Microsoft Word - 國科會第三年期末報告鄭登貴-1(修改過頁碼).doc

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1 行 政 院 國 家 科 學 委 員 會 補 助 專 題 研 究 計 畫 期 中 進 度 報 告 期 末 報 告 豬 卵 母 細 胞 特 異 性 連 接 組 蛋 白 基 因 表 現 調 控 及 其 功 能 之 探 討 計 畫 類 別 : 個 別 型 計 畫 整 合 型 計 畫 計 畫 編 號 :NSC B MY3 執 行 期 間 :99 年 08 月 01 日 至 101 年 07 月 31 日 執 行 機 構 及 系 所 : 東 海 大 學 畜 產 與 生 物 科 技 學 系 計 畫 主 持 人 : 鄭 登 貴 共 同 主 持 人 : 歐 柏 榮 計 畫 參 與 人 員 : 李 彥 勳, 林 維 哲, 周 峻 賢, 陳 冠 彣, 王 愷 雯 本 計 畫 除 繳 交 成 果 報 告 外, 另 含 下 列 出 國 報 告, 共 份 : 移 地 研 究 心 得 報 告 出 席 國 際 學 術 會 議 心 得 報 告 國 際 合 作 研 究 計 畫 國 外 研 究 報 告 處 理 方 式 : 除 列 管 計 畫 及 下 列 情 形 者 外, 得 立 即 公 開 查 詢 涉 及 專 利 或 其 他 智 慧 財 產 權, 一 年 二 年 後 可 公 開 查 詢 中 華 民 國 103 年 01 月 日

2 中 文 摘 要 組 蛋 白 (histone) 為 真 核 生 物 體 細 胞 染 色 質 中 的 基 本 結 構 蛋 白 質, 依 其 所 含 鹼 性 胺 基 酸 相 對 比 例 可 區 分 為 5 種 類 型 組 蛋 白 (H1 H2A H2B H3 和 H4), 其 中 組 蛋 白 H1 又 稱 連 接 組 蛋 白 (linker histone), 在 哺 乳 動 物 細 胞 中 存 在 11 種 亞 單 元, 於 發 育 不 同 時 期 能 組 成 不 同 的 結 合 模 式, 並 在 特 定 階 段 相 互 更 換 卵 母 細 胞 特 異 性 連 接 組 蛋 白 (oocyte-specific linker histone H1, H1Foo) 首 先 於 小 鼠 中 發 現, 已 知 職 司 細 胞 核 內 染 色 質 結 構 之 維 持, 並 可 能 涉 及 卵 母 細 胞 的 成 熟 受 精 後 精 子 染 色 質 重 構 (chromatin remodeling) 胚 原 性 與 母 源 性 基 因 轉 換 調 控, 與 體 細 胞 核 移 植 時 對 體 細 胞 核 的 再 程 序 化 (reprogramming); 惟 豬 卵 母 細 胞 之 該 基 因 全 長 核 苷 酸 序 列 蛋 白 質 分 子 特 性, 及 其 可 能 涉 及 之 生 理 作 用 機 制, 則 迄 未 有 明 鑑 於 豬 隻 繁 殖 過 程 中, 豬 胚 存 活 率 決 定 豬 隻 繁 殖 力, 且 早 期 胚 存 活 之 關 鍵 為 4- 至 8- 細 胞 胚 期 階 段, 即 母 源 性 基 因 停 止 表 現, 胚 原 性 基 因 開 始 轉 錄 或 轉 譯 之 際, 在 此 過 程 中, 除 特 定 轉 錄 因 子 的 數 量 活 性 外, 染 色 質 結 構 成 分 的 變 化 也 扮 演 關 鍵 性 的 角 色 本 研 究 已 針 對 源 自 生 發 泡 (germinal vesicle, GV) 階 段 之 豬 卵 母 細 胞 之 總 RNA 樣 品, 成 功 獲 得 豬 H1Foo(pH1Foo) 完 整 cdna 並 以 此 cdna 構 築 重 組 蛋 白 表 現 載 體, 轉 染 置 豬 內 皮 細 胞 (PEC), 探 討 表 現 H1Foo 重 組 蛋 白 對 基 因 表 現 的 影 響 結 果 顯 示 H1Foo 重 組 蛋 白 表 現 於 細 胞 核 中, 且 對 細 胞 中 oct4,sox2,nanog 及 c-myc 之 表 現 量 有 影 響, 此 結 果 顯 示 H1Foo 蛋 白 質 對 細 胞 的 remodeling 扮 演 重 要 的 角 色 此 外, 透 過 H1Foo 5 調 節 區 報 導 基 因 的 分 析 之 研 究 顯 示 H1Foo 5 調 節 區 的 1.5 Kb 及 0.8 Kb 並 無 法 使 HiFoo 基 因 表 現 於 小 鼠 2-8 細 胞 的 胚 胎 中, 此 結 果 顯 示 豬 和 小 鼠 胚 胎 中 H1Foo 基 因 表 現 的 調 節 有 很 大 的 差 異 關 鍵 字 : 豬 卵 母 細 胞 特 異 性 連 接 組 蛋 白 質 胚 胎 發 育 ABSTRACT Eukaryotic histone proteins are mainly responsible for the nucleosome structure of the chromosomal fiber through package and order the DNA into nucleosome to provide the first level of chromatin organization. Among them, core histones (histones H2A, H2B, H3 and H4) play an essential role in constraining DNA wrapped around the histone octamer to produce a nucleosome core particle, while linker histones (histone H1 family) locate the exterior of the nucleosome core and associate with linker DNA to keep the chromatin in a helical and compact state to regulate gene expression. The oocyte-specific linker histone H1 (H1Foo) is first found in the mouse oocyte and participates in various steps of embryogenesis including oocyte maturation, sperm chromatin remodeling after fertilization and donor cell reprogramming after somatic nuclear transfer. The sequence of full-length H1Foo cdna has been identified in mice, human, bovine and other non-mammalian species, but not in porcine. The objectives of this study were to identify and characterize the porcine specific H1Foo gene for explication of the maternal control of germline development following fertilization. Full length porcine H1Foo cdna was cloned by RT-PCR from oocytes RNA in germinal vesicle. Expression of recombinant H1Foo in porcine endothelium cells showed the recombinant H1Foo protein was I

