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2 中文摘要 關鍵詞 : 齲齒 琺瑯質 氟化物 氫氧基磷灰石 去礦化 再礦化 氟中毒 口腔中的食物殘渣積存於牙齒表面, 會造成鏈球菌 (mutans streptococci) 及乳酸桿菌 (lactobacilli) 的寄生, 形成牙菌斑 (plaque) 當細菌分解口腔中的醣分形成酸性物質, 便會侵蝕牙齒, 造成礦物質流失, 而逐漸形成齲齒, 此過程稱為去礦化 而為了達到預防或早期治療之目的, 市面上各種氟化物陸續推出, 然而, 為了兼顧實際效用與安全性, 將研發預防齲齒之釋氟貼片 ; 而為了充分掌握患者牙齒結構中礦物質的分佈情況, 因此必須借助各種檢測儀器或量測技術, 其中 TMR(Transverse microradiography) 在定量分析上有最好之效果 雖然目前研究工作因為增黏劑性質造成某些困難, 致使進度些許落後, 但目前正積極尋求解決之方法, 所遭遇之瓶頸近日內可望獲得改善, 並將持續進行接下來之工作, 以完成研究之目標 Abstract Keywords:dental caries, enamel, fluoride, hydroxyapatite, demineralization, remineralization, fluorosis The food residue in the oral cavity piled up on the tooth surface causes that the streptococcus (mutans streptococci ) and lactic acid bacillus (lactobacilli ) are parasitic in it and form the tooth fungus spot (plaque ). As the bacterium metabolizes the carbohydrate in the oral cavity to form the acid material, will corrode the tooth, cause loss of the mineral in the tooth, and form the decayed tooth gradually; this process is called demineralization. In order to prevent from dental caries or treat it in early lesion stage, various kinds of fluoride are sold on the market. However, we will research and develop the fluoride-containing strip that can release fluoride due to take account of both performance and security. In order to know the distribution of the mineral substance in the tooth structure, various detecting instruments are needed; TMR (Transverse microradiography) among them is the best one in quantitative analysis. Although it causes some difficulties because of the property of carbopol, the bottlenecks met can be expected to be improved in the next few days, and the study will carry on to achieve the goal of the work. 1

3 一 前言 口腔健康的維護攸關國人身體健康之良窳, 當個人因咀嚼功能不健全, 便會導致養分攝取不足, 進而影響全身之健康 在影響口腔健康的眾多原因之中, 齲齒佔有極重要的地位, 舉凡牙體復形 根管治療 假牙膺復 以及拔牙等等, 大部分的情況皆起源於齲齒的發生, 因此, 大部分用於維護口腔健康的醫療資源可說是用來治療齲齒引發的後續問題 由於目前台灣尚沒有一種良好的齲齒預防方法, 因此本計畫的主要目標為研發預防齲齒之釋氟貼片 二 研究目的 台灣每年花費龐大的醫療資源在齲齒的治療及其後續衍生的問題 ; 若能從齲齒預防著手, 將有助於節省醫療成本, 並提昇國人之整體健康, 由於台灣飲水沒有加氟, 目前可以預防的方法包括含氟漱口水 氟膠 氟錠 小窩裂溝封填劑 玻璃離子體修復等, 雖然不管是從復形材料緩慢釋出或是特別設計之緩慢釋氟裝置, 皆有助於促進再礦化和降低齲齒發生, 但是使用材料修復之前, 必須先在牙齒上製備窩洞, 這會耗損齒質, 且隨著材料置換的次數增加, 窩洞也會愈磨愈大 至於氟膠, 有研究指出使用數百 ppm 濃度的氟膠, 十分鐘後濃度降為 1 ppm,30 分鐘後則降為 0.1 ppm, 意味著它很快就會被唾液所稀釋, 且它和氟錠一樣容易被食入身體內, 必須小心使用以免造成氟中毒 含氟漱口水則在小孩的使用配合度不高 因此, 本計畫將綜合評估各種氟化物之優缺點, 以研發兼具安全性 便利性及預防齲齒功能之釋氟貼片 三 文獻探討 以下將針對齲齒的形成原因及目前用於齲齒預防的方法做文獻回顧 : 2. 