品兔仔菜, 且蒲公英樣品皆為西洋蒲公英 將專一性引子改為探針, 可建立晶片檢測方法 本研究由 5.8S rrna-its 序列 PCR-RFLP ISSR 法皆可明確鑑定蒲公英 ; multiplex PCR 及晶片檢驗法除了可鑑定真偽, 亦可檢出混雜之偽品 分子標誌或晶片檢測尤其適用於以葉片 全草

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1 Yearbook of Chinese Medicine and Pharmacy, 26 (4), 47-80, 2008 中醫藥年報第 26 期第 4 冊 編號 :CCMP94-RD-009 中藥材真偽之分子標誌及檢驗方法建立 - 蒲公英 袁秋英 行政院農業委員會農業藥物毒物試驗所 摘要 中草藥於中國已流傳千年, 超過一萬種植物具有療效, 其中約 10% 為經常性使用的藥材 近年來中草藥藥材出現代用品及偽品, 使用不當容易影響療效也可能發生中毒現象, 這亦是中草藥品質管控不嚴謹之故 由於分生及 PCR 技術的研發, 使得分子標誌普遍應用於植物物種之鑑定 DNA 分子標誌法具有專一性 穩定性 微量 準確 易操作及快速等優點, 其中 ISSR 方法為較新的技術, 可用於鑑定族群的親緣關係及分辨品系間微小之差異 針對 18S-26S rdna 序列之比對, 亦為鑑定中草藥物種的有利證據, 常被應用於被子植物之親源關係之研究 本研究利用 ISSR 技術及 ITS-5.8S rrna-its 序列之差異, 進而設計為 PCR-RFLP 及 multiplex PCR 檢測方法, 建立蒲公英及其偽品 替代品之檢測系統, 提供為中草藥基原鑑定及品質控管之依據 蒲公英及 8 種偽品經 PCR 反應增幅之 5.8S rrna-its 核酸片段約為 730bp, 經解序及序列比對, 蒲公英屬植物之相似度較高, 台灣蒲公英與 8 種偽品之相似度則介於 80-88% 之間 蒲公英及 8 種偽品增幅之 5.8S rrna-its 核酸片段, 分別以 Mse I 限制酶反應, 可將約 730bp 的核酸, 切割為 2-4 條不同長度之多型性條帶 蒲公英及 8 種偽品經篩選 UBS ISSR 之 86 組引子, 大部份引子增幅結果無條帶或是不易明確區別的弱條帶 其中僅編號 857 引子經 PCR 反應可增幅 2-6 條多型性條帶, 明顯區別蒲公英及偽品 經由比對蒲公英與偽品 ITS1 及 ITS2 序列之異同, 分別設計 9 組專一性引子, 利用 multiplex PCR 可分別增幅台灣蒲公英 中國蒲公英 西洋蒲公英及偽品之專一性片段 市售蒲公英真偽之檢測結果顯示, 僅檢出 5% 樣品為蒲公英, 其餘 95% 樣品皆為偽 47

2 品兔仔菜, 且蒲公英樣品皆為西洋蒲公英 將專一性引子改為探針, 可建立晶片檢測方法 本研究由 5.8S rrna-its 序列 PCR-RFLP ISSR 法皆可明確鑑定蒲公英 ; multiplex PCR 及晶片檢驗法除了可鑑定真偽, 亦可檢出混雜之偽品 分子標誌或晶片檢測尤其適用於以葉片 全草 組織易破碎 粉末或液態之藥材或半成品之檢驗 由於晶片檢驗可同步檢測 96 個樣品, 具有快速 簡易及經濟等特點, 適用於進出口藥材認證制度之建立 關鍵詞 : 中藥材 分子標誌 基原鑑定 48

3 Number: CCMP94-RD-009 Molecular Markers Used in Detection of Adulteration Species of Taraxacum Mongolicum in Taiwan Chiou-Ing Yuan Taiwan Agricultural Chemicals and Toxic Substances Research Institute ABSTRACT Traditional China medicine (TCM) has been used for millennium in China. At present, over 10,000 species of plants have been found to have medicinal value and about 10% are frequently used in TCM. Substitutes and adulterants of TCM materials are often introduced intentionally or accidentally, thus serious interfering with their therapeutic effects, even leading to life- threatening poisoning. The absence of an objective and accurate inspection system is frequently cited as one of the major reasons for herbal poisoning. Benefiting from molecular cloning and PCR techniques, DNA markers have now become a popular means for identification and authentication of plant species. Inter simple sequence repeats (ISSR) are a new kind of molecular marker, can be used to identify different strains and races of organisms and to assess genetic relatedness in populations. Sequencing is a definitive means for identifying TCM. A representative sample is the internal transcribed spaces (ITS) from ribosomal DNA. The ITS region of 18S-26S rdna has proves to be a useful sequence for phylogenetic studies in many angiosperm families. Novel methods for molecular authentication of Taraxacum mongolicum were established in this study, based on PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) and direct sequencing of the ITS region of 18S-26S rdna. 49

4 The 5.8S rrna coding sequence is highly conserved in higher eukaryotes, but the ITS of the 5.8s rrna is variable among different species. Total genomic DNA from fresh leaves of T. formosanum, T. officinale, Ixeris chinensis, Pterocypsela indica, Sonchus oleraceus and Ixeris laevigata was extracted. The 5.8S rrna-its was amplified by PCR with a pair of primers located within the conserved coding region. By direct sequencing of PCR product and aligning the isolated nucleotide sequences of the three Taraxacum species and adulterants, sequence diversity was found in the spacer region. The PCR product of each species on the 5.8S rrna gene was digested with the restriction enzyme Mse I. Each fragment gave unique electrophoretic profiles for each species. From the initial screening of 86 ISSR primers, number 857 primer producted clear and reproductible bands and were thus used to identify the night different species. Night pairs of specific primers and probes were designed for three Taraxacum species and adulterants from ITS sequences by multiplex PCR and DNA chip detection. This result indicated that the methods is rapid, more accurate and applicable in identification of Taraxacum species at the DNA level. Keywords: Chinense Crude drugs, molecular marker, raw materials identification 50

5 壹 前言 近年來西藥在研發過程中, 已面臨重大瓶頸, 替代療法 (Alternative medicine) 的風潮, 使得中草藥成為備受注目的研究重點 世界衛生組織 (World Organization, WHO) 分別於 1996 及 1997 年訂定及公布了 草藥評估準則 (Guidelines for the Assesment of Herbal Medicines) 及 適當的使用草藥準則 (Guideline for Appropriate Use of Herbal Medicine), 其主要目的是供會員國參考, 以建立中草藥的適當法規標準 藥品品質 安全性及藥效的評估步驟, 進而協助會員國將草藥的發展列入國家政策與執行相關計畫之考量 由於中草藥藥材主要來自動 植及礦物等天然物, 其品質之優劣因其產地 栽種 採收時期及貯存條件而異, 導致藥材的變異性大, 無標準化之規格 因此 WHO 於 1998 年又分別公布 藥用植物原料品質管控方法 (Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials) 與 藥品的基本檢驗: 藥劑的物質 藥用植物原料和劑型 (Basic Tests for Drugs: Pharmaceutical Substances, Medicinal Plant Materials and Dosage Forms), 為因應全球醫藥產業大力投注於草藥療效研發的趨勢, 歐盟 美國相繼成立中草藥的管理單位, 制訂藥品研發 試驗 進出口的相關法規 美國 FDA 亦於 2000 年公布 植物性藥品審查準則草案(The Draft of Guidance for Industry Botanical Drug Products), 使得保健食品易於發展為藥品, 因此促進了中草藥研發為新藥的利基 行政院經濟部於 2000 年 5 月召開第四次生物技術產業策略 (SRB) 會議中, 提出 中草藥產業技術發展五年計畫, 積極推動中草藥產業技術發展 衛生署中醫藥委員會為了提升台灣中草藥國際化之競爭力, 擬規劃籌設 中藥品質管制中心, 訂定藥品 CMC (Chemistry, Manufacture and Control) 規範並推動中藥廠全面實施 GMP 系統, 欲使得中草藥產品品質符合安全有效 均一性及再現性的目標 台灣發展中草藥的最大優勢為具備優良的中草藥製造技術, 然而由於受限於栽種面積及昂貴工資等因素, 大約 90% 中藥材皆需仰賴中國進口, 貨源與價錢受制之外, 品質難以掌控, 成為重要的瓶頸 大陸的許多藥材來自野生, 過量採集使得某些物種瀕於滅絕, 而採用替代的偽劣植材, 其中人工種植的藥材也由於追求量產, 致使品種退化及品系混雜, 造成藥材的藥用成分含量大幅降低, 同時各產地栽培方法及採收時期不同, 導致藥材變異性大, 各批次產品品質無法穩定再現, 甚至農藥及重金屬殘留及產銷脫節等問題也日漸嚴重 目前台灣市售草藥也因此由於藥材來源混淆 同名異物及同物異名的情形, 容易發生誤用 混用 51