3 located in nucleus. In addition, expression of H1Foo induced the expression of oct4,sox2,nanog and c-myc reprogramming related genes. To investigate the mechanism of regulation of H1FOO gene expression in early stage of embryo development, 5 regulatory region of H1Foo was cloned into a reporter gene containing plasmid. After microinjection, the reporter gene did not expression in mouse early stage of embryo development. This result indicates that expression of H1Foo gene is regulated differently in different species. Key words: pig, oocyte-specific linker histone H1, embryo development II

4 前 言 真 核 生 物 染 色 質 的 主 要 化 學 成 分 為 去 氧 核 醣 核 酸 (DNA) 與 組 蛋 白 (histone), 其 結 構 單 體 為 核 小 體 (nucleosome), 由 DNA 與 組 蛋 白 以 特 殊 方 式 相 連 組 成, 包 含 核 心 顆 粒 (core particle) 與 連 接 區 DNA(linker DNA) 兩 部 份 (Baake et al., 2001), 在 哺 乳 動 物 基 因 組 中, 組 蛋 白 是 調 控 基 因 表 現 的 重 要 遺 傳 學 機 制, 在 保 持 胚 幹 細 胞 的 全 能 性 與 癌 症 的 病 理 過 程 中 扮 演 重 要 角 色, 其 具 有 多 種 修 飾 形 式, 包 括 : 甲 基 化 (methylation) 乙 醯 化 (acetylation) 磷 酸 化 (phosphorylation) 等, 組 蛋 白 藉 由 這 些 不 同 的 共 價 修 飾 作 用, 不 但 可 以 藉 由 調 控 組 蛋 白 與 DNA 雙 股 的 親 和 性, 進 而 使 染 色 質 結 構 呈 現 疏 鬆 或 凝 集 狀 態, 亦 可 藉 由 這 些 修 飾 作 用 影 響 其 他 轉 錄 因 子 與 結 構 基 因 啟 動 子 的 親 和 性, 調 控 相 關 基 因 表 現 組 蛋 白 中 的 連 接 組 蛋 白 具 有 種 族 與 組 織 特 異 性, 於 染 色 質 結 構 與 功 能 皆 具 重 要 功 能, 與 調 節 染 色 質 纖 維 的 濃 縮 與 解 濃 縮 有 關, 目 前 已 知 連 接 組 蛋 白 不 僅 依 其 所 在 位 置 而 具 有 連 接 及 穩 定 兩 核 心 組 蛋 白 的 八 聚 體 特 性, 尚 能 藉 由 促 進 核 小 體 的 緊 密 折 疊 壓 縮, 使 染 色 質 形 成 高 級 結 構, 且 可 能 涉 及 染 色 質 之 修 飾 基 因 表 達 模 式 與 發 育 調 控 等 相 關 分 子 機 制 與 核 心 組 蛋 白 相 比, 連 接 組 蛋 白 具 有 更 多 的 亞 單 元, 在 哺 乳 動 物 卵 母 細 胞 與 早 期 胚 發 育 過 程 中, 已 經 鑑 定 的 連 接 組 蛋 白 共 有 11 種 亞 單 元, 其 中 包 括 7 種 體 細 胞 型 連 接 組 蛋 白 (H1.1 to H1.5, H10, and H1x) 3 種 精 子 特 異 性 型 連 接 組 蛋 白 (H1t, H1T2, and HILS1) 與 1 種 卵 母 細 胞 特 異 性 連 接 組 蛋 白 (H1Foo)(Wiśniewski et al., 2007), 彼 等 連 接 組 蛋 白 亞 單 元 在 不 同 的 發 育 時 期 能 夠 形 成 不 同 的 結 合 模 式, 並 且 依 照 特 定 方 式 相 互 更 替 H1Foo 是 在 卵 母 細 胞 中 發 現 的 一 種 特 異 性 連 接 組 蛋 白, 於 卵 母 細 胞 的 成 熟 扮 演 重 要 的 角 色, 目 前 已 於 小 鼠 (Tanaka et al.,2001) 人 (Tanaka et al.,2003) 與 牛 (Mcgraw et al.,2006) 等 哺 乳 動 物 中 相 繼 發 現, 其 與 非 哺 乳 動 物 的 cs-h1( 源 自 海 膽 ) B4( 源 自 非 洲 爪 蟾 蜍 ) 等 卵 特 異 性 連 接 組 蛋 白 具 有 同 源 性, 亦 即 其 蛋 白 質 結 構 同 樣 具 有 N 末 端 C 末 端 與 中 央 球 狀 結 構 區 (cebtral globular domain), 在 結 構 上, 小 鼠 人 與 牛 的 H1Foo 均 由 5 個 外 顯 子 (exon) 與 4 個 內 含 子 (intron) 組 成, 此 與 體 細 胞 型 H1s 不 具 內 含 子 與 多 聚 線 苷 酸 (polyadenylation motif) 的 特 性 相 異 目 前 對 於 H1Foo 的 調 控 機 制 仍 迄 未 有 明, 但 諸 多 試 驗 已 對 於 H1Foo 於 早 期 胚 發 育 過 程 中 的 表 現 圖 譜 提 出 討 論 (Fan et al., 2003) 證 明 在 早 期 卵 母 細 胞 原 核 胚 2- 與 4- 細 胞 胚 期 中 只 有 極 少 量 甚 至 幾 乎 不 存 在 的 體 細 胞 H1s, 但 經 過 兩 次 卵 裂 至 4- 細 胞 胚 期 後, 體 細 胞 型 H1s 將 再 次 出 現, 而 與 此 體 細 胞 型 H1s 呈 現 相 反 的 時 空 表 現 則 是 H1Foo, 因 為 其 從 早 期 卵 母 細 胞 到 2- 與 4- 細 胞 胚 期 將 一 直 存 在, 至 4- 細 胞 胚 期 末 期 才 消 失 (Tanaka et al., 2001), 證 明 不 同 亞 單 元 的 連 接 組 蛋 白 在 小 鼠 胚 發 育 之 2- 細 胞 期 發 生 轉 換, 但 其 之 間 的 相 聯 性 則 有 帶 進 一 步 試 驗 之 證 明 此 外,H1Foo 也 被 發 現 可 能 涉 及 體 細 胞 核 的 基 因 組 再 程 序 化 (genomic reprogramming),teranishi et al.(2004) 發 現, 當 體 細 胞 核 移 置 進 入 小 鼠 去 核 卵 母 細 胞 10 分 鐘 後,H1Foo 即 出 現 在 供 核 體 中, 並 且 供 核 體 細 胞 中 的 體 細 胞 型 H1s 會 被 H1Foo 替 換, 於 4- 細 胞 胚 期 後 才 再 度 出 現, 此 種 H1Foo 與 體 細 胞 型 H1s 之 間 的 消 長 趨 勢 與 體 外 受 精 的 合 子 一 致, 推 論 H1Foo 對 於 體 細 胞 的 基 因 組 再 程 序 化 可 能 是 不 可 或 缺 的 重 要 因 子 之 一 綜 合 上 述,H1Foo 其 表 達 方 式 具 有 一 定 的 時 序 性, 不 但 可 能 在 母 源 性 與 胚 原 性 基 因 表 現 轉 換 過 程 中 發 揮 功 能, 於 基 因 組 再 程 序 化 過 程 中 亦 可 能 扮 演 關 鍵 性 調 控 因 子, 因 此 分 析 研 究 H1Foo 將 有 助 於 更 深 入 了 解 染 色 質 的 重 構 基 因 組 再 程 序 化 過 程 以 及 核 移 置 的 分 子 機 制 1