牙齒之構造人類牙齒的礦物質成分主要為氫氧基磷灰石, 而牙齒由外形來分, 可區分為牙冠和牙根兩大部分, 而牙冠是指暴露於口腔中肉眼可見的部分 牙冠的表面是一層琺瑯質 ( 牙釉質 ), 以氫氧基磷灰石 (hydroxyapatite, Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ) 為其主要成分, 成為人體中最堅硬的組織, 除了咀嚼食物之外, 更具有保護內層象牙質 ( 牙本質 ) 的重要功能 ; 然而, 琺瑯質一旦形成之後, 便永遠不會再生, 因此當牙齒表面產生蛀洞後, 不像人體其他組織及部位, 具有自行修復的能力, 而會隨著時間逐漸擴大其缺損的面積 ; 然而, 琺瑯質內部並不具有神經與血管, 以至於琺瑯質產生病變時並不會呈現任何徵兆, 故惟有定期作口腔檢查, 才能及早發現及早治療 牙本質位於牙冠部的牙釉質及牙根部的牙骨質之內層, 是由鈣化骨樣組織所構成 由於它對生理和病理的刺激有反應, 因此被認為是一種活的組織, 而和牙釉質不同的是, 牙本質終身都會繼續不斷的生長, 所以當牙齒產生缺損時, 便會形成新的牙本質來防止牙髓的暴露 牙本質中含有無數的小管, 而管內的齒質細胞突, 對於外來的刺激會產生疼痛的反應, 因此當牙齒之損傷擴及此層時, 患者往往會有酸痛的感覺 牙齒中央的空腔稱為牙髓, 當中充滿了神經 血管和淋巴管, 並具有形成新的牙本質 2

4 和維持牙齒生命的功能 由於牙髓內的痛覺神經末梢, 會接受冷 熱和細菌的刺激, 因此也擔負了牙齒感覺的重要職責 這些神經 血管 淋巴管會經由牙根部尖端的小孔 ( 根尖孔 ) 與顎骨內的神經 血管及淋巴管相連接 牙骨質是位於牙根部牙本質的外側組織, 具有與骨頭相同的構造, 通常會終身不斷生長 牙骨質具有眾多堅韌的纖維延伸到顎骨內, 藉此可讓牙齒緊密地固定於齒槽骨上 2. 齲齒的形成原因齲齒的形成機制已被研究得相當深入, 其形成機制之要點描述如下 : 牙齒表面的牙菌斑 (plaque) 含有一層會製造酸的 bacterial film, 這些酸可以溶解牙釉質或牙本質中的磷酸鈣, 這個過程稱之為去礦化 (demineralization), 當此過程持續進行或者再礦化 (remineralization) 沒有發生, 最後即會形成窩洞 牙釉質齲齒通常先以 white-spot lesion 存在, 它是指牙菌斑底下所形成的表面下去礦化 (subsurface demineralization), 通常其礦物質含量會喪失到 50%, 不過表面常是完整的 (apparently intact surface layer) 臨床觀察顯示即使在 cavitation stage, 如果可以維持一個沒有牙菌斑的環境, 任何階段的齲齒皆可被抑制, 最主要導致齲齒的兩種菌種為 mutans streptococci 和 lactobacilli, 而 in situ model 顯示乳牙齲齒的形成與進展又較恆牙快 3. 氟化物 (fluoride) 之作用機制氟化物抑制齲齒的作用在 20 世紀初由 McKay 所發現, 這個重要的發現吸引世界眾多的學者陸續投入相關的研究, 目前大部分的學者皆認為局部施予氟化物可以增進牙齒硬組織之再礦化及抑制去礦化, 且微量的氟化物對於牙釉質再礦化即能產生作用, 或是僅使用一次高濃度氟化物溶液 (10,000 ppm) 也能增進再礦化 氟化物也可影響與牙菌斑有關的細菌及抑制其製造酸的能力, 整體而言, 氟化物對抗齲齒的作用主要可分為三方面 : (1) 抑制細菌之代謝 (Inhibiting bacterial metabolism) 氟離子無法進入細菌之細胞壁和細胞膜, 唯有以 HF 的形式才能快速進入細胞, 當牙菌斑的 ph 值下降, 細菌製造酸, 一部分存在於牙菌斑液體內的氟離子就會和氫離子結合, 形成 HF 並快速地擴散進入細胞, 進而吸引更多胞外的 HF 胞內的 HF 會分解 酸化細胞 釋放氟離子, 進而影響細菌酵素的活性, 例如抑制 enolase, 使細菌無法代謝碳水化合物 隨著 ph 值的降低,Mutans streptococci 對於氟離子的存在也會更加敏感 至於氟化物的最低濃度該多少才具有療效呢? 有研究顯示 19 ppm 之氟離子濃度可以抑制微生物產生酸, 並且防止 mutans streptococcis 在牙菌斑內生長 另一篇研究則指出 2.5 到 10 ppm 的氟離子濃度, 在含有蔗糖的環境下, 可以抗拒牙菌斑內酸的產生 但是對於隱藏在鄰接面之牙菌斑而言,200 ppm 的氟離子濃度才具有抑制的效果 (2) 抑制去礦化 (Inhibiting demineralization) 人類牙釉質 牙骨質 牙本質 和骨骼之礦物質成分主要為碳化氫氧基磷灰石 Ca 10-x (Na) x (PO 4 ) 6-y (CO 3 ) z (OH) 2-u (F) u, 這種缺鈣性 富含碳化物的結構在去礦化的過程中, 容易受到酸中氫離子的侵蝕, 此時碳化物 (carbonate) 會喪失, 去礦化過程中礦物質喪失的量是 ph 值和氟離子濃度的函數, 而氟化物抑制去礦化的機制主要含兩方面, 首先它會與鈣離子 磷酸根離子鍵結, 降低礦物質成分流失到牙菌斑和唾液 ; 另外, 藉由沉積作用可將硬組織內的孔洞縮小, 影響溶解離子的擴 3