6 以及偽劣藥材等問題, 嚴重影響療效及用藥之安全性 因此如何有效鑑定及管控進口藥材, 以提升台灣中草藥品質及確保國人健康, 為當前刻不容緩的重要課題 中草藥性狀和顯微鑑定的傳統方法可分為四類 : 性狀鑑定法 顯微鑑定法 理化鑑定法及生物鑑定法 中華藥典 對於藥材標準分為來源 性狀 鑑別 檢查及含量測定等項 自 1996 年起中國醫藥學院即閞始針對臺灣市售易混用 誤用中藥品種進行相關之研究, 包括市場品收集 ; 本草 藥用植物學 化學成分及藥理及應用文獻調查 ; 顯微及化學鑑別 ; 藥理活性評估等性狀之探討, 已評估及測試之藥材有板藍根 大青葉 青黛 半夏 桑寄 石斛 金線連 白花蛇舌草 何首烏 萹蓄 蛇床子 栝蔞 冬蟲夏草及山楂等真偽與來源植物, 並收集相關資料, 於 2002 年編印為 台灣市售中藥材真偽及代用品圖集, 可提供為中藥 GMP 檢驗及醫師用藥之參考 由於傳統顯微鑑定之操作技術及判讀組織異同之難度較高, 且全草用藥植材必須採取多處不同部位檢驗, 以及藥粉樣品組織形態被破壞, 鏡檢結果判讀不易等問題, 因此發展分子鑑定及檢驗方法, 可使中草藥之基原鑑定更加完備 近年來生物技術繼限制酵素 (Restriction enzyme) 及聚合脢鏈鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 技術研發以來, 分子標誌 (molecular marker) 被普遍使用於核酸序列的差異比對, 進而應用於鑑定物種, 以及探討生物之遺傳變異 親源關係及群落演化等現象 目前分子標誌於植物遺傳多型性的分析方法, 包括限制片段長度多型性 (Restriction fragment length polymorphisms, RFLP) 隨機擴增多型性(Randomly amplified polymorphic DNA, RAPD) 簡單序列重複區間(inter-Simple sequence repeats, ISSR) 或微衛星核酸 (microsatellite DNA) 以及增殖片段長度多型性 (Amplified fragment length polymorphisms, AFLP) 等技術 其中 RFLP 方法之反應步驟較繁瑣, 需有大量且高品質 DNA 模板, 需預知檢測核酸之序列, 以及費用較高之缺點 RAPD 方法無法檢測異質體,PCR 之結果穩定性及再現性較差 AFLP 方法較 RFLP 操作時間短, 且可獲得較多資訊,AFLP 再現性較 RAPD 佳, 但是 AFLP 主要的限制為顯性標誌, 且使用試劑及設備皆較昂貴 ISSR 方法再現性及專一性皆較 RAPD 佳, 費用較 AFLP 低, 尤其適用於遺傳質微小差異的近親品系之區別, 因此 ISSR 方法成為近年來普遍使用的分子鑑定法 此外研究植物遺傳變異 親源關係及群落演化等現象, 亦常利用細胞核核糖體基因 (ribosomal DNA, rdna), 包括 18S 5.8S 及 26S 基因密碼區 52

7 及 internal transcribed spacer (ITS) external transcription spacer (ETS) 及 internal genetic spacer (IGS) 等間隔區之基因標誌, 一般而言,18S 5.8S 及 26S rdna 由於變異性低, 適用於科別之標誌, 而 ITS 及 ETS 由於具有演化特性之一致性 (concerted evolution), 而且序列長度約為 500bp, 適用於屬及種間之標誌,IGS 序列則適用於種間 種內 品系間之標誌 由於核酸檢驗法具有專一性 穩定性 微量 準確 易操作及快速等優點, 特別適合近緣品種 破碎與腐爛藥材 標本 古化石等珍貴樣品的鑑定, 後續可再結合生物晶片技術, 快速篩選高品質藥材, 並建立生藥質量標準 近年來中國大陸已開始注重珍貴及瀕危藥材之維繫, 正積極發展中草藥之 DNA 分子標誌研究, 同時亦對原生藥 中成藥及其基源進行真偽優劣的鑑定 相關的研究包括黃連 (Coptis species) 及黃芩 (Scutellaria spedies) 之 RAPD 鑑定 黨參 (Codonopsis species) 之 RFLP 鑑定 石斛 (Dendrobium species) 及蒼朮 (Atractylodes species) 5.8S rrna 之 PCR-RFLP 鑑定以及黃蓍 (Radix Astragali) 與西洋參 (Panax species) 於 5 或 10S rrna 序列之比對鑑定 台灣自 1998 年起台北醫學院即針對柴胡及石斛不同品系進行 RAPD 鑑定方法的研究, 中國醫藥學院則針對大戟屬植物研發基因晶片鑑定方法 目前尚有多種中草藥物種及品系未經核酸鑑定及藥理有效成份之評估 本研究欲針對臺灣市售易混用及誤用的中藥材, 進行分子鑑定之相關研究 但由於歷代本草對於藥材植物型態描述不夠詳盡, 各地區用藥和使用習慣不同, 以及藥材長期栽種造成品系混淆等問題, 使得正品藥材不易取得, 因此試驗植材優先選用之考量為市場需求量大 全草藥用且乾物料形態不易判別 正偽品藥理顯著差異或於台灣易於取得之植材, 包括蒲公英 (Taraxacum mongolicum) 正品植株及偽 替代植株台灣蒲公英 (T. formosanum Kitamura) 西洋蒲公英(T. officinale Weber) 兔仔菜 (Ixeris chinensis (Thunb.) Nakai) 刀傷草(Ixeris laevigata (Bl.)Sch.) 山萵苣( 鵝仔菜 Pterocypsela indica L.) 及苦滇菜 (Sonchus oleraceus L.) 等 首先採集此等植株, 進行植物形態特性之鑑定, 再依據分子鑑定方法操作難易度 檢測時間 再現性 費用及檢測之功能性等因素之考量, 選用二種分子標誌, 一為 5.8S rrna 及 ITS 序列之解序及多型性標誌 : 於 NCBI GenBank 比對序列可鑑定植材為何物 ; 利用 PCR-RFLP 可檢測不同樣品植材之異同 ; 設計專一性引子, 利用 multiplex PCR 可檢測基原是否混雜不同品系 另一為 ISSR 方法 : 可尋找不同樣品植材之專一性引子 標準檢測方法完成後即可針對市售藥材及半製品 53

8 進行檢體分析試驗, 並針對檢測靈敏性及正確性, 修正藥材及半製品 DNA 之抽取方法及 PCR 之反應條件, 落實中草藥之基原鑑定及品質管制 54

9 貳 材料與方法一 鑑定及檢測之中草藥正品及疑似替代藥材 蒲公英 (T. mongolicum Hand.-Mazz.) 台灣蒲公英 (T. formosanum Kitanlura) 西洋蒲公英 (T. officinale Weber) 兔仔菜 (I. chinensis (Thunb.) Nakai) 鵝仔草 (P. indica L.) 苦滇菜 (S. oleraceus L.) 黃鵪菜 (Youngia japonica L.) 刀傷草 (I. laevigata (Bl.)Sch.) 地膽草 (Elephantopus mollis Kunch) 二 重要實驗方法及步驟 ( 一 ) 文獻及基因庫資訊收集根據 中華中藥典 (1) 臺灣植物誌 (8) 及 台灣市售中藥 (2, 材真偽及代用品圖集 等資料 5-7), 針對蒲公英及可能之替代植材種類 : 兔仔菜 鵝仔草 苦滇菜 黃鵪菜 刀傷草 地膽草 紫背草及苦苣菜等植物, 收集及比對其學名 植物形態特性 於 NCBI GenBank 資料庫搜尋中草藥已登錄之基因序列, 可多重比對, 強化鑑定之正確性 ( 二 ) 準備鑑定及檢測之中草藥根據文獻資料, 於苗栗縣 ( 後龍 ) 新竹縣( 關西 ) 桃園縣 ( 大園 ) 中部中草藥栽培園 中國河南省洛陽縣 山西省( 太原縣 大同縣 ) 甘肅省( 文縣 岩昌縣 渭源縣 ) 及田野購買及採集台灣蒲公英 4 株 西洋蒲公英 8 株 中國蒲公英 6 株 兔仔菜 4 株 鵝仔菜 5 株 苦滇菜 3 株 黃鵪菜 4 株 刀傷草 5 株 地膽草 4 株 紫背草 3 株及苦苣菜 2 株 並於台北縣市 宜蘭縣 桃園縣市 新竹縣 台中縣市 台南市 高雄縣及屏東縣各地區中草藥店, 訪談及採購欲鑑定及檢測之中草藥藥材及半製品, 各 8-12 個檢測樣品 55