5 早 期 胚 存 活 或 發 育 為 一 複 雜 之 調 控 過 程, 尤 其 卵 母 細 胞 原 本 係 一 種 高 度 分 化 的 生 殖 細 胞, 當 卵 與 精 子 完 成 受 精 作 用 後, 受 精 卵 必 須 在 早 期 胚 發 育 過 程 中, 將 其 原 本 處 於 高 度 分 化 之 細 胞 型 態 轉 化 為 具 有 多 分 化 潛 能 之 分 溝 細 胞 (blastomere), 且 此 一 轉 換 變 化 需 於 胚 埋 植 發 生 之 前 完 成, 而 在 胚 埋 殖 發 生 之 前, 其 發 育 已 知 必 須 經 過 三 個 發 育 轉 換 階 段 始 能 順 利 使 胚 繼 續 存 活 並 埋 植, 其 中 第 一 個 轉 換 階 段 主 要 是 母 源 性 與 胚 源 性 轉 換 (maternal to zygoteic transition), 意 即 在 此 過 程 期 間, 母 源 性 基 因 將 停 止 表 現, 而 胚 源 性 基 因 則 開 始 進 行 轉 錄 或 轉 譯 已 供 胚 後 續 發 育, 第 二 個 轉 換 階 段 為 細 胞 緊 縮 (compaction), 此 階 段 胚 的 發 育 需 要 藉 由 細 胞 與 細 胞 間 的 相 互 作 用 使 克 進 行, 第 三 個 轉 換 階 段 則 位 於 桑 椹 胚 (morula) 期 進 入 囊 胚 期 (trophoblast); 第 一 階 段 有 別 於 其 他 兩 個 階 段, 其 對 於 胚 能 否 存 活 甚 具 關 鍵, 因 此 又 稱 為 哺 乳 動 物 早 期 胚 發 育 得 障 阻 期, 其 發 生 階 段 依 物 種 不 同, 以 豬 胚 為 例, 早 期 胚 存 活 之 關 鍵 為 4- 至 8- 細 胞 期 間 (Telford et al., 1990), 在 此 過 程 中, 除 特 定 轉 錄 因 子 的 數 量 活 性 外, 染 色 質 結 構 成 分 的 變 化 也 扮 演 關 鍵 性 的 角 色 鑑 於 H1Foo 與 體 細 胞 型 H1s 之 轉 換, 於 小 鼠 與 牛 等 物 種 中 洽 處 於 胚 原 性 與 母 源 性 基 因 轉 換 的 時 期, 且 吾 等 希 冀 能 更 深 入 探 討 豬 胚 細 胞 其 基 因 表 現 模 式 於 發 育 過 程 中 產 生 轉 換 的 調 控 機 制, 故 藉 由 本 研 究 室 取 得 之 ph1foo 之 全 長 序 列, 成 功 構 築 可 於 豬 心 血 管 內 皮 細 胞 (procine endothelial cells,pec) 內 單 獨 表 現 H1Foo 蛋 白 質 及 H1Foo 與 EGFP 融 合 蛋 白 之 載 體, 藉 此 探 討 H1Foo 之 表 現 對 於 一 般 體 細 胞 之 影 響 及 其 於 細 胞 內 表 現 之 位 置 2