5 散與進出 (2) 增進再礦化 (Enhancing remineralization) 研究顯示齲齒引起的硬組織溶解可藉由磷灰石的晶粒成長達到再礦化的作用, 且早期的牙釉質 white-spot lesions 若接觸到唾液也會產生再礦化, 而氟化物的作用在於它可被吸附至晶體表面, 並進而吸引鈣離子和磷酸根離子之堆積, 形成新的礦物成分 新形成的化合物不含 carbonate, 其組成介於 FAP 和 HAP 之間, 溶解度則比碳化氫氧基磷灰石高出許多, 在高齲齒罹患率的患者, 除了局部氟化物的給予外, 尚須合併 chlorhexidine 漱口 氟化物可藉由減低晶體體積和增加結構穩定兩方面來改變磷灰石之晶體結構, 其鍵結模式可分 firmly bound fluoride 和 loosely bound fluoride, 前者指氟離子佔據氫氧基磷灰石之晶格位子 (crystalline lattice of hydroxyapatite), 形成氟化氫氧基磷灰石 (fluorhydroxyapatite); 後者指氟離子被吸附在磷灰石表面或是氟離子從相對可溶性含氟沉積物 (relatively soluble fluoride-containing deposits) 中釋放 早期預防齲齒的材料和治療齲齒的對策, 盡量避免形成氟化鈣 (calcium fluoride), 因為它的形成會帶走牙釉質中的鈣離子, 且氟化鈣被認為溶解速度較快 不過有些學者持不同看法, 他們認為施予高濃度氟化物後的主要形成產物為氟化鈣 (CaF 2 ), 而氟化鈣是抑制齲齒進行的主要成分 不斷的酸循環刺激會將 loosely bound fluoride 轉變成 firmly bound fluoride, 並漸漸耗損氟化物中之氟離子 氟化物增進再礦化的機制則為前面所提氟離子佔據氫氧基磷灰石之晶格位子, 形成低溶解度之氟化氫氧基磷灰石 有關氟化物之研究眾多, 且幾乎所有研究都顯示氟化物具有正面的療效, 例如 : 不論是每週給予 5 分鐘 1000 ppm 氟化物溶液, 或是添加 1 ppm 氟化物至再礦化溶液, 亦或是只給予一次 5 分鐘 2 mmol/l disodium methanehydroxy bisphosphonate, 皆能在 transverse microradiography 的觀察下, 看到牙釉質及牙本質再礦化的情形, 而去礦化所形成的孔洞 (pores) 也會被磷灰石 (apatite) 所填滿 不管在乳牙或恆牙, 用含氟的漱口水漱口皆能有效抑制齲齒的進展 由於氟化鈣存在於唾液中, 因此在局部給予氟化物治療前, 完全乾燥牙齒的動作是不必要的 4. 目前用於預防及治療齲齒之含氟材料 表 1 列出曾被建議作為氟離子之載體 氟離子濃度 和給予方式 表 1. 氟化物之建議濃度及給予方式 F concentration Frequency of application Water fluoridation Optimal 1 ppm Continuously Milk fluoridation 7.5 ppm At school Fluoride toothpaste ppm Twice daily Fluoride tablets mg/tablet Daily Fluoride drops ppm Daily Rinsing solutions ppm Daily Salt fluoridation ppm Continuously Concentrated solutions 10,000 ppm Biannual Concentrated gels ,300 ppm Biannual Lacquers ,600 ppm Biannual 4

6 由於台灣沒有實施飲水加氟, 因此必須依靠氟化物來防止齲齒的發生, 曾被建議的氟化物描述如下 : (1) fluoridated milk: 有報告指出可以抑制去礦化 (2) fluoride varnish: 很多研究指出具有臨床治療效果, 它可以抑制牙釉質去礦化和促進再礦化, 對於乳牙之小窩裂溝 (pit and fissure) 齲齒也具有治療效果 其中 Duraphat (Colgate-Palmolive Co., New York) 是最常被研究的材料, 它比 Duraflor (Pharmascience Inc., Montreal) 釋放氟離子的量還多, 前者可持續釋放至 28 個禮拜, 後者則僅釋放至 19 個星期 每年給予乳牙兩次 fluoride varnish, 可以降低齲齒發生率 若在短時間內多次給予, 齲齒降低的情況會更明顯 用 fluoride varnish 塗抹在牙齒後可形成一層薄膜 (adherent film), 其持續時間可至 24 小時, 因此常建議患者 24 小時後再開始刷牙, 以延長氟離子被吸收進入牙齒結構的時間, 沉積的氟離子常以 calcium fluoride 的形式存在, 這也是緩慢釋氟的儲存槽, 其作用機制可能與抑制細菌的性質有關 (3) low-fluoride-content two-component rinse: 有學者研發一管含 F, 另一管含 Ca 的材料, 使用時將兩管混合塗於牙齒表面, 在 in vitro 和 in vivo 的實驗中, 氟離子在牙釉質表面 唾液 牙菌斑 和牙菌斑溶液內的濃度比使用同 F 濃度的 NaF 還高 使用 NaF 漱口後, 沈積在牙齒表面的化合物主要以 calcium fluoride 的形式存在 而在使用高濃度的氟化物時, 如何盡量壓低濃度避免氟中毒 (fluorosis) 的情況發生, 且又能保持高度抗齲齒的能力, 是一個需要被仔細考慮的問題 (4) 牙膏含氟或蘇打 (dentifrice containing fluoride and/or baking soda): 研究結果顯示將蘇打加入含氟牙膏不會增進亦不會降低牙釉質去礦化和再礦化的程度 (5) 茶 (tea): 其平均氟離子濃度為 1.35 到 2.56 ppm, 不含咖啡因的茶 (decaffeinated teas, 3.19 ppm) 又比含咖啡因的茶 (caffeinated teas, 1.50 ppm) 高, 而 herbal teas 的濃度最低 (0.05 ppm), 不過關於茶之預防齲齒效果沒有完整的研究報告 (6) rinsing solutions: 目前市售的含氟漱口水濃度為 0.05% (230 ppm), 而處方用之漱口水濃度則為 0.20% (920 ppm), 處方用之氟膠為 1000 到 5000 ppm 有些臨床上使用之氟膠甚至高達 10,000 到 12,300 ppm, 使用在年幼兒童時必須特別小心 (7) fluoride tablets: 食用之氟錠 (dietary fluoride) 是被設計使用在飲水未加氟之地區, 氟的含量為 0.25 到 1.0 mg 有些學者則把氟加入復形材料中, 藉以防止齲齒的再度發生, 這些材料包括 : (a) 氟離子加在 resin based on polysiloxane, 或是 fluoridated rewetting agent, 兩者皆可以有效防止齲齒的形成 (b) 玻璃離子體 (glass ionomer) 這是最常被廣泛使用及研究的材料, 在 in vitro 的實驗中, 玻璃離子體可以有效抑制人工二次齲齒 (artificial secondary caries) 的發生, 並促進再礦化, 這可能由於玻璃離子體可以釋放氟離子, 許多臨床研究亦顯示玻璃離子體比汞齊防止齲齒的療效較長, 5

7 另外一個功用為玻璃離子體具有抑制細菌的作用, 特別是 mutans streptococci 而 resin modified GI 在 in vitro 中抑制自然的牙釉質齲齒, 或是在 in vitro 和 in vivo 中抑制人工的牙釉質齲齒等, 也都具有不錯的效果 可是另有一派學者持相反的看法, 在標準的界面空隙下 (standardized interfacial gap),in vivo 的情況顯示玻璃離子體 (glass ionomer) 無法保護鄰近的牙釉質壁, 使其免於二次齲齒的侵襲, 這代表 in vivo 模型和 in vitro 模型之結果關連性不高, 人造齲齒的實驗引伸至臨床可能會有相當的誤差, 其他研究亦顯示玻璃離子體抑制二次齲齒的能力不佳 這些矛盾主要來自於玻璃離子體的抗齲齒能力可能不是因為釋放氟, 而是黏著或邊緣密合度的效果, 一旦邊緣密合度不佳, 即使能夠釋放氟, 也無法防止齲齒的發生 另外玻璃離子體釋放氟離子的模式, 也是一個亟待克服的問題, 不管在 in vitro 或是 in vivo, 都是在前幾天內大量釋放, 無法達到緩慢釋放的目的 5. 氟中毒 (dental fluorosis) 幾乎所有在美國和加拿大販售的牙膏其氟離子濃度接近 1000 到 1100 ppm, 對於尚未具有足夠能力吐出的年幼兒童, 這些高濃度牙膏是氟攝入的主要來源, 研究發現這可能是氟中毒 (dental fluorosis) 的危險因子 另外一個危險因子為額外使用 (supplement use) 之含氟漱口水 氟膠 氟錠等 台灣目前沒有研究報告指出市售的牙膏含氟濃度, 不過國人習慣用外國廠牌, 因此氟離子攝取量可能與美國相去不遠 對於兩個月大之嬰兒, 若生長在飲水未加氟之地區, 其每天氟之攝取量約為 0.05 mg/d; 若生長在飲水加氟之地區,4 到 8 歲的兒童每天氟之攝取量可至 1.0 mg 短時間食用超過 8 mg F/kg bw, 會造成氟中毒, 急性氟中毒的症狀包括噁心 (nausea) 嘔吐 (vomiting), 少數情況下會造成死亡 致死劑量則在 32 到 64 mg F/kg bw 之間, 因此對於 70 公斤的成人來說, 短時間食入 5 到 10 g 的氟會致死,2 歲 10 公斤的兒童, 食入 320 mg 會致死 以牙膏來說,10 公斤的兒童約需食入 291 g 或大於 10 oz 的 1100 ppm 牙膏才會致死, 對於 0.05% 的含氟漱口水, 必須飲用超過 1 升, 但是若使用 1.23% 氟膠 (12,300 ppm), 只要食用超過 26 ml (<1 oz) 即可致死, 這是需要特別注意的 四 研究方法 本研究將研發具有釋氟能力之牙齒貼片 ; 將其包覆在易罹患齲齒之牙齒或者已有 white spot lesion 之牙齒, 利用其釋氟之能力以預防齲齒 研究中將探討貼片之釋氟行為, 決定最低且又有效之氟離子濃度, 並以體外模型評估其對抗齲齒之能力, 為將來之臨床試驗建立基本資料, 以達到應用於人體之最終目標 目前對於鑄膜液之配製以及釋氟貼片之製作已有初步了解 本年度除了繼續探討成膜環境及鑄膜液濃度對貼片本身性質的影響外, 主要目標為釋氟貼片與牙釉質表面之交互作用及 in vitro 模型之測試, 以評估釋氟貼片預防齲齒之療效 以下將詳細介紹實驗之內容 : 1. 釋氟貼片之製造 本研究所製備之釋氟貼片, 是以 PVDC (poly vinyldichloride) 材質之保鮮膜作為支撐 層, 此材料具有不透水之性質, 可以防止貼片上之含氟塗料擴散至口腔之中, 且材料耐熱 6

