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衡硕严
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1 1388 生物工程学报 Chinese Journal of Biotechnology 生物技术与方法 November 25, 2012, 28(11): Chin J Biotech, All rights reserved 核酸酶 P1 的原核表达纯化及酶学特性分析王亚楠 1, 魏爱云 1, 王美艳 1, 卫晓彬 1, 张超 1, 单丽伟 2, 范三红 1 1 西北农林科技大学生命科学学院, 陕西杨凌西北农林科技大学理学院, 陕西杨凌王亚楠, 魏爱云, 王美艳, 等. 核酸酶 P1 的原核表达纯化及酶学特性分析. 生物工程学报, 2012, 28(11): Wang YN, Wei AY, Wang MY, et al. Prokaryotic expression, purification and enzymatic properties of nuclease P1. Chin J Biotech, 2012, 28(11): 摘要 : 为了建立一种核酸酶 P1 (Nuclease P1,NP1) 的原核表达纯化系统, 首先采用重叠延伸 PCR 将 22 段寡核苷酸拼接, 获得人工合成的 NP1 基因将其克隆至分泌型表达载体 pmal-p4x 获得重组质粒 pmal-p4x-np1, 然后将重组载体转化 T7 Express 和 Origami B(DE3) 菌株诱导表达, 利用 Amylose 亲和层析柱纯化获得重组蛋白, 并对其活性热稳定性和金属离子依赖性进行系统分析 SDS-PAGE 结果显示, 重组蛋白 MBP-NP1 (Maltose binding protein-np1) 在 T7 Express 和 Origami B(DE3) 菌株中均可表达, 且以可溶性形式存在活性检测表明 Origami B(DE3) 菌株中获得的重组蛋白活性高于 T7 Express 菌株 (75.48 U/mg : U/mg); 利用蛋白酶 Factor Xa 切除 MBP 标签后, 两种重组蛋白的比活力均有提高, 分别为 U/mg 和 U/mg 重组 NP1 表现出良好的热稳定性,80 温浴 30 min 后重组酶仍具有 90% 以上的活力 2.0 mmol/l Zn 2+ 对 NP1 有比较明显的激活作用, 相同浓度的 Cu 2+ 则对该酶有强烈的抑制作用该研究实现了 NP1 在大肠杆菌系统中的功能性表达, 为 NP1 纯酶的制备提供一个替代途径关键词 : 核酸酶 P1, 原核表达, 亲和纯化, 热稳定性 Received: April 18, 2012; Accepted: May 17, 2012 Supported by: Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. QN ). Corresponding author: Sanhong Fan. Tel/Fax: ; shfan@nwsuaf.edu.cn 中央高校基本科研业务费专项 (No. QN ) 资助

2 1389 Prokaryotic expression, purification and enzymatic properties of nuclease P1 Yanan Wang 1, Aiyun Wei 1, Meiyan Wang 1, Xiaobin Wei 1, Chao Zhang 1, Liwei Shan 2, and Sanhong Fan 1 1 College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling , Shaanxi, China 2 College of Science, Northwest A&F University, Yangling , Shaanxi, China Abstract: To establish a prokaryotic expression and purification protocol for nuclease P1 (NP1), we first obtained a synthetic NP1 by splicing 22 oligonucleotides with overlapping PCR. We constructed and transformed a secretory expression vector pmal-p4x-np1 into Escherichia coli host strains T7 Express and Origami B (DE3) separately. Then, the recombinant NP1 was purified by amylose affinity chromatography, and its activity, thermo-stability and metal-ion dependence were investigated systematically. The results indicated that the expressed fusion proteins MBP-NP1 (Maltose binding protein-np1) existed mainly in soluble form both in host strains T7 Express and Origami B (DE3), but the specific activity of recombinant protein from Origami B(DE3) strain was higher than T7 Express strain (75.48 U/mg : U/mg). When the MBP-tag was cleaved by protease Factor Xa, the specific activity both increased up to U/mg and U/mg. The thermal inactivation experiments demonstrated that the recombinant NP1 was quite stable, and it retained more than 90% of original activity after incubated for 30 min at 80 C. Zn 2+ (2.0 mmol/l) could increase enzyme activity (to 119.1%), on the contrary, the enzyme activity was reduced by 2.0 mmol/l Cu 2+ (to 63.12%). This research realized the functional expression of NP1 in the prokaryotic system for the first time, and provided an alternative pathway for NP1 preparation. Keywords: nuclease P1, prokaryotic expression, affinity purification, thermo-stability 核酸酶 P1 (Nuclease P1,NP1,EC ) 是一种非特异性的分解单链 RNA 和 DNA 的核酸酶 1961 年日本科学家 Kuninaka 等首次从桔青霉 Penicillium citrinum T. 中分离获得 [1] NP1 是由 270 个氨基酸残基组成的糖蛋白, 分子内包含两个二硫键 (Cys72-Cys217 和 Cys80-Cys85), 分子表面有 4 个 N- 糖基化位点 (Asn92,Asn138, Asn184 和 Asn197) [2-3] 1991 年 Volbeda 等用 X 射线衍射法获得了分辨率为 2.8 Å 的 NP1 晶体结构 [4] ;1998 年 Romier 等获得了分辨率为 1.8 Å 的 NP1 与底物类似物复合体的晶体结构 [5] 分析表明,NP1 的催化中心处于一个裂隙中, 包含 3 个参与催化的锌离子催化中心两侧存在两个疏水性口袋样结构, 直接参与单链核酸中核苷酸的识别和结合其金属离子结合区域的三维结构同蜡样芽胞杆菌 Bacillus cereus F. 的磷脂酶 C (Phospholipase C,PLC) 非常相似 [4] NP1 与米曲霉 Aspergillus oryzae C. 的 Nuclease S1 同源, 序列一致性为 49.3%, 它们同属 S1-P1 Nuclease 蛋白家族 [3-4,6] ;pfam 数据库中 S1-P1 Nuclease 家族目前有 482 个成员, 它们来自 240 种不同的真菌植物原生生物细菌和病毒等 NP1 具有磷酸二酯酶和磷酸单酯酶活性 [7-9], 能将单链的 RNA 分解为 5 - 单核苷酸 [9], 而 5 - 单核苷酸及其衍生物在医药和食品领域应用广泛在生物医药方面,5 -AMP 类似物 2 -C-methyladenosine 和 7-Deaza-2 -C-methyl-adenosine 5 -GMP 类似物 2 -C-methyl-guanosine 在体外能 cjb@im.ac.cn