6 材 料 與 方 法 生 發 泡 (germinal vesicle, GV) 階 段 之 豬 卵 母 細 胞 之 mrna 萃 取 將 數 目 約 50 顆 GV 階 段 之 豬 卵 母 細 胞 以 mrna 萃 取 套 組 處 理 (Dynabeads mrna DIRECT kit Invitrogen); 首 先 將 卵 母 細 胞 置 於 50 µl lysis/binding buffer 中 2 分 鐘,65 C, 後 續 將 含 有 細 胞 之 lysis/binding buffer 轉 移 至 乾 淨 之 微 量 離 心 管 中, 並 加 入 20 µl Dynabeads Oligo(dT)25 magnetic particles 溶 液, 於 室 溫 下 均 勻 混 合 約 5 分 鐘 後, 依 序 已 washing buffer A 及 washing buffer B 處 理 後, 以 100µL 10mM Tris-HCL 回 溶 mrna-bound magnetic particles cdna 末 端 快 速 擴 增 技 術 (rapid amplification of cdna end, RACE) 將 上 一 步 驟 所 得 之 mrna-bound magnetic particles 經 由 calf intestinal phosphatase 及 tobacco acid pyrophosphatase 處 理 後, 使 mrna 可 藉 由 T4 RNA ligase 與 GeneRacer kit(invitrogen) 中 之 GeneRacer RNA Oligo 做 連 結 後, 利 用 GeneRacer oligo dt primer 及 藉 由 已 知 的 基 因 序 列 所 設 計 的 5 端 (5 -CCTGATCAAGAGCAGCATCC) 和 3 端 (5 -GGGTCTTGTTGCCTTTTTGA) 之 引 子 進 行 實 驗, 藉 此 獲 得 基 因 全 長 序 列 之 5 端 和 3 端 之 序 列, 以 利 後 續 獲 得 基 因 全 長 序 列 利 用 RT-PCR 選 殖 豬 H1Foo cdna 以 RACE 所 得 之 實 驗 結 果, 設 計 出 預 測 可 夾 出 全 長 H1Foo 引 子,Forward, 5 -CTGGCAGCTTCAAATTGGTT;Reverse, 5 -CTAGTTCTTGGCCTCAGCCTCC, 並 以 GV- 階 段 之 卵 母 細 胞 萃 取 其 RNA, 以 此 RNA 為 模 板 進 行 RT-PCR, 藉 此 得 到 全 長 之 H1Foo 基 因 序 列 豬 心 血 管 內 皮 細 胞 (porcine endothelial cells, PEC) PEC 細 胞 為 豬 心 臟 主 動 脈 內 皮 細 胞, 係 由 本 實 驗 室 早 期 經 由 初 級 培 養 而 得 豬 主 動 脈 內 皮 細 胞 以 手 術 刀 輕 輕 刮 起, 置 於 含 有 collegenase 的 PBS 中, 置 於 37 培 養 5 分 鐘, 離 心 後 收 取 細 胞, 將 細 胞 培 養 於 含 10% FBS M199 培 養 基, 置 於 5% CO2 37 培 養 箱 培 養, 每 隔 一 天 繼 代 培 養 一 次 細 胞 轉 染 將 PEC 培 養 於 6 公 分 培 養 皿 中 至 八 分 滿, 以 適 量 體 積 之 M199 與 PolyJet 細 胞 轉 染 試 劑 混 合 均 勻 ; 另, 同 樣 以 適 量 體 積 之 M199 與 預 轉 染 之 質 體 混 合 均 勻, 再 將 已 混 合 好 之 PolyJet 細 胞 轉 染 試 劑 與 質 體 混 合 均 勻, 於 室 溫 下 靜 置 15 分 鐘 後, 加 入 細 胞 培 養 液 中, 於 37 C 恆 溫 培 養 箱 中 作 用 6 個 小 時, 將 培 養 液 更 換 為 含 有 10%FBS P/S 與 G418 之 M199 培 養 液, 以 利 後 續 可 篩 選 轉 染 成 功 之 細 胞 RNA 萃 取 分 別 萃 取 一 般 PEC 及 已 轉 染 pegfph1foo 之 PEC 的 RNA 首 先 取 1ml 的 Trizol 加 入 10 公 分 培 養 皿 中, 以 細 胞 刮 杓 將 貼 盤 之 細 胞 刮 起, 收 集 至 1.5ml 微 量 離 心 管 中, 加 入 200µl 的 氯 仿 並 劇 烈 搖 晃 混 合 後, 3