10 ( 三 ) 抽取中草藥植株之基因組 DNA 利用 DNaeasy mini kit (Qiagen) 抽取中草藥植株幼葉 利用吸光值於波長 280/260 nm 之比值, 評估 DNA 之純度, 並定量 DNA 之濃度 (11, 17, 19) ( 四 ) 利用 PCR 技術增幅 ITS1-5.8S rrna-its 序列 根據 GenBank 菊科植物於 18S rrna 與 26S rrna 基因的保留序列, 設計引子 ITS-F 及 ITS-R ( 表一 ), 抽取各植株 0.5 克幼葉之基因組 DNA,50ng DNA 1μl ITS-F 引子 1μl ITS-R 引子 2μltaq mix buffer, 經 PCR 反應 : 起始變性溫度為 94 5 分鐘 ; 變性溫度 秒, 煉合溫度 秒, 延展溫度 72 1 分鐘, 循環 30 週期 ; 最後延展溫度 72 7 分鐘 取 5μl PCR 產物, 加入樣品 0.1 倍體積之 bromophenol blue 染劑, 注入於含 1.2% (w/v)agarose gel 之 0.5 X TBE 膠體, 以 100 伏特電壓進行電泳分析, 時間約 25 分鐘, 取出膠體於紫外燈下觀察結果, 所得 DNA 片段與 DNA Marker 比較, 利用內差法估計長度, 可增幅約 bp 之核酸片段 ITS1-5.8S-ITS2 增幅之核酸片段溶洗出, 經由接合反應 (ligation): 取 3 μl 此 DNA, 添加於 pgem-t Easy Vector kit (5 μl 2 X Rapid Ligation buffer, 1μl 50 ng pgem-t Easy vector, 1μl T4 DNA ligase), 於 16 反應 小時 將單一菌落之大腸桿菌 JM109 strain, 加 3ml LB 培養液, 於 37 振盪培養 14 小時, 取 200μl 菌液加入接合反應之 10μl DNA, 放置於冰上 30 分鐘, 再加入 200μl LB 培養液, 於 37 振盪培養 1 小時, 將菌液塗抹於 LB plate( 含 IPTG X-gal 及 ampicillin), 培養 小時, 選取含有 DNA insert 之白色菌落, 移入 3ml LB 培養液中, 再於 37 培養 小時, 抽取 plasmid DNA, 取 20μl plasmid DNA 加 1μl EcoRI 限制酵素, 於 37 反應 2 小時, 取出 6μl 加入樣品 0.1 倍體積之 bromophenol blue 染劑, 注入於含 1.2% agarose 之 0.5 X TBE 膠體, 以 100 伏特電壓進行電泳分析 確證轉殖之小片段質體 DNA 約為 bp, 即針對此菌株之 plasmid DNA 進行解序 (9, 11, 16, 19) ( 五 ) 比對 ITS1-5.8S rrna-its 序列及鑑定蒲公英 利用 NCBI GenBank 的 Blast 功能比對與基因庫內序列之基 56

11 因, 即可做為蒲公英鑑定之参考依據 (14, 15, 18) ( 六 ) PCR-RFLP 圖譜之建立 將步驟 4 增幅之 5.8S rrna-its 核酸片段序列利用 DNA star 軟體分析序列中限制酶之切位及酶切後核酸片段長度, 決定使用之酵素, 將增幅的核酸淋洗出及純化, 再經 Mse I 限制脢之消化反應, 於 37 反應 1.5 小時, 進行電泳分析, 可建立蒲公英不同種或偽品間具差異之多型性核酸條帶圖譜 (12, 18) ( 七 ) ISSR 分子標誌之建立 利用 UBS ISSR 引子 (University of British Columbia) 編號 進行基因組 DNA 之 PCR 反應 :94 5 分鐘,94 45 秒,55 45 秒,72 45 秒,35 個循環,72 7 分鐘, 經由增幅核酸條帶的多型性差異, 篩選可區別蒲公英種間或偽品間差異的引子 (3, 4, 10, 20) ( 八 ) Multiplex PCR 檢測方法之建立 比對步驟 6 蒲公英種間或偽品間 DNA 序列之差異, 於該處設計各別之專一性引子 ( 表一 ), 建立 multiplex PCR 之反應條件 :94 5 分鐘,94 45 秒,55 45 秒,72 45 秒,35 個循環,72 7 分鐘 以 2.0% Agarose gel 進行電泳分析 ( 九 ) 市售蒲公英藥材及半製品樣品之鑑定及檢測 抽取蒲公英藥材及半製品之 DNA, 利用方法七 - 九建立之 Multiplex PCR 方法, 鑑定及檢測中草藥藥材及半製品樣品, 比較檢測結果之靈敏性及正確性, 進而修正藥材及半製品 DNA 之抽取方法及 PCR 之反應條件 ( 十 ) 晶片檢測方法之建立 將 multiplex PCR 設計之引子序列改為晶片探針, 以手動點片機將探針點於尼龍材質的晶片上, 經 UV cross linker 照射後, 將探針固定於晶片, 以 ITS-F 及 ITS-R 為引子, 進行樣品 DNA 之 PCR 反應, 再將增幅的 DNA 與探針雜合, 於 55 反應 1 小時, 經清洗及呈色即可分析結果 ( 十一 ) 資料整理及報告撰寫 1. 蒲公英正品植株及偽 替代植株之形態特性描述 彩色圖片 57

12 拍攝 2. ITS1-5.8S rrna-its 基因序列於 NCBI GenBank 登錄 比對及描述蒲公英植株及偽 替代植株 ITS1-5.8S rrna-its 基因序列之差異處及鑑定結果 3. PCR-RFLP ISSR 及 Multiplex PCR 分子標誌檢測之標準方法撰寫 優缺點比對及多型性核酸圖譜建立 4. 市售蒲公英藥材及半製品樣品之鑑定及檢測結果分析與討論 5. 期末報告及論文撰寫 58

13 參 結果 一 文獻及基因庫資訊收集 根據 中華中藥典 (10) 新修本草 臺灣植物誌 (8) 及 台 (2, 灣市售中藥材真偽及代用品圖集 等資料 5-7), 針對蒲公英屬之台灣蒲公英 (T. formosanum Kitanlura) 西洋蒲公英(T. officinale Weber) 及蒲公英 (T. mongolicum Hand.-Mazz.), 其可能之替代藥材包括 : 兔仔菜 (Ixeris chinensis (Thunb.) Nakai) 鵝仔草(Pterocypsela indica L.) 苦滇菜(Sonchus oleraceus L.) 黃鵪菜(Youngia japonica L.) 刀傷草(Ixeris laevigata (Bl.)Sch.) 地膽草(Elephantopus mollis Kunch) 紫背草(Emilia sonchifolia) 及苦苣菜 (Sonchus arvensis) 等, 台灣蒲公英及西洋蒲公英最主要之形態差異在於總苞部位, 西洋蒲公英最外層總苞向下反轉, 台灣蒲公英者無此現象 其他可能之替代藥材與蒲公英的形態於葉形 株形 花穗 花色或頭狀花朵單重瓣皆有不同程度之差異, 列於圖一及表二 於 NCBI GenBank 資料庫 ( 搜尋已登錄之 5.8S rrna-its 基因序列, 僅可得知蒲公英 (Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.):AY 西洋蒲公英(Taraxacum officinale Weber):AB 鵝仔草(Pterocypsela indica L.): AJ 及苦藚菜屬植物 (Ixeris spp.):aj 之序列訊息 可提供為共同驗證之依據 二 3 種蒲公英及 8 種可能偽品 5.8S rrna-its 序列之增幅及解序 蒲公英及 8 種偽品以 ITS-F 及 ITS-R 為引子, 經 PCR 反應增幅之 5.8S rrna-its 核酸片段約為 730bp ( 圖二 ), 經由核酸解序及與 NCBI GenBank 中的序列比對, 確證 730bp 的核酸片段皆為菊科植物之 5.8S rrna-its 序列, 非微生物序列, 顯示本研究選用之 PCR 引子適用於蒲公英基源的 5.8S rrna-its 基因之增幅 蒲公英及 8 種偽品之 5.8S rrna-its 核酸序列已分別登錄於 NCBI GenBank,accession number ( 圖三 ), 於 2007 年 12 月才公開 以 GenBank 中 Blast 功能比對序列, 其中蒲公英屬植物之相似度較高, 介於 96-99% 之間, 鹼基不同之處將應用於單元五之 multiplex PCR 引子之設計位置 ( 圖三 ), 台灣蒲公英與中國產之蒲公英相似度高於與西洋蒲公英者 台灣蒲公英與 8 種偽品之相似度介於 80-88% 之間 59