8 溫度可達 140, 係全世界保鮮膜中耐熱溫度最高者, 並符合日本食品衛生法及美國食物藥物管理局 FDA 規格, 因此用於口腔中具有高度的安全性 而為了使貼片與牙齒表面有良好之貼附力, 在製備貼片的溶液 ( 鑄膜液 ) 中, 添加具有高黏度且對於身體不具危害性之増黏劑 Carbopol (poly acrylic acid), 然而 carbopol 水溶液呈現酸性 (ph 值 2.5~3.5), 遠低於口腔中安全 ph 值 (5.5~7.0), 因此鑄膜液中添加 KH 2 PO 4 及 K 2 HPO 4 作為緩衝溶液, 使配製完成之鑄膜液 ph 值為 6.7~7.0 此外由於液體中之質傳速率通常較固體中快, 因此於鑄膜液中亦添加少量之甘油 (glycerin), 作為保濕劑之用, 以抑制水分的蒸發, 進而使貼片保持濕潤, 讓氟離子可以較快地擴散進入牙齒表面 將 NaF carbopol 及 glycerin 加入 K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 水溶液中, 常溫下攪拌約 12 小時後, 用可調式刮刀在貼有保鮮膜的玻璃板上刮出 300 µm 厚薄膜, 隨後將 casting film 置入 或 40 烘箱中乾燥 24 小時 2. 釋氟貼片之性質分析 (1) 貼片最適黏度隨著鑄膜液中 carbopol 濃度之提升, 溶液之黏度也隨之升高, 因此製作完成之貼片與牙齒表面之間會有更好之貼附力, 但也由於貼片的高黏度, 造成流動性的缺乏, 因此增加了質傳上的阻力, 而氟離子釋放速率也就大為降低, 同時後續在貼片的保存上也有沾黏的問題 ; 然而,carbopol 濃度過低亦會使得鑄膜液黏度不足而無法成膜, 因而必須藉由反覆的實驗來尋找鑄膜液之最佳黏度, (2) 氟離子之釋放濃度曲線將各種製作條件下之釋氟貼片置於 37 o C 40 ml 之人工唾液中 30 天, 為了模擬口腔內之情況, 每天更換浸入溶液, 每天量測水溶液中氟離子之含量, 所用之儀器為 ion meter (290A, Orion Research, Cambridge, MA, USA) 及含氟離子專測電極 (fluoride specific electrode) (Orion 9609BN, Orion Research), 使用時添加等量之氟離子強化劑 TISAB buffer (Orion Research) 至待測溶液中 3. 釋氟貼片與牙釉質表面之交互作用 (1) 標本製備選用拔除的人類恆齒, 其牙冠沒有蛀牙 補綴物及斷裂 殘存在牙齒表面的軟組織則用結石刮 (Sonicflex 2000, KaVo Co., Biberbach, Germany) 將其去除, 之後以鑽石鋸片切割機 (isomet) 將牙齒表面之牙釉質部分切下, 再以砂紙將牙齒標本磨平, 使所有標本尺寸都約為 2mm 2mm, 並保存於含 0.2% thymol 的蒸餾水中以抑制細菌的生長 (2) 牙釉質表面分析由不同氟濃度之鑄膜液所製作的的釋氟貼片各分配 12 個牙齒樣本, 分別於 1 小時 3 小時 6 小時 1 天 3 天及 7 天後作牙釉質表面分析, 每組各 2 個牙齒樣本 將牙齒樣本之表面 ( 牙釉質面 ) 貼附於釋氟貼片上, 接著將貼片連同牙齒標本置於人工唾液中 由於貼片上之薄膜呈現 gel 狀, 相較於一般水溶液有相當大之質傳阻力, 而質傳速率是由 diffusivity coefficient 及 concentration gradient 所決定, 因此除改變貼片端之氟離子濃度外, 也測試在不同溫度及不同流速下, 對於氟離子釋放及牙齒表面吸收之影響 實驗完成後, 以 XPS(ESCA) 表面元素分析儀 X 光繞射光譜儀 (XRD) electron probe microanalyzer (EPMA) SEM-EDX 及氟離子電極等儀器做表面分析, 儀器之操作 7

9 步驟如下 : XPS(ESCA): 以拭鏡紙拭乾標本, 放入 80 烘箱乾燥 24 小時, 再以離子覆膜儀 (sputter coater) 將標本表面鍍金, 之後再經 80 烘箱乾燥 24 小時, 最後以 XPS(ESCA) 表面元素分析儀進行牙齒標本之表面分析, 觀察 Ca P O F 之相對含量百分比 X 光繞射光譜儀 (Rigaku X-ray powder diffractometer): 分析貼片包覆後之牙釉質結晶相, 並觀察表面是否有沉積之化合物, 以每分鐘四度的掃描速率掃描 10 度到 60 度的繞射角, 以探測不同相的內容 每一相特徵峰的相對強度 Electron probe microanalyzer (EPMA; JXA-8900, JEOL, Tokyo, Japan): 操作電壓 :10 kv, 探針電流 :0.1 µa,time constant:0.05 s,analyzing crystal: LDE1, 被牙釉質攝入之氟離子密度分佈以 dot maps 表示 SEM-EDX: 以掃描式電子顯微鏡觀察牙釉質標本的顯微結構變化, 標本浸在 2.5% glutaraldehyde 0.1mol/L cacodylate buffer ph 小時, 接著所有標本經系列酒精脫水 (50% 60% 70% 80% 90% 95% 100%), 各濃度浸潤時間為 45 分鐘, 然後再經臨界點乾燥及鍍碳, 標本以 Philips 515 SEM 觀察, 並以 energy-dispersive X-ray spectroscope (EDAX) 分析表面元素含量的變化 氟離子專測電極 (fluoride specific electrode) 以拭鏡紙拭乾標本後, 浸於 12N 之濃鹽酸中, 待牙齒標本完全溶解後, 加入等量之氟離子強化劑 TISAB buffer (Orion Research), 以氟電極量測溶液中之氟離子濃度, 並依據標本表面積, 計算單位面積之氟離子吸收濃度 4. 