7 於 冰 上 靜 置 10 分 鐘, 於 4 C 以 12000xg 離 心 15 分 鐘, 取 上 清 液 另 置 於 1,5ml 微 量 離 心 管 中, 添 加 500µl 之 異 丙 醇 並 於 -20 C 靜 置 30 分 鐘 後, 於 4 C 以 15000xg 離 心 15 分 鐘, 去 除 上 清 液 後, 加 入 1ml 75% 酒 精, 於 4 C 以 7500xg 離 心 5 分 鐘, 去 除 上 清 液 後, 留 沉 澱 物 並 將 其 乾 燥, 加 入 25µl 去 核 酸 水 回 溶 後, 放 入 -80 C 備 用 Real time RT-PCR 於 微 管 中 加 入 10X RT Buffer 2µl dntp Mix 0.8µl(10mM) 10X RT Random Primer MultltiScribe Reverse Transcriptase 1.0µl dd water 6.2µl 及 RNA 10 µl 於 25 C 10 分 鐘,37 C 120 分 鐘 及 85 C 5 秒 鐘 於 微 管 中 加 入 TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2X) 10µl 前 端 引 子 1µl 後 端 引 子 1µl 模 板 2µl 及 dd water 於 95 C 10 分 鐘 95 C 15 秒 及 60 C 60 秒 鐘 進 行 40 次 循 環 (Step one Real time PCR system, AB Applied Biosystem) H1Foo 基 因 5 端 調 節 區 報 導 基 因 之 質 體 建 構 豬 隻 H1Foo 基 因 5 端 調 節 區 的 DNA 經 PCR 擴 增 之 產 物 為 1500 bp, DNA 定 序 後 以 電 腦 分 析 軟 體 分 析 cis acting elements 的 位 置, 並 根 據 所 得 重 要 cis acting elements 的 位 置 設 計 引 子, 進 行 PCR 反 應, 以 得 到 1500 及 888 bp 長 短 不 等 之 豬 隻 H1Foo 5 調 節 區 DNA 片 段, 再 將 此 片 段 構 築 於 報 導 質 體 構 築 報 導 質 體 方 法 簡 述 如 下 : 將 商 業 用 表 現 載 體 pgl3-basic 原 有 之 luciferase 報 導 基 因 置 換 成 綠 色 螢 光 蛋 白 報 導 基 因 (GFP), 取 經 限 制 酵 素 處 理 過 之 5 端 調 節 區 的 DNA 與 載 體, 加 入 5 µl 之 2 X ligase buffer, 1 µl T4 DNA ligase(3 U/µl), 加 入 滅 菌 水 至 10 µl, 均 勻 混 合 後, 置 於 4 C 反 應 過 夜 ; 第 2 天 轉 形 至 DH5-α 勝 任 細 胞, 抽 出 質 體, 並 加 以 定 序, 以 確 定 片 段 是 否 正 確 Microinjection DNA 制 備 將 1500 及 888 bp 長 短 不 等 之 豬 隻 H1Foo 5 調 節 區 報 導 基 因 載 體 以 適 當 限 制 酶 酵 素 剪 切 後, 將 其 產 物 以 洋 菜 膠 電 泳 方 式 將 目 標 核 酸 片 段 與 載 體 上 其 他 核 酸 片 段 分 離 後, 將 目 標 核 酸 片 段 連 同 洋 菜 膠 一 同 截 切, 以 膠 上 純 化 之 套 組 回 收 洋 菜 膠 內 目 標 DNA 片 段 後 續 將 此 片 段 進 行 氯 化 銫 密 度 梯 度 超 高 速 離 心, 以 提 高 目 標 核 酸 之 純 度 純 化 後 之 目 標 DNA 回 溶 於 microinjection buffer 中, 放 於 -20 冰 箱 備 用 小 鼠 胚 之 收 集 取 約 6 周 齡 的 ICR 母 鼠 注 射 孕 馬 血 清 激 性 腺 素 (pregnant mare s serum gonadotropin, PMSG), 42~48 小 時 後 注 射 人 類 絨 毛 膜 激 性 腺 素 (human chorionic gonadotropin, HCG), 並 將 其 與 公 鼠 進 行 配 種 配 種 後 隔 天 早 上, 若 在 母 鼠 陰 道 內 發 現 由 公 鼠 精 液 之 膠 質 所 形 成 之 陰 道 栓, 即 可 判 定 母 鼠 已 被 公 鼠 配 上 ; 此 時 將 配 上 之 母 鼠 犧 牲 後, 即 可 由 其 輸 卵 管 得 到 顯 微 注 射 時 須 用 到 之 原 核 期 的 胚 胎 基 因 顯 微 注 射 4