14 三 PCR-RFLP 多型性圖譜之建立 蒲公英及 8 種偽品以 ITS-F 及 ITS-R 為引子增幅之 5.8S rrna-its 核酸片段, 分別以 Mse I 限制酶反應, 可將約 730 bp 的核酸, 切割為 2-4 條長度介於 bp 之間的片段 ( 圖四 ), 其中西洋蒲公英與中國之蒲公英具相同條帶 四 ISSR 多型性圖譜之建立 蒲公英及 8 種可能偽品以 UBS (University British Columbia) 篩選 86 組引子, 大部份引子增幅結果無條帶或是不易明確區別的弱條帶 其中僅編號 857 引子經 PCR 可同時明顯區別 11 物種, 分別於 500-3,000bp 之間, 增幅 2-6 條多型性條帶, 台灣蒲公英可增幅約 1,400 bp 片段, 西洋蒲公英則缺少約 1,200bp 片段, 其他偽品皆各呈現不同長度之 2-3 條多型性條帶 ( 圖五 ), 可明顯區別 3 種蒲公英及 8 種偽品 五 multiplex PCR 檢測條件之建立 經由比對蒲公英與偽品 ITS1 及 ITS2 序列之異同, 分別設計專一性引子, 以 60 的 annealing 溫度, 可於 3 種蒲公英增幅 457bp 的片段, 兔仔菜 鵝仔菜 苦滇菜 黃鵪菜 刀傷草及地膽草分別可增幅 bp 的片段 ( 圖六 ) 再比對 3 種蒲公英的 ITS 差異處, 由 3 組引子進行之 multiplex PCR 可於台灣蒲公英 中國蒲公英及西洋蒲公英分別增幅 及 586bp 的片段 ( 圖七 ) 六 市售蒲公英真偽之檢測 於台北縣市 宜蘭縣 桃園縣市 新竹縣 台中縣市 台南市 高雄縣及屏東縣各地區之參藥行或中草藥店購買蒲公英藥材各 9-10 樣品, 共 79 個樣品 利用已建立之 multiplex PCR 條件, 於宜蘭縣及台北市檢出 3 及 2 樣品為蒲公英混雜少量兔仔菜, 屏東縣單一樣品為正品蒲公英, 其餘 73 個樣品皆為偽品兔仔菜 ( 圖八 ) 再將含蒲公英樣品以區別 3 種蒲公英的引子, 進行二次 multiplex PCR 反應, 顯示皆為西洋蒲公英 ( 圖九 ) 購買蒲公英過程中之訪談, 顯示大部份販賣業者認為兔仔菜即為蒲公英, 且俗稱為 小金英, 另有以鵝仔草為 大金英, 但未被檢出 所有市售藥材皆只增幅預定長度之核酸條帶, 未出現其他核酸條帶, 顯示使用之引子並未增幅與微生物相關之核酸, 屬專一性高之 PCR 引子 60

15 七 晶片檢測方法之建立 將蒲公英 西洋蒲公英 兔仔菜及鵝仔菜之專一性引子改為探針之序列, 加上 internal control 及 negative conrol 之設計, 可於晶片特定位置呈色, 如圖十所示 61

16 肆 討論 一 根據 新修本草 最初記載的蒲公英為多種同屬植物之全草, 因此台灣蒲公英 西洋蒲公英和中國產蒲公英皆為蒲公英屬植物, 是否皆具相同藥理而不需明確區別? 仍有待探討 二 經由 3 種蒲公英植物形態, 主要以總苞向下反轉與否, 判斷是否為台灣蒲公英或西洋蒲公英, 若為全草乾品萎凋後則不易明確區別, 而且台灣蒲公英與中國產蒲公英總苞皆不反轉, 因此乾品之外觀形態僅可做為初步鑑定之參考 三 乾品藥材進行核酸分析前, 首先必須克服抽取基因組 DNA 純度之控制, 經由以 Qiagen kit 萃取可維持 OD260/280= 之純度, 適用於 PCR 反應 四 由於 5.8S rrna 旁之 ITS1 及 ITS2 序列具重複性 多分歧性及共演化之特性 (Baldwin, 1993), 因此常被用於物種之分類及親源鑑定 3 種蒲公英與偽品間 ITS 序列之相似度介於 80-88% 之間 本研究亦利用 5.8S rrns-its 序列之增幅與解序, 設計於蒲公英 兔仔菜 鵝仔草等 ITS1 及 ITS2 具高度保留區間的核酸, 因增幅之核酸長度的差異, 才可於電泳膠體分析時區別不同片段 經由不同個體之測試, 具明確之專一性及再現性 五 由增幅之 5.8S rrna-its 序列建立之 PCR-RFLP 多型性圖譜, 以及 ISSR 多型性圖譜皆可應用於蒲公英藥材之鑑定, 而 PCR-RFLP 方法需經 clean up 及限制酶反應, 測定過程較 ISSR 反應繁瑣 六 由專一性引子建立之 multiplex PCR 檢測方法, 不僅可鑑定蒲公英物種, 亦可檢出是否混雜其他偽品 市售蒲公英藥材 95% 為偽品兔仔菜, 僅 5 件檢體中含有西洋蒲公英 七 晶片檢測方法為利用 5.8S rrna-its 序列進行一次 PCR 反應後, 再與專一性探針雜合, 可區別蒲公英藥材之真偽 由於晶片的材質及呈色反應可大幅降低檢測成本, 且探針之設計不受限於 PCR 之後, 電泳膠體分析時片段長短之考量 此外新偽品極易加入檢測 62

17 伍 結論與建議 一 蒲公英等中藥材真偽之鑑定與檢測方法之建立, 為中藥材基源品管機制的重要第一關卡 本研究由 5.8S rrna-its 序列 PCR-RFLP ISSR 法皆可明確鑑定蒲公英 ;multiplex PCR 及晶片檢驗法除了可鑑定真偽, 亦可檢出混雜之偽品 二 傳統中藥材之鑑定方法為組織切片鑑定法, 此方法適用於以根莖或種子部位為主之藥材檢驗 對於以葉片 全草 組織易破碎 粉末或液態之藥材或半成品則適用分子標誌或晶片檢測 三 經由蒲公英檢測方法之探討, 已建立抽取中藥材乾品之方法 專一性引子及探針之設計要領, 後續可加速完成其他中藥材真偽之晶片檢驗系統之建立 由於晶片檢驗可同步檢測 96 個樣品之擴充性, 具有快速 簡易及經濟等特點 且已有研發完成之影像分析軟體, 可於影像判讀後立即產生報表或報告書, 大幅降低檢驗時程, 適用於進出口藥材認證制度之配合 四 有關計畫經費運用方面之困難 : 由於分子及晶片檢驗方法之研發, 於試劑及基因解序等基本資料之建構, 皆需耗用相當費用, 亦無法於計畫中編列碩士級助理之培訓, 此外, 經費尾款之撥付時程較農委會者晚, 易造成報銷及結帳等作業之困擾, 擬建議提高計畫經費及研擬經費撥款方式, 以利參與研究單位之核銷 亦期望研發之成果可落實中藥材品質管制機制之運行 誌謝 本研究計畫承蒙行政院衛生署中醫藥委員會, 計畫編號 CCMP94-RD-009 提供經費贊助, 使本計畫得以順利完成, 特此誌謝 63

