中医,1992(3): [12] 刘静, 杨建雄. 连翘叶茶对小鼠非特异性免疫及应激作用的实验研究 [J]. 榆林学院学报,2006,16(2): [13] 赵娟, 刘扬, 冯琳, 等. 细菌脂多糖诱导巨噬细胞 NO 信号分子释放的研究进展 [J]. 黑龙江畜牧兽医,2011,2: [14] Old L J. Tumor necrosis factor [J].Sci Am,1988,258(5): [15] Clark I A. How TNF was recognized as a key mechanism of disease [ J]. Cytokine & Growth Factor Reviews,2007,18(3-4): [16] Jiang W L, Fu F H, Xu B M, et al. Cardiprotection eith forsythoside B in rat myocardial ischemia-reperfusion injury:relation to inflammation response [J].Phytomedicine,2010,17(8):

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20期中国农学通报 2012,28(20):5862 Chinese Agricultural Science Bulletin 连翘酯苷对内毒素作用下 RAW264.7 细胞功能的影响芦山, 陈舒楠, 官佳懿, 沈红 ( 北京农学院动物科学技术学院, 北京 102206) 摘要 : 为探讨连翘酯苷 (FS) 对内毒素 (LPS) 作用下 RAW264.7 细胞增殖分泌 NO 和 TNFα 吞噬功能的影响