抑制去礦化與促進再礦化之測試釋氟貼片之選擇 : 由前面的研究中, 選擇具有良好釋氟能力之薄膜 (1) 人工齲齒之製造 : 選用拔除的人類大臼齒, 標本的前製備如前面所述, 尺寸約為 2 mm 2 mm; 浸泡於 37 o C 之去礦化溶液 (demineralizing solution) 中 6 天, 溶液成分為 0.1 M lactic acid (ph 約為 2.5) (2) 抑制去礦化之測試 : 浸泡去礦化溶液之過程中, 將牙齒標本分為兩組, 其中一組先以釋氟貼片貼附於表面再行浸泡, 另一組則直接浸泡於去礦化溶液, 於 1 天 3 天 7 天後作牙釉質表面分析, 比較貼片使用與否對於礦物質含量變化之影響, 所用的分析儀器包括 EPMA 和 transverse microradiography (TMR), 其中 EPMA 的實驗操作已於前面描述過, 底下僅針對 TMR 之標本製備和實驗操作做描述 (3) TMR 之標本製備 : 使用水冷卻之鑽石刀片 (Well Walter EBNER, model 3242, USA), 垂直牙釉質表面在窗口處切割, 每個窗口至少兩塊 300 μm 薄片, 接著用 custom-made diamond disc 磨薄一面至標本厚度約為 220 μm, 繼續磨薄另外一面至 100 μm (4) TMR 之實驗操作 : 將所有切片置於感光片上, 在暗房內利用高解析 photographic plates (1A, 0.25 μm 8

10 resolution, Kodak, USA) 和 Cu(Kα) monochromatic X-ray source (Philips B. V, Eindhoven, The Netherlands), 照射 15 秒, 操作電壓為 5kV, 電流 4 ma,focus distance 為 30 公分, 再以軟體分析感光片上標本影像之光學密度, 與標準試片比較後, 可記錄礦物質喪失程度 (vol.% μm) 脫鈣深度(lesion depth, μm) 和再礦化程度 5. 促進再礦化之測試 : 經過去礦化溶液浸泡之牙齒標本分為兩組, 其中一組以釋氟貼片貼附表面, 兩組同時浸泡於人工唾液中 6 天, 之後作牙釉質表面分析, 比較貼片使用與否對於牙齒再礦化之影響, 所用的分析儀器包括 EPMA 和 transverse microradiography (TMR), 標本製備和實驗操作如同前面所描述 重要儀器之配合使用情形 * 酸鹼 / 離子測定器 : 已由國科會補助經費購買 * X 光繞射光譜儀 : 將至台大醫學工程研究所借用 * EPMA 和 SEM-EDX: 將利用國科會貴儀中心之儀器 * 其他儀器則在台大牙醫學系內使用 五 結果與討論 過去一年, 除了針對氟化物在齲齒預防上之應用及發展作完整的文獻回顧與整理外, 在實驗部分, 則對於釋氟貼片的鑄膜液之配製, 進行測試與研究, 溶液中所添加用以預防 齲齒的氟化物, 是一般最為常見, 而且價格低廉, 在水溶液中又近乎完全解離的氟化鈉 ( 因 為以氟離子形式存在, 才能對齲齒之預防發揮作用 ), 而為了使貼片具有黏性足以貼附牙 齒, 並且保持貼片的濕潤及中性之 ph 值, 尚須添加 carbopol (poly acrylic acid) 甘油 (glycerin) 及 KH 2 PO 4 \K 2 HPO 4 等成分 Carbopol 是一種以丙烯酸 (acrylic acid)(fig. 1) 為單體 之聚合物 (Fig. 2), 由於鏈上帶有大量 -COOH 官能基之高分子, 因此水溶液呈現酸性,pH 值介於 2.5~3.5, 而隨著 ph 值上升,-COOH 上之 H +, 逐漸被金屬離子 ( 或銨根離子 ) 所取代, 因此分子內氫鍵被打斷, 使高分子由蜷曲轉為直鏈 (Fig. 3), 增加了分子間之作用力, 造成 黏度隨著 ph 值的上昇而大幅提高 (Fig. 4), 而使溶液形成膠狀之凝固狀態 (Fig. 5) 此外, 由於釋氟貼片作用之環境為口腔, 因此溶液之 ph 值必須調整在 5.5~7.0 之間 (ph 低於 5.5 極易產生去礦化或脫鈣現象 ), 故 Carbopol 濃度之控制, 以及調整溶液 ph 值之過程, 都是 極為關鍵之步驟 一般而言,carbopol 之濃度約控制在 1~2 wt%, 溶液黏度便足以刮膜, 並 讓貼片與牙齒之間產生足夠之貼附力, 而溶液之 ph 值則利用所添加的 KH 2 PO 4 及 K 2 HPO 4 形成緩衝溶液來控制, 使得配製完成之鑄膜液 ph 值維持在 6.7~7.0 此外, 鑄膜液中所添 加少量之甘油 (glycerin) 則作為保濕劑之用 ; 由於液體中之質傳速率通常較固體中為快, 因 此藉由甘油的添加, 抑制水分的蒸發, 進而使貼片保持濕潤, 而讓氟離子可以較快地擴散 進入牙齒表面 由於釋氟貼片直接黏貼於牙齒表面, 因次為了兼具安全 功效 美觀及舒適性, 選用 安定性高 不透水 透明且材質柔軟的 PVDC (poly vinyldichloride)(fig. 6)( 保鮮膜作為支撐 層, 並在保鮮膜下方墊上材質較為堅韌之底板以利刮膜 然而, 由於保鮮膜易沾黏之特性, 因此無論使用木板 玻璃板或是投影片作為底板, 與所覆蓋之保鮮膜之間都留有相當多之 氣泡, 造成保鮮膜表面的不平坦 (Fig. 7), 而無法進行刮膜 ; 之後經過各種嘗試, 發現先於 9