18 陸 參考文獻 1. 行政院衛生署中華藥典中藥集編修小組 : 中華中藥典 行政院衛生署編印, 行政院衛生署中醫藥委員會 : 台灣市售中藥材真偽及代用品圖集 中藥材品質管制系列叢書 ( 一 ),2002,111 頁 3. 林哲輝 許順吉 : 中草藥之品質管制 中草藥產業技術與研發 中草藥產業技術教學資源中心編印,2003, 頁 4. 郭昭麟 闕甫伈 陳忠川 : 中藥材之基原鑑定 中草藥產業技術與研發 中草藥產業技術教學資源中心編印,2003, 頁 5. 童承福 : 台灣市售易誤用 混用中藥品種之現況 ( 6. 張國成 : 中草藥之國際化 中草藥產業技術與研發 中草藥產業技術教學資源中心編印,2003, 頁 7. 張憲昌 : 市售藥材真偽鑑別與成分探討 ( 8. 廣東省藥材公司等 : 常用中藥材真偽鑑別, 廣東科技出版社,1988; 瀕危中藥資源的保護與可持續利用的相關問題及對策 2004 第二屆瀕危中藥資源保護利用戰略研討會論文集 臺灣植物誌第二版編輯委員會 臺灣植物誌 第二版 第 2-5 卷 11. Avise JC, Molecular markers, natural history and evolution. Chapman and Hall. New York, London,, Brown SM, Szewc-McFadden AK, Kresovich S.: Development and application of simple sequence repeat (SSR) loci for plant genome analysis. In: Jauhar, P.P. (Ed.). Methods of genome Analysis in plants. CRC Press, Inc., Florida, 1996; Cheng KT, Chang HC, Su CH, Hsu FL.: Identification of dried rhizomes of Coptis species ( 黃蓮 ) using random amplified polymorphic DNA. Botanical Bulletin Academic Sinica 1997a; 38: Cheng HF, Lai B, Chan SC, Chou CP, Yang TH, Huang WH, Liao CH, Lin CP.: Molecular differentiation of Atractylodes ( 蒼朮 ) drugs by PCR-restriction 64

19 fragment length polymorphism and PCR-selective restriction analysis on the 18s-5.8s rdna intratranscribed spacer 1 gene. J of Food and Drug Analysis 1997b; 5: Fu RZ, Wang J, Zhang YB, Wang ZT, But PP, Li N, Shaw PC.: Differentiation of medicinal Codonopsis ( 黨參 ) species from adulterants by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Planta Medica 1999; 65: Fushimi H, Komatsu K, Isobe M, Namba T.: 18s ribosomal RNA gene sequences of three Panax ( 西洋參 ) species and the corresponding ginseng drugs. Biological and Pharmaceutical Bulletin 1996; 19: Hosokawa K, Minami M, Kawahara K, Nakamura I, Shibata T.: Discrimination among three species of medicinal Scutellaria 黃芩 plants using RAPD markers. Planta Medica 2000; 66: Lau TWL, Shaw PC, Wang J, But PPH.: Authentication of medicinal Dendrobium ( 石斛蘭 ) species by the international transcribed spacer of ribosomal DNA. Planta Medica 2001; 67: Ma XQ, Duan JA, Zhu DY, Dong TT, Tsim KW.: Species identification of radix astragali (huangqi) ( 黃蓍 ) by DNA sequence of its 5S-rRNA spacer domain. Phytochemistry 2000; 54: Russell JR, Fuller JD, Macaulay M, Hatz BG, Jahoor A, Powell W, Waugh R.: Direct comparison of levels of genetics variation among barley accessions detected by RFLPs, AFLPs, SSRs and RAPDs. Theoretical and Applied Genetics 1997; 95: Schaal BA, Learn GH.: Ribosomal DNA variation within and among plant populations. Ann. Missouri. Bot. Gard. 1988; 75: Wu P, Zhou KY, Zhang ZH, Xu LS.: Molecular identification of traditional Chinese drug Hippocampus. Acta Pharmaceutica Sinica 1998; 33:

20 柒 圖表 1. 台灣蒲公英 2. 西洋蒲公英 3. 蒲公英 ( 中國 ) 66

21 4. 兔仔菜 5. 鵝仔草 ( 山萵苣 ) 6. 苦滇菜 7. 黃鵪菜 67

22 8. 刀傷草 9. 地膽草 10. 紫背草 68

23 11. 苦苣菜 圖一 蒲公英及其可能偽品之植株形態 1. 台灣蒲公英 2. 西洋蒲公英 3. 中國產蒲公英 4. 兔仔菜 5. 鵝仔草 6. 苦滇菜 7. 黃鵪菜 8. 刀傷草 9. 地膽草 10. 紫背草 11. 苦苣菜 (bp) 圖二 蒲公英及可能偽品 5.8S rrna-its 序列之 PCR 增幅圖譜 1. 台灣蒲公英 2. 西洋蒲公英 3. 中國產蒲公英 4. 兔仔菜 5. 鵝仔草 6. 苦滇菜 7. 黃鵪菜 8. 刀傷草 9. 地膽草 69

24 Tf TCGAACCCTGCAAGGCAGAACGACCCGTGAACACGTAAATACAACC---GGGTGATGGGG Tm1 TCGAACCCTGCAAGGCAGAACGACCCGTGAACACGTAAATACAACC---GGGTGATGGGG Tm2 TCGAACCCTGCAAGGCAGAACGACCCGTGAACACGTAAATACAACT---GGGTGATGGGG To1 TCGAACCCTGCAAGGCAGAACGACCTGTGAACACGTAAATACAACT---GGGTGATGGGG TO2 TCGAACCCTGCAAGGCAGAACGACCTGTGAACACGTAAATACAACT---GGGTGATGGGG T03 TCGAACCCTGCAAGGCAGAACGACCTGTGAACACGTAAATACAACT---GGGTGATGGGG IC TCGAAACCTGCAATGCAGAACGACCTGTGAACATGTAAATACAACT -T-GGTGTTAGGG PI TCGAACCCTGCAAGGCAGAACGACCTGTGAACATGTAACTACAACT---GGGTGACAGGG So TCGAACCCTGCAAAGCAGAACGACCCGTGAACATGTAAATACAAGT -T-GGTGCTGTTG Yj TCGAACC-TGCATGGCAGAATGACCCGTGAACATGTAAAAATA-CTACTGGGTGATGGGG Il TCGAAACCTGCAAGGCAGAACGACCCGTGAACATGTACTTACAACT--TGG-TGAAGGGG Em TCGAAACCTGCAAGGCAGAACGACCCGTGAACATGTACTTACAACT--TGG-TGAAGGGG Es TCGA----TGCGACTCAAAACGAACCGTGAACACGCACCGAAAA-TATCGAGTTA-GGTG Tf AGATGGATCTTGGTTTT--GATCCTCAGCACCTTCCAGCGTGCGTGCATGCTT-TCTCTT Tm1 AGATGGATCTTGGTTTT--GATCCTCAGCACCTTCCAGCGTGCCTGCATGCTT-TCTCTT Tm2 AGATGGATCTTGGTTCT--GATCCTCAACACCTTCTAGCGTGCCTGCATGCTT-TCTCTT To1 AGATGGATCTTGGTTCT--GATCCTCAACACCTCCTAGCGTGCCTGCATGCTT-TCTCTT TO2 AGATGGATCTTGGTTCT--GATCCTCAACACCTCCTAGCGTGCCTGCATGCTT-TCTCTT T03 ATATGGATCTTGGTTCT--GATCCTCAACACCTCCTAGCGTGCCTGCATGCTT-TCTCTT IC AGATGGGCCTTGGTCCT--GATCTTTAACATCTCCTGGCGTGCTTGCATGGTGCTCTTTG PI AAATGGGCTTTGGTCCT--GATCCCCTAACCCTTTATG-ATGTGAATTTGTGGTGCCTTC So TGATGGGCTTTATGTTT-AGATCAGCAACGCCATCCGGTGTGTTTTCAAGGTA-TCTCTT Yj AGACGGTCCTTGGTCTT--GATCCTCAATGCCTCCCGACTTGTGTGCATGGTG-TCTTGT Il AGATGGGCCTTAGAGCCCAGATCTTCGACATCTCCTGACGTGGTTTTGCATGG-TGCTCA Em AGATGGGCCTTAGAGCCCAGATCTTCGACATCTCCTGACGTGGTTTTGCATGG-TGCTCA Es AAACGGTCAT GTG-CT CTTCCAATCTATGCCCCGCCAACGGAATTATACGATGTCC- Tf TT----GGGCTATCATGCTTGTATTGTTGGAC-TTTAAC-CAAACCCCGGCACGGTATGTGCC Tm1 TT----GGGCTATCATGCTTGTATTGTTGGAC-TTTAAC-CAAACCCCGGCACGGTATGTGCC Tm2 TT----GGGCTATCATGCATGTATTGTTGGAA-TTTAAC-AAAACCCCGGCACGGCATGTGCC T01 TT----GGGCTATCATGCATGTATTGTTGGAA-TTTAAC-AAAACCCCGGCACGGCATGTGCC TO2 TT----GGGCTATCATGCATGTATTGTTGGAA-TTTAAC-AAAACCCCGGCACGGCATGTGCC To3 TT----GGGCTATCATGCATGTATTGTTGGAA-TTTAAC-AAAACCCCGGCACGGCATGTGCC IC GGCAACTTGTGA-GTCTCGTCAGAT-CTTAAC-A-AACCCCGGCACGGAATGTGCC PI TTTTGGGGGC----ATCATGG-ATCCCGTCAT-ACCATCACAAACCCCGGCACGGAATGTGCC So TT----GTGGTACCATGGATGT -CCCATCGG-ACTATAACAAACCCCGGCACGGCATGTGCC 70