8 將 溶 於 injection buffer 中 之 目 標 核 酸 片 段 注 射 入 原 核 期 的 胚 胎 中, 使 其 有 機 會 鑲 嵌 進 胚 胎 中 原 有 的 基 因 體 序 列 中 結 果 與 討 論 ph1foo 基 因 結 構 藉 由 5'-cDNA 末 端 快 速 擴 增 (rapid amplification of cdna end, 5'-RACE) 技 術, 針 對 源 自 生 發 泡 (germinal vesicle, GV) 階 段 之 豬 卵 母 細 胞 之 總 RNA 樣 品, 透 過 RNA 連 接 酶 仲 介 (RNA ligase mediate, RLM) 策 略, 再 參 考 本 研 究 團 隊 先 前 業 經 建 立 豬 早 期 胚 表 現 序 列 標 籤 序 列 庫 之 資 訊, 完 成 設 計 豬 之 H1Foo (ph1foo) 序 列 之 反 向 引 子, 並 依 其 RNA 寡 核 苷 酸 序 列 設 計 正 向 引 子, 經 由 反 轉 錄 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (RT-PCR) 初 步 獲 得 ph1foo 之 cdna 產 物, 再 經 TA cloning 及 定 序, 成 功 選 殖 獲 得 ph1foo 之 5' 端 序 列 ( 圖 一 圖 二 ), 最 後 在 依 據 ph1foo 之 5'- 及 3'- 端 序 列 設 計 引 子, 透 過 RT-PCR 成 功 獲 得 兩 種 不 同 長 度 (1170 bp 及 1215 bp) 之 ph1foo 完 整 cdna, 經 基 因 結 構 分 析 與 定 序 結 果, 證 明 該 二 不 同 長 度 之 ph1foo cdna 產 物, 乃 基 因 轉 錄 後 不 同 選 擇 性 剪 接 (alternative splicing) 所 使 然 ( 圖 三 ) 此 外,pH1Foo 的 胺 基 酸 長 度 與 已 發 表 之 ph1foo 相 比 顯 示 本 研 究 中 所 得 之 胺 基 酸 序 列 較 原 已 知 之 序 列 多 五 個 胺 基 酸, 此 五 個 胺 基 酸 位 於 蛋 白 質 N 端, 與 其 他 動 物 H1Foo 胺 基 酸 序 列 相 比 顯 示 豬 ph1foo 和 其 他 物 種 ( 人 鼠 牛 ) 的 H1Foo 有 很 大 的 差 異 性 ( 表 一 ) ph1foo 蛋 白 質 在 細 胞 的 表 現 將 在 研 究 計 畫 中 所 得 之 H1Foo cdna 基 因 片 段 以 PCR 之 方 式 放 大 並 將 其 放 入 可 在 真 核 生 物 中 表 現 外 來 蛋 白 質 的 pegfp 質 體 中 ( 圖 四 ), 其 中 具 有 H1Foo 基 因 片 段 並 含 有 終 止 密 碼 的 在 質 體 建 構 完 成 後, 稱 為 pegfph1foo, 此 質 體 於 宿 主 細 胞 中 僅 可 表 現 H1Foo 蛋 白 質 另 一 質 體 的 建 構 則 是 將 H1Foo 基 因 片 段 的 終 止 密 碼 去 除, 質 體 建 構 完 成 後 稱 為 pegfph1foo-2, 此 質 體 可 在 細 胞 中 表 現 出 H1Foo 蛋 白 與 綠 色 螢 光 蛋 白 之 融 合 蛋 白 ( 圖 五 ) 將 pegfph1foo-2 轉 染 至 PEC 中, 以 螢 光 顯 微 鏡 觀 察, 結 果 顯 示 H1Foo 蛋 白 與 綠 色 螢 光 蛋 白 之 融 合 蛋 白 出 現 在 細 胞 核 中, 反 之, 轉 染 pegfp 之 PEC 不 僅 可 在 細 胞 核 內 且 細 胞 質 也 可 觀 察 到 綠 色 螢 光 蛋 白 此 結 果 顯 示 ph1foo 蛋 白 和 其 他 組 蛋 白 (histone) 一 樣 只 存 在 於 細 胞 核 ( 圖 七 ), 與 細 胞 核 中 DNA 結 合 此 外, 進 一 步 以 共 軛 焦 顯 微 鏡 觀 察, 顯 示 代 表 H1Foo 蛋 白 質 的 綠 色 螢 光 在 細 胞 核 的 分 布 與 DAPI 染 色 分 布 完 全 一 致 ( 圖 八 ), 顯 示 H1Foo 蛋 白 質 在 細 胞 核 中 直 接 與 DNA 結 合 表 現 ph1foo 蛋 白 質 對 豬 內 皮 細 胞 (PEC) 基 因 表 現 的 影 響 以 未 轉 染 PEC 為 對 照 組, 轉 染 pegfph1foo 並 經 過 G418 抗 生 素 篩 選 過 後 之 PEC 為 處 理 組, 以 Real-time PCR 分 析 oct4,sox2,nanog,c-myc 等 基 因 的 表 現 量 分 析 結 果 顯 示, 處 理 組 其 oct4 表 現 量 約 為 對 照 組 的 1.5 倍,sox2 為 7 倍,nanog 將 近 30 倍,c-myc 則 為 4 倍 ( 圖 六 ) 前 人 研 究 報 告 指 出 轉 染 此 四 個 5