11 玻璃板上貼上離心紙, 再以保鮮膜覆蓋, 便可解決上述之問題 (Fig. 8), 使實驗得以進行 但貼片製備完成後, 保存的問題則是另一瓶頸, 而這也是目前尚待解決之難題 由於貼片具有高度黏性, 須以頓性材料覆蓋才得以保存, 但投影片 離心紙 鐵氟龍等經過測試效果皆不盡理想 (Fig. 9), 因此除測試其他現有之材料, 亦計劃購買商業化之產品, 如 Mylar Scotchpak 等作進一步之測試 製備完成之貼片與牙釉質標本進行氟離子釋放與吸收測試, 則衍生另一個難題 : 由於製備貼片時, 鑄膜液須有較高之黏度才得以刮膜, 然而貼片的高黏度卻使得其中的氟離子受到極大的質傳阻力, 而無法進到牙齒表面 (Fig. 10)( 因為經過證實, 牙釉質標本在 3000ppm 之 NaF 水溶液中經過 24 小時的浸泡, 便可明顯量測到表面氟離子的存在 (Fig. 10), 而若 NaF 濃度提升到 10000ppm, 更可在 15 分鐘的浸泡後, 便量測到氟的存在 ), 因此根據質量傳遞的經驗公式, 除了在兼顧刮膜的黏度下, 儘可能降低 carbopol 的含量, 以提高 mass transfer coefficient 外, 另外也在安全考量下, 提高氟離子濃度, 以增加質傳之 driving force; 當然, 因增黏劑分子結構中特殊的官能基與氟產生鍵結而影響質傳的可能性亦不可被排除, 此外亦針對溫度 速度. 等因素對氟離子釋放 ( 吸收 ) 速率的影響進行探討 ; 綜合以上各種變因, 將藉由反覆的實驗來比對和驗證, 以求得最佳之操作條件 Fig. 1. Acrylic acid Fig. 2. Carbopol (poly acrylic acid) Fig. 3. Carbopol with H + replaced by NH

12 Fig. 4. Carbopol 黏度隨 ph 值變化之關係圖 Fig. 5 調整 Carbopol 溶液至中性時所產生之膠狀凝固現象 Fig. 6 Polyvinyl dichloride Fig. 7 保鮮膜直接貼於玻璃板上造成表面因氣泡產生皺摺 11

13 Fig. 8 先在玻璃板貼上離心紙再覆蓋保鮮膜, 便可解決表面不平坦之問題 Fig. 9 由於沾黏之問題, 因此造成貼片保存上之困難 F 1s Cps Binding energy (ev) Fig. 10 牙齒標本以含有 ppm NaF 之貼片貼覆 24 小時後, 表面仍然無法量測到 氟離子之存在 12

14 ppm F 1s Cps Binding energy (ev) Fig. 11 牙齒標本浸泡 3000ppm NaF 溶液 24 小時後, 可在牙齒表面量測到氟離子 六 參考文獻 1. Aoba T. The effect of fluoride on apatite structure and growth. Crit Rev Oral Biol Med 1997;8: Arends J, ten Cate JM. Tooth enamel remineralisation. J Cryst Growth 1981;53: Arends J, Christoffersen J, Christoffersen MR, Schuthof J. Influence of fluoride concentration on the progress of demineralization in bovine enamel at ph 4.5. Caries Res 1983;17: Arends J, ten Cate JM. Tooth enamel remineralisation. J Cryst Growth 1981;53: Arnold WH, Cerman M, Neuhaus K, Gaengler P. Volumetric assessment and quantitative element analysis of the effect of fluoridated milk on enamel demineralization. Arch Oral Biol 2003;48: Autio-Gold JT, Courts F. Assessing the effect of fluoride varnish on early enamel carious lesions in the primary dentition. JADA 2001;132: Awad MA, Hargreaves JA, Thompson GW. Dental caries and fluorosis in 7-9 and year old children who received fluoride supplements from birth. J Can Dent Assoc 1994;60: Beltrán-Aguilar ED, Goldstein JW, Lockwood SA. Fluoride varnishes: a review of their clinical use, cariostatic mechanism, efficacy and safety. JADA 2000;131: Benelli EM, Serra MC, Rodrigues AL, Cury JA. In situ anticariogenic potential of glass ionomer cement. Caries Res 1993;27: Bibby BG, Fu J. Effects of fluorides on in vitro acid production by dental plaque. J Dent Res 1986;65: Borsboom PC, vd Mei HC, Arends J. Enamel lesion formation with and without 0.12 ppm F in solution. Caries Res 1985;19: Bradshaw DJ, McKee AS, Marsh PD. Prevention of population shifts in oral microbiological communities in vitro by low fluoride concentrations. J Dent Res 1990;69:

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19 89. ten Cate JM, Featherstone JD. Mechanistic aspects of the interactions between fluoride and dental enamel. Crit Rev Oral Biol Med 1991;2(3): ten Cate JM, van Duinen RNB. Hypermineralization of dentinal lesions adjacent glass-ionomer cement restorations. J Dent Res 1995;74: ten Cate JM. Review on fluoride, with special emphasis on calcium fluoride mechanisms in caries prevention. Eur J Oral Sci 1997;10: ten Cate JM. Current concepts on the theories of the mechanism of action of fluoride. Acta Odontol Scand 1999;57: ten Cate JM. Remineralization of caries lesions extending into dentin. J Dent Res 2001;80(5): Toumba KJ, Curzon MEJ. Slow-release fluoride. Caries Res 1993;27(suppl 1): Toumba KJ, Curzon MEJ. The prevention of dental caries using fluoride slow-releasing glass devices in children. Caries Res 1996;30: Van Louveren C. The antimicrobial action of fluoride and its role in caries inhibition. J Dent Res 1990;69: Warren JJ, Levy SM. Systemic fluoride. Dent Clin North Am 1999;43(4): Warren JJ, Levy SM. A review of fluoride dentifrice related to dental fluorosis. Pediatr Dent 1999;21(4): Whitford GM, Schuster GS, Pashley DH, Venkateswarlu P. Fluoride uptake by Streptococcus mutans Infect Immunol 1977;18(3): Wilson AD, Groffman DM, Kuhn AT. The release of fluoride and other chemical species from a glass ionomer cement. Biomaterials 1985;6: Zero DT. In situ caries models. Adv Dent Res 1995;9(3): Zimmer S, Robke FJ, Roulet JF. Caries prevention with fluoride varnish in a socially deprived community. Community Dent Oral Epidemiol 1999;27: 七 計畫成果自評 雖然製備貼片所需添加的增黏劑, 因為影響氟離子之質傳而造成實驗分析上的困難, 致使研究工作之進度些許落後, 但目前正積極尋求解決之方法, 所遭遇之瓶頸近日內可望 獲得改善, 並將持續進行接下來之工作, 已完成研究之目標 已完成之工作項目 1. 釋氟貼片之製造 2. 鑄膜液之最適黏度 3. 牙釉質表面氟含量定性分析 預期完成之工作項目 1. 薄膜之氟離子之釋放濃度曲線 2. 分析貼片包覆後之牙釉質結晶相 3. 牙釉質表面攝入之氟離子密度 18

20 4. 觀察牙釉質標本的顯微結構變化和表面元素含量的變化 5. In vitro model 下貼片的抑制去礦化和促進再礦化之效果 對於學術研究 國家發展及其他應用方面預期之貢獻 1. 提供國人齲齒預防之有效方法 2. 增進國人之口腔健康, 進而包括全身健康 3. 將研究結果製成產品, 為國家增進經濟利潤 對於參與之工作人員, 預期可獲之訓練 1. 瞭解貼片製造和藥物釋放之製程 2. 瞭解各種分析儀器之操作 3. 瞭解 in vitro model 之測試方法 4. 建立材料研發之能力 19