25 Yj Il Em Es ACA---GGCC-ACCATGTATGTCTCGTTGGACCAATA--ACAAACCCCGGCACGGAATGTGCC T---GTTGTGTAACATGCATTTCTTGTCAGAC--TTAACA-AA-CCCCGGCACGGAATGTGCC T---GTTGTGTAACATGTATTTCTTGTCAGAC--TTAACA-AA-CCCCGGCACGGAATGTGCC TT--GACGGGGC-CTTGTAGAAGTCTCGCTGGCGACATAACAAACCCCGGCACAAAACGTGCC Tf AAGGAAAACAATAAAC-GAGAAGGACTCGACCTGTTA-TGCCCCGTTT-GTGGTGTGCAT Tm1 AAGGAAAACAATAAAC-GAGAAGGACTCGACCTGTTA-TGCCCCGTTT-GTGGTGTGCAT Tm2 AAGGAAAACAATAAAC-GAGAAGGACTCGACCTGTTA-TGCCCCGTTT-GTGGTGTGCAT T01 AAGGAAAACAATAAAC-GAGAAGGACTTGACCTGTTA-TGCCCCGTTT-GTGGTGTGCAT TO2 AAGGAAAACAATAAAC-GAGAAGGACTCGACCTGTTA-TGCCCCGTTT-GTGGTGTGCAT T03 AAGGAAAACAATAAAC-AAGAAGGACTCGACCTGTTA-TGCCCCGTTT-GTGGTGTGCAT Ic AAGGAAAACAAAAAAT-GAGAAGGACTTGACCTGTT--TCCCCGTTCGCGGTGTGTATAT PI AAGGAAAACAA-AAAT-GAGAAGGACACGTCACGTA--TTGCCCCGTTTGCGGTGTGCGT So AAGGAAAATTAAATAAA-AGATGCTATTTACTTGATT-TGCCCCGTTTTACGGTGTGCAT Yj AAGGAAATGAAAAAATAGAGAAGGACTTGTCCTGTTAATGCCCCGTAT-GCGGTGTGCTT Il AAGGAAAACAAAAATT-GAGAAGGACTTGTCCGTTT--TGCCCCGTTC-GCGGTGTGTAT Em AAGGAAAACAAAAATT-GAGAAGGACTTGTCCGTTT--TGCCCCGTTC-GCGGTGTGTAT Es AAGGAATGAAAAACTC-AAGAAGAGTGTGGC-GT-----GGCACATTTCGGCATTCGAAT Tf -TCTGAGCGTGTCCT-CCTTT-TAAT-CACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTC Tm1 -TCTGAGCGTGTCCT-CCTTT-GAAT-CACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTC Tm2 -TCTGAGCGTGTCCT-CCTTT-GAAT-CACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTC To1 -TCTGAGCGTGTCCT-CCTTT-GAAT-CACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTC TO2 -TCTGAGCGTGTCCT-CCTTT-GAAT-CACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTC To3 -TCTGAGCGTGTCCT-CCTTT-GAAT-CACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTC IC -AGGTTT -TGGCCT-CCTTG-GAAT-CACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTC PI -ACGGGCTGTGGCCT-CCTTG-GAAT-CACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTC So -ACAGGTGGTAGCCT-TCTTT-AAAA-CACTAATGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTC Yj -ACAGGTCGTGGCCT-CCTTG-GAAT-CATAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTC Il -AATGGTCGTGTCCT-CCTTG-GAAT-CACAAACGACTCTCGGCAACGGAAATCTCGGCTC Em -AATGGTCGTGTCCT-CCTTG-GAAT-CACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTC Es TGTGCCTGGTCTATTGCCTTTCGAAATCACAAACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTC Tf ACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCG Tm1 ACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCG Tm2 ACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCG To1 ACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCG 71

26 TO2 ACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCG To3 ACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCG IC ACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCG PI ACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCG So ACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCG Yj ACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCG Il ACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCG Em ACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCG Es ACGCATCGATGAAGAATGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCG Tf TGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATCCGGTTGAGGGCACG Tm1 TGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATCCGGTTGAGGGCACG Tm2 TGAGCCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATCCGGTTCAGGGCACG T01 TGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATCCGGTTCAGGGCACG TO2 TGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATCCGGTTTAGGGCACG To3 TGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATCCGGTTCAGGGCACG IC TGA----TCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCAAAACCATCCGGTTGAGGGCACG PI TGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATCCGGCTGAGGGCACG So TGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATCCGGCCGAGGGCACG Yj TGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCAATGCCATTTGGTTGAGGGCACG Il TGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAACCATCCGGTTGAGGGCACG Em TGAACCACCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAACCATCCGGTTGAGGGCACG Es TGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGAGCCCGAAGCCATTCGGTCAAGGGCACG Tf CCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCCATC-ATAGTTCCC-TTAA-GGGTAGTC Tm1 CCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCCATC-ATAGTTCCC-TTAA-GGGTAGTT Tm2 CCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCCATC-ATACTTCCC-TTAA-GGGTAGTC To1 CCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCCATC-ATAATTCCC-TTAA-GGGTAGTC To2 CCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCCATC-ATACTTCCC-TTAA-GGGTAGTC To3 CCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCCATC-ATAATTCCC-TTAA-GGGTAGTC IC CCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGTCCCCCAAC-ATACTCTCCCTTATTGGGTTGTC PI CCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCTCCTCAAC-ATACCTCCCC -AACGGGTTGTG So CCTGCCTGGGCGTCACGCATCTCGTCGCCCCCTGCC-ACACATCC -TAAA-GGTGTATT Yj CCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCCTTCCATACTTCC TTAACCGGTACAT Il CCTGTCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCC-ACC-ATGGT-CTCCTAGTAGGTTA-TC Em CCTGCCTGGGTGTCACGCATCGCGTCGCCCCC-ACC-ATGGT-CTCCTAGTAGGTTA-TC Es TCTGCCGGGGCGTCACGCATCACGTCGTCCCC-ACC-ACGTCATGTATCGTCGGC-A-T- 72