9 基 因 於 成 熟 體 細 胞 可 誘 發 細 胞 reprograming 而 成 為 誘 發 性 多 能 幹 細 胞 (ipsc), 因 此 H1foo 蛋 白 質 基 因 的 表 現 可 能 和 DNA remodeling 有 關 進 而 影 響 到 細 胞 的 reprograming ph1foo 基 因 5 端 調 節 區 報 導 基 因 在 小 鼠 胚 之 表 現 分 別 以 1500 bp 及 888 bp ph1foo 基 因 5 端 調 節 區 報 導 基 因 以 顯 微 注 射 的 方 式 打 入 一 細 胞 期 的 小 鼠 胚, 探 討 H1Foo 基 因 在 不 同 胚 時 期 的 表 現 實 驗 結 果 顯 示 不 論 是 1500 bp 或 888 bp ph1foo 基 因 5 端 調 節 區 均 無 法 在 鼠 胚 中 誘 發 報 導 基 因 的 表 現 ( 圖 九 ), 此 結 果 顯 示 H1Foo 基 因 調 節 在 不 同 物 種 中 有 很 大 的 不 同 結 論 本 研 究 成 功 藉 cdna 末 端 快 速 擴 增 技 術 獲 得 正 確 之 豬 H1Foo 基 因 序 列, 並 發 現 H1Foo 蛋 白 質 比 其 他 文 獻 報 導 多 五 個 胺 基 酸 在 PEC 內 表 現 H1Foo 蛋 白 質 顯 示 可 影 響 oct4,sox2,nanog 及 c-myc 等 幹 細 胞 reprograming 相 關 基 因 之 表 現 量 而 以 H1Foo 及 綠 色 螢 光 蛋 白 之 融 合 蛋 白 顯 示 H1Foo 蛋 白 質 表 現 於 細 胞 核 中 ; 另, 利 用 胚 顯 微 注 射 技 術, 注 入 有 H1Foo 不 同 片 段 長 度 之 啟 動 子 序 列 報 導 基 因 之 小 鼠 胚, 觀 察 報 導 基 因 在 早 期 小 鼠 胚 胎 發 育 期 的 調 控, 結 果 顯 示 不 同 物 種 此 基 因 調 控 機 制 不 同 計 畫 成 果 自 評 本 研 究 順 利 完 成 豬 隻 H1Foo 基 因 的 選 殖 及 功 能 探 討, 將 有 助 於 了 解 豬 胚 中 此 基 因 表 現 調 節 及 功 能 的, 符 合 預 期 參 考 文 獻 [1] Baake, M, M Bäuerle, D Doenecke, and W Albig Core histones and linker histones are imported into the nucleus by different pathways. Eur. J. Cell Biol. 80: [2] Wiśniewski, JR, A Zougman, S Krüger, and M Mann Mass spectrometric mapping of linker histone H1 variants reveals multiple acetylations, methylations, and phosphorylation as well as differences between cell culture and tissue. Mol. Cell Proteomics 6: [3] Tanaka, M, JD Hennebold, J Macfarlane, and EY Adashi A mammalian oocyte-specific linker histone gene H1oo: homology with the genes for the oocyte-specific cleavage stage histone (cs-h1) of sea urchin and the B4/H1M histone of the frog. Development 128: [4] Tanaka, Y, S Kato, M Tanaka, N Kuji, and Y Yoshimura Structure and expression of the human oocyte-specific histone H1 gene elucidated by direct RT-nested PCR of a single oocyte. Biochem Biophys Res. Commun. 304: [5] McGraw, S, C Vigneault, K Tremblay, and MA Sirard Characterization of linker histone H1FOO during bovine in vitro embryo development. Mol. Reprod. Dev. 73:

10 [6] Fan, Y., T. Nikitina, E.M. Morin-Kensicki, J. Zhao, T.R. Magnuson, C.L. Woodcock, and A.I. Skoultchi H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell. Biol. 23: [7] Teranishi, T, M Tanaka, S Kimoto, Y Ono, K Miyakoshi, T Kono, and Y Yoshimura Rapid replacement of somatic linker histones with the oocyte-specific linker histone H1foo. Dev. Biol. 266: [8] Telford, N.A., A.J. Watson, and G.A. Schultz Transition frommaternal to embryonic control in early mammalian development: A comparison of several species. Mol. Reprod. Dev. 26:

11 圖 一 5'-cDNA 末 端 快 速 擴 增 H1Foo 結 果 圖 二 5'-cDNA 末 端 快 速 擴 增 之 正 確 性 確 認 8

12 圖 三 H1Foo 於 不 同 物 種 之 基 因 組 分 佈 圖 表 一 ph1foo 蛋 白 質 以 二 序 列 比 對 (pairwise sequence alignment) 所 得 之 結 果 9

13 圖 四 分 別 以 本 實 驗 與 GeneBank 所 預 測 之 pig H1Foo 全 長 序 列 所 設 計 之 引 子 測 試 GV 階 段 卵 母 細 胞 所 表 現 之 H1Foo 基 因,Mr, 100 bp DNA marker;1, pig β-actin;2, 本 實 驗 所 預 測 之 H1Foo 全 長 序 列 ; 3,GenBank (XM_ ) 所 預 測 之 全 長 序 列 圖 五 pegfph1foo 與 pegfph1foo-2 之 質 體 構 圖 (A) pegfph1foo, 其 可 於 真 核 細 胞 內 表 現 H1Foo 蛋 白 質,(B) pegfph1foo-2, 其 可 於 真 核 細 胞 內 表 現 H1Foo 與 EGFP 融 合 蛋 白 10

14 圖六 PEC 與轉染 pegfph1foo 後 PEC 其 oct4 sox2 nanog 及 c-myc 等基因之表現量比較 圖七 pegfph1foo-2及pegfp分別轉染至pec內並於uv顯微鏡光下觀察 (A)PEC 轉染 pegfph1foo-2 (B) PEC 轉染 pegfp 11

15 A B C 圖八 pegfph1foo-2 轉染至 PEC 內並以共軛焦顯微鏡觀察 A: pegfph1foo-2 轉染至 PEC B: DAPI 染色圖 C: A 圖及 B 圖重疊照 12

16 A B 圖九 ph1foo 基因 5 端調節區 GFP 報導基因在小鼠胚之表現 A: 含 1500 bp ph1foo 基因 5 端調節區 GFP 報導基因在小鼠胚之表現 左圖 明視鏡 右圖 螢光鏡 B: 含 800 bp ph1foo 基因 5 端調節區 GFP 報導基因在小鼠胚之表現 左圖 明視鏡 右圖 螢光鏡 13