3 1390 ISSN CN /Q Chin J Biotech November 25, 2012 Vol.28 No.11 强烈抑制丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus) RNA 的复制 [10] ;5 -CMP 可用于制造胞二磷胆碱 CTP 阿糖胞苷聚肌胞等生化药物 5 - 单核苷酸衍生的抗病毒和抗癌药物已成功用于疾病的治疗 [11-12] 在食品工业方面,5 -IMP 和 5 -GMP 是典型的鲜味成分 [13] 添加 5 -IMP 可使食品具有肉类的鲜味, 添加 5 -GMP 可使食品产生蔬菜香菇的鲜味 5 - 核苷酸的生产目前主要依赖于酶解法, 因而 NP1 的需求量日益增加 NP1 在核酸研究中的应用也日益广泛, 主要应用于 :1) 核酸结构研究和碱基组成分析, 包括 RNA 序列分析和 trna 结构分析 [14-16] ;2) 蛋白纯化过程中核酸的去除 [17] ;3) DNA 损伤分析 [18-19] 近年来 NP1 在 trna 依赖的氨基酸生物合成和转酰胺作用 [20] 芳香/ 杂环致癌物性 DNA 加合物的分离 [21] UVA 照射和补骨脂素引起的 DNA 链间交联的定量测定 [22] DNA 脱氨基作用研究中 2 -XMP 的测定等方面的研究中也发挥了关键性作用 [23] 目前工业和研究领域所使用的 NP1 均通过桔青霉 P. citrinum 发酵制备, 工业用酶对纯度要求较低, 而研究用酶需要高纯度, 需经热变性超滤离子交换层析等多步骤纯化获得本研究 pmal-p4x 快速连接酶 Quick Ligase 聚合酶 Deep Vent DNA Polymerase 限制性内切酶 EcoRⅠ 和 PstⅠ 蛋白酶 Factor Xa Amylose Resin 购自 NEB 公司 ; 质粒 DNA 小量提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自 Axygen 公司 ;Taq DNA Polymerase 购自北京康为世纪公司 ; 酵母 trna 购自 Invitrogen 公司 ; 其他试剂均为进口或国产分析纯 1.2 方法 NP1 基因的合成依据 GenBank 中 NP1 氨基酸序列 (GenBank Accession No. AAB19975), 设计 p1~p22 共 22 段寡核苷酸 ( 表 1), 片段 p1 包含 EcoRⅠ 酶切位点, 相邻片段之间两两部分互补采用重叠延伸 PCR, 通过两轮扩增获得 NP1 基因 ( 图 1) 第一轮 PCR 过程为 : 以 p2~p7 为模板, 以 p1 和 p8 为引物扩增获得 P1 片段 ; 以 p8~p21 为模板, 以 p7 和 p22 为引物扩增获得 P2 片段第二轮 PCR 过程为 : 以 P1 和 P2 片段为模板, 以 p1 和 p22 为引物扩增获得 NP1 基因 PCR 反应程序均为 :94 预变性 2 min;94 1 min,55 1 min,72 1 min,30 个循环 ;72 延伸 7 min 采用基因工程手段将人工合成的 NP1 基因导入大肠杆菌, 并利用亲和纯化获得具有稳定酶活性的重组 NP1, 为研究用高纯度 NP1 的获得提供了一个新的来源 1 材料与方法 1.1 材料大肠杆菌菌株 Turbo T7 Express Origami B(DE3) 为本实验室保存 ; 分泌表达载体图 1 NP1 基因拼接示意图 Fig. 1 Schematic diagram of splicing process of NP1. Dashed arrows represented primers for fragment P1, P2 and NP1.