27 Tf GTGGTGATTGGGAGCGGAAATTGGCCTCCCGTGCT-TGTTGTGCGGTTGGTCAAAATA Tm1 GTGGTGATTGGGAGCGGAAATTGGCCTCCCGTGCT-TGTTGTGCGGTTGGTCAAAATA Tm2 GTGGTGATTGGGAGCGGAGATTGGCTTCCCGTGCT-TGTTGTGCGGTTGGTCAAAATA To1 GTGGTGATTGGGAGCGGAGATTGGCTTCCCGTGCT-TGTTGTGCGGTTGGTCAAAATA TO2 GTGGTGATTGGGAGCGGAGATTGGCTTCCCGTGCT-TGTTGTGCGGTTGGTCAAAATA To3 GTGGTGATTGGGAGCGGAGATTGGCTTCCCGTGCT-TGTTGTGCGGTTGGTCAAAATA IC ATGTTGATTGGGGACGGAGATTGGCCTCCCGTACT-TCTGGTTCGGTTGGCCTAAATC PI ATGTTGTTGGGG-GCGGAAAATGGCCTCCCGTGCTAT-TGTTTCGGTTGGCCTAAAAA So AATGGTCATGGGGGCGGAAATTGGCCTCCCGTTCT-TGTGTTT-GGTTGGCCTAAAGA Yj CTGGTGCT-GGGGGCGGAGATTGGCCTCCCATGCC-TGTGGTGTGGCTGGCCTAAAGA Il ATGTTGTTTGGG-GCGGAGATTGGCCTCCCATGCT-TGTGGTGCGGTTGGCCTAAATA Em ATGTTGTTTGGG-GCGGAGATTGGCCTCCCATGCT-TGTGGTGCGGTTGGCCTAAATA Es GTCGTC--GGGG-GCGGAGATTAGTCTTCCATGCCATCGCGTGTGGTTGGCCCAAATT Tf CGAGTCCCC-TTCGG-TGGACACACGGCTAGTGGTGGTTGTAAAGACCCTTT-TCTTCTG Tm1 CGAGTCCCC-TTCGG-TGGACACACGGCTAGTGGTGGTTGTAAAGACCCTTT-TCTTCTG Tm2 GGAGTCCCC-TTCGG-TGGACACACGGCTAGTGGTGGTTGTAAAGACCCTTT-TCTTCTG To1 GGAGTCCCC-TTCGG-TGGACACACGGCTAGTGGTGGTTGTAAAGACCCTTT-TCTTCTG To2 GGAGTCCCC-TTCGG-TGGACACACGGCTAGTGGTGGTTGTAAAGACCCTTT-TCTTCTG To3 GGAGTCCCC-TTCGG-TGGACACACGGCTAGTGGTGGTTGTAAAGACCCTTT-TCTTCTG IC GGAGGCCCC-TTCGG-TGGATACACGGCTAGTGGTGGTTGTTAAGACCCTCG-TATTGTG PI GGAGTTCCC-TTCGG-CGGACGCACGACTAGTGGTGGTTGAACAGACCCTCG-TCATGTG So TGAGTCCCC-TTAGGGCGGATGCACAACTAGTGGTGGTTGAATAGACCCTCG-TCTTGTG Yj GTTGCCCCA-TTTGG-TGGACACACGGTTAGTGGTGGTTGTATAGACCCTCG-TCTTGTC Il GGAGTCCCC-TACGG-TGGATACACGGCTAGTGGTGGTTGTTAAGACCCTCG-TCTTGTG Em GGAGTCCCC-TACGG-TGGATACACGGCTAGTGGTGGTTGTTAAGACCCTCG-TCTTGTG Es GATGGCCGCGTTGAT-TGG-CACACGACTATTGGTGGTTGAAAAAACCTTCGGTCTAGAG Tf CTGTGTGTCGTGAGCTGCTAGGGAAGCC-C-TCAAAAAAGACCCCATTGTATCG-TCT-TA Tm1 CTGTGTGTCGTGAGCTGCTAGGGAAGCC-C-TCAAAAAAGACCCCATTGTATCG-TCT-TA Tm2 CTGTGTGTTGTGAGCTGCTAGGGAAACC-C-TCAAAAAAGAACCCAATGTATCG-TTC-TA To1 CTGTGTGTTGTGAGCTGCTAGGGAAACC-C-TCAAAAAAGAACCCAATGTATCG-TTC-TA To2 CTGTGTGTTGTGAGCTGCTAGGGAAACC-C-TCAAAAAAGAACCCAATGTATCG-TTC-TA To3 CTGTGTGTTGTGAGCTGCTAGGGAAACC-C-TCAAAAAAGAACCCAATGTATCG-TTC-TA IC CTGTGTGTTGTGAGCTGTTAGGGAAACC-C-TCACCAAAGACCCTATTGTATCG-TCT-TG PI TTGTGTGTCGTGAGCTGTGAGGGAAGCC-C-TCATCAAAGACCCCATTGCATTG-TTT-CC 73

28 So Yj Il Em Es TTGTGTGTCGTGAGCTGTGAGGGAAATT-C-TCAATTTAGACCCCACTGTATCG-TTA-AA CCGTGTGTCGTTAGCCTCTAGGGACATA-T-TGAAAA--GACCCTACTGTATTG-TCTCTA CCGTGTGATGTGAGCTGCCAGGGAAACC-C-TCACCAAAGACCCCATTGCATTA-TCT-TA CCGTGTGATGTGAGCTGCCAGGGAAACC-C-TCACCAAAGACCCCATTGCATTA-TCT-TA TCGTGT--TGCGAGTCACC-GGTAAAAAGCCTCGTTTA-GACCCC-T-G-ACGCATCA-TG Tf GGATGATGCTTCGACC Tm1 GGATGATGCTTCGACC Tm2 GGACGATGCTTCGACC To1 GGACGATGCTTCGACC To2 GGACGATGCTTCGACC To3 GGACGATGCTTCGACC IC PI So Yj Il Em Es GTACGATGCTTCGACT GGACGGTGCTTCGACC AAACGATATATCGACC G-ATGATACTTCGACT GGACGATGCTTCGACC GGACGATGCTTCGACC ATTCGATGCCTCGGAC 圖三 蒲公英及可能偽品 5.8S rrna-its 核酸序列之比較 Tf: 台灣蒲公英 (AY862577),Tm: 中國產蒲公英 (AY862585),To : 西洋蒲公英 (AY862576),Ic: 兔仔菜 (AY862578),PI: 鵝仔草 (AY862579), So: 苦滇菜 (AY862581),Yj: 黃鵪菜 (AY862580),Il: 刀傷草 (AY862582),Em: 地膽草 (AY862584),Es: 紫背草 (AY863066) 74

29 (bp) 圖四蒲公英及可能偽品 5.8S rrna-its 序列之 PCR-RFLP 多型性條帶 1. 台灣蒲公英 2. 西洋蒲公英 3. 中國產蒲公英 4. 兔仔菜 5. 鵝仔草 6. 苦滇菜 7. 黃鵪菜 8. 刀傷草 9. 地膽草 (bp) 圖五蒲公英及可能偽品之 ISSR 多型性條帶 1. 台灣蒲公英 2. 西洋蒲公英 3. 中國產蒲公英 4. 兔仔菜 5. 鵝仔草 6. 苦滇菜 7. 黃鵪菜 8. 刀傷草 9. 地膽草 (bp) 圖六 蒲公英及可能偽品 multiplex PCR 之專一性條帶 1. 台灣蒲公英 2. 西洋蒲公英 3. 中國產蒲公英 4. 兔仔菜 5. 鵝仔草 6. 苦滇菜 7. 黃鵪菜 8. 刀傷草 75

30 (bp) 圖七 蒲公英屬藥材 multiplex PCR 之專一性條帶 1. 台灣蒲公英 2. 中國產蒲公英 3. 西洋蒲公英 4. 蒲公英屬藥材 圖八 市售蒲公英藥材之 multiplex PCR 檢驗結果 宜蘭縣 台北縣市 新竹縣 台中縣市 嘉義縣 高雄縣及屏東縣各 10 樣品, 台南縣為 9 個樣品 箭號所示者為蒲公英專一性引子增幅之條帶, 其餘皆為兔仔菜專一性條帶增幅之條帶 76

31 (bp) 圖九市售蒲公英藥材之蒲公英屬專一性引子之 multiplex PCR 檢驗結果 1. 宜蘭縣樣品 2, 2. 台北市樣品 3, 3. 台北市樣品 4, 屏東縣樣品 7 蒲公英 西洋蒲公英鵝仔菜兔仔菜 圖十 晶片檢驗系統之建立 左下方為 internal control, 右下方為 negative control, 左上方為蒲公英屬藥材之專一性探針, 中上方為西洋蒲公英之專一性探針, 右上方為兔仔菜專一性探針, 中下方為鵝仔草專一性探針 77

32 表一測試中使用之引子 No. primer DNA sequence (5 3 ) Amplified DNA (bp) (1) ITS-F AGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTG 730 ITS-R CTTCTCCTCCGCTTATTGATATGCT (2) Tara-ITS-F GCT TTCTCT TTTGGGCTATCATGC 457 Tara-ITS-R AGGGTCTTTACAACCACCACTAGC (3) TF-ITS-F CTCAGCACCTTCCAGCGTGCG 194 TF-ITS-R TGCCGAGAGTCGTTTGTGATTA (4) TM-ITS-F CTCAGCACCTTCCAGCGTGCC 403 TM-ITS-R TTCCGCTCCCAATCACCACA (5) TO-ITS-F GGATCTTGGTTCTGATCCTCAA 586 TO-ITS-R GTCCTAGAACGATACATTGGGT (6) IC-ITS-F GATGGGCCTTGGTCCTGATCT 370 IC-ITS-R GGAGAGTATGTTGGGGGACG (7) PI-ITS-F TGGGCTTTGGTCCTGATCCC 404 PI-ITS-R TTTTCCGCCCCCAACAACATC (8) SO-ITS-F GCATAC AG TGG TAGCCTTC 252 SO-ITS-R ATTTCCGCCCCCATGACCATT (9) YJ-ITS-F TGATCCTCAATGCCTCCCGA 509 YJ-ITS-R CTAGAGGCTAACGACACACG (10) IL-ITS-F AATGGTCGTGTCCTCCTTGG 222 IL-ITS-R ACCTACTAGGAGACCATGGTG 78

33 表二蒲公英及可能偽品之形態比較 (10) 藥材名形態特徵台灣蒲公英草本, 根莖粗大, 深根性, 具有乳汁 單葉, 均為根生葉, 葉片長 12~20 公分, 寬 1~4 公分, 長橢圓形, 葉基下延形, 葉尖鈍形, 羽狀深裂, 裂片三角形, 鋸齒緣 頭狀花序徑 3~4 公分 ; 總苞杯狀,3 輪, 外層總苞片狹線形或線狀披針形, 突出, 而內外層總苞片的中肋上均有膨大之翅狀突起 ; 小花皆為舌狀花,5 齒裂, 黃色 果實為瘦果, 先端喙狀突起為瘦果之 2 倍長, 具 3 縱溝及 5 稜, 具小疣突起 ; 冠毛長 公分, 白色 西洋蒲公英葉片通常分數養生於中脈基部, 無毛, 倒披針形, 公分, 有時為羽狀半裂的倒齒狀或淺裂的倒齒狀, 葉柄基部狹窄 具短小不明顯翅狀, 葉片呈現不同程度的深裂 且具有一頂尖小裂片 ; 花莖 5-50 公分長 無毛或被絨毛, 尤其於上方部位 花被約 公分長 ; 內生苞片約 片, 外層者呈反轉現象 瘦果呈明顯球形, 外層花苞反轉生長, 寬無較內層花苞窄, 瘦果 公分長, 淡褐色 兔仔菜莖直立, 高 公分, 多分枝, 根粗大, 全株具白色乳汁 根生葉發達, 長 9-15 公分, 寬 1-2 公分, 披針形, 疏細鋸齒緣或全緣 ; 莖生葉較小 頭狀花序徑約 1.5 公分, 黃色, 呈圓錐狀排列 ; 總苞長 公分, 狹鐘形 ; 外層總苞片卵形, 長 公分, 內層總苞片 8 枚, 長橢圓狀線形, 先端鈍 ; 小花皆為舌狀花, 花冠長 公分, 先端 5 裂 果實為瘦果, 長 公分, 先端具喙狀物, 略與冠毛等長 ; 冠毛白色, 長 公分 鵝仔草草本, 高 1-2 公尺, 莖直立而多分枝, 中心具粗而白色之髓 根生葉長 公分, 幾無柄, 葉尖漸尖形, 葉緣為全緣或羽狀裂, 裂片 2-4 對 ; 莖生葉線狀披針形, 下表面灰白色 頭狀花序徑約 2 公分, 呈圓錐狀排列, 花序軸長 公分, 總苞圓筒形, 長 公分, 寬 公分 ; 總苞片無毛, 紫色, 外層總苞片長 公分, 卵形, 內層總苞片卵形至披針形, 最內層苞片 8 片, 披針形 ; 小花皆為舌狀花,21-27 朵, 花冠長約 1 公分, 寬約 0.2 公分, 淡黃色 果實為瘦果, 長約 0.4 公分, 寬約 0.2 公分, 長橢圓形, 扁平, 具 3 稜翼, 先端具喙狀突起 ; 冠毛長約 0.8 公分, 白色 苦滇菜草本, 高 公分, 莖粗大, 多分枝, 中空, 幾無毛 葉片長橢圓形, 羽狀淺裂至深裂 ; 裂片 2-4 對, 橢圓形或三角形, 裂片邊緣不規則鋸齒狀, 上下表面皆無毛 ; 頭狀花序徑約 2 公分, 呈繖房狀排列, 花序軸長, 被腺毛 ; 小花皆為舌狀花, 花冠長約 1 公分, 黃色 果實為瘦果, 窄橢圓形, 具稜 ; 冠毛白色 79

34 黃鵪菜刀傷草地膽草紫背草苦苣菜 一年生草本, 高 公分, 莖直立, 基部常分枝 根生葉叢生 ; 葉片長 8-25 公分, 寬 公分, 倒披針形, 葉尖銳形, 葉基狹窄, 呈羽狀裂, 葉緣微凸齒狀, 上下表面具捲曲狀細毛, 頂端裂片大型, 三角形至卵圓形, 側生裂片小型 頭狀花序呈圓錐狀排列, 頂生 ; 花序軸長 公分, 細長 ; 總苞長 公分, 寬 公分, 萼片狀, 外層總苞片少而小型, 卵圓形, 內層總苞片 8 片, 披針形, 先端鈍 ; 舌狀花 朵黃色 果實為瘦果, 長橢圓形, 長約 0.18 公分, 棕色 ; 冠毛白色, 長約 0.3 公分, 宿存 草本, 高 公分, 莖單生或叢生, 具白色乳汁 根生葉長 7 30 公分, 寬 公分, 披針形至線狀披針形, 葉基漸尖, 葉緣淺齒裂羽狀淺裂, 下表面灰白色 ; 莖生葉 1 3 枚, 較小, 具短柄 頭狀花序徑 公分, 呈繖房狀排列, 花序軸長 公分 ; 總苞圓筒形, 長 公分, 墨綠色, 疏被毛 ; 外層總苞片長 公分, 呈副花萼狀, 卵狀披針形, 內層總苞片 8 片, 線狀披針形 ; 小花皆為舌狀花, 花冠長約 0.7 公分, 寬約 0.2 公分 果實為瘦果, 長約 0.4 公分, 狹披針形, 具 10 稜 ; 冠毛長約 0.3 公分, 黃白色 草本, 莖直立, 高 公分, 上端花序分枝, 二叉分歧狀, 全株密被白色剛毛 單葉, 互生 ; 葉片長 公分, 長橢圓形, 葉尖銳, 葉基狹窄, 葉緣粗鋸齒, 下表面被絨毛 頭狀花序徑 公分, 白色, 呈總狀排列, 有葉狀苞片襯托 ; 總苞片長約 0.7 公分, 有大形苞片 3 片襯托, 苞片 公分, 闊卵形, 綠色, 先端銳, 銳鋸齒緣 ; 筒狀花花冠長 公分,4 深裂 果實為瘦果, 長約 0.3 公分, 被短毛 ; 冠毛由 4 5 枚剛毛所成 一年生草本, 全株綠白色, 但莖葉背光處常略呈紫紅色, 莖略直立, 稍分枝 單葉, 互生 ; 下部葉具柄, 上部葉無柄 ; 下部葉片長 5-10 公分, 寬 公分, 卵形至披針形, 葉尖銳形, 葉基箭形, 葉緣淺齒狀 ; 上部葉線形, 較小 頭狀花序具長軸, 呈疏繖房狀排列 ; 總苞略與花同長, 筒狀, 基部無苞片襯托 ; 小花皆為兩性, 花冠長約 1.2 公分, 先端 5 裂, 筒狀, 基腳細管狀, 淡紫色 ; 柱頭頂端有短鈍管狀絨毛 果實為瘦果, 長約 0.25 公分,5 稜形 ; 冠毛白色, 長約 0.8 公分 一年生或越冬草本, 莖直立, 高度 2 公尺, 頂端傘形分枝, 無毛 根生葉, 長圓形至倒披形, 葉基窄葉全緣或具細齒, 葉兩面無毛, 下位莖生葉窄長圓形, 耳狀抱莖 上位葉稀疏生長, 披針形, 耳狀抱莖 花序為傘形, 總花序 2-5 公分長, 具腺體硬糙毛 總苞黑色, 廣筒狀, 苞片 3-4 層, 外層披針形, 小花數朵, 花冠 公分 瘦果窄長圓形, 扁形,5 肋, 冠毛白色 80