4 pmal-p4x-np1 载体的构建以重叠延伸 PCR 获得的 NP1 基因片段为模板, 以 p1 NP1-Pst I-R 为引物 ( 表 1) 扩增获得两侧分别包含 EcoRⅠ 和 PstⅠ 切点的 NP1 片段 PCR 产物胶回收后采用 EcoRⅠ 和 PstⅠ 双酶切, 目的片段与同样双酶切的 pmal-p4x 载体连接, 连接产物转化 E. coli Turbo 菌株, 挑取单克隆进行 PCR 和质粒酶切鉴定, 鉴定正确的质粒送生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司测序确证重组 NP1 酶活力的检测将 100 μl 底物溶液 (50 μl 5 g/l RNA 溶液 50 μl 0.03 mol/l ph 5.3 醋酸钠缓冲液 ( 含表 1 用于 NP1 基因合成的寡核苷酸序列 Table 1 Sequence of oligonucleotides for NP1 gene synthesis Oligonucleotide name p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 p9 p10 p11 p12 p13 p14 p15 p16 p17 p18 p19 p20 p21 p22 NP1-Pst I-R Oligonucleotide sequence (5 3 ) TTCAGAATTCGCTGGTTGGGGTGCTTTGGGTCATGCTACTGTTGCTTACGTTGCTCAAC TACCTTGAGCCCAAGAAGCAGCTTCTGGAGAAACGTAATGTTGAGCAACGTAAGCAACA CTGCTTCTTGGGCTCAAGGTATTTTGGGTTCTTCTTCTTCTTCTTACTTGGCTTCTATTG ACCAGCAGAAGTCAATCTGTATTCATCAGCCCAAGAAGCAATAGAAGCCAAGTAAGAAGA ACAGATTGACTTCTGCTGGTAAGTGGTCTGCTTCTTTGCATTTTATTGATGCTGAAGATA ATCTCTTTCGTAATCAACGTTACAGTTAGTTGGTGGGTTATCTTCAGCATCAATAAAATG ACGTTGATTACGAAAGAGATTGTGGTTCTTCTGGTTGTTCTATTTCTGCTATTGCTAACT TCAGAAGACAAAGAAGAATCAGAAACTCTTTGAGTGTAGTTAGCAATAGCAGAAATAG GATTCTTCTTTGTCTTCTGAAAACCATGCTGAGGCTTTGAGATTTTTGGTTCATTTTAT GCGTAAGCCTCATCATGCAATGGTTGAGTCATATCACCAATAAAATGAACCAAAAATCTC GCATGATGAGGCTTACGCTGTTGGTGGTAACAAGATTAACGTTACTTTTGATGGTTACCA TTGTGGCATGTAAGTATCCCAATCAGAATGCAAGTTATCATGGTAACCATCAAAAGTAAC GGGATACTTACATGCCACAAAAGTTGATTGGTGGTCATGCTTTGTCTGATGCTGAATCTT AGTTACCAGATTCAATGTTTTGAACCAAAGTCTTAGCCCAAGATTCAGCATCAGACAAAG CAAAACATTGAATCTGGTAACTACACTGCTCAAGCTATTGGTTGGATTAAGGGTGATAAC CAGAAGCCCATCTAGTAGCAGTAGTAATTGGTTCAGAAATGTTATCACCCTTAATCCAAC GCTACTAGATGGGCTTCTGATGCTAACGCTTTGGTTTGTACTGTTGTTATGCCACATGGT AGTAAGTTGGGTACAAATCACCAGTTTGCAAAGCAGCAGCACCATGTGGCATAACAACAG GATTTGTACCCAACTTACTACGATTCTGTTATTGATACTATTGAATTGCAAATTGCTAAG GAATTTCGTTAATCCAGTTAGCCAATCTGTAACCACCCTTAGCAATTTGCAATTCAATAG GGCTAACTGGATTAACGAAATTCATGGTTCTGAAATTGCTAAGGCTGGTCATCATCATC GAGTGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGACCAGCCTTAGC AAAACTGCAGTTAACCAGCCTTAGCAA Note: the underlined bases in p1, NP1-Pst I-R represent EcoR I and Pst I cutting site respectively. cjb@im.ac.cn

1392 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech November 25, 2012 Vol.28 No.

4 重组蛋白表达与纯化将重组载体 pmal-p4x-np1 转化 TSS- 法制备的 T7 Express 和 Origami B(DE3) 感受态细胞 [25] 挑选单克隆, 分别接种于 LB 和胰蛋白胨 - 磷酸盐培养基中 [26],28 和 20 诱导表达 8 h 后离心收集菌体, 超声波破碎后离心收集上清, 定量测定上清的比活力将诱导温度设定为 20,IPTG 终浓度设定为 0.

5 1392 ISSN CN /Q Chin J Biotech November 25, 2012 Vol.28 No mmol/l ZnSO 4 )) 与 25 μl 酶液混匀,70 温浴 15 min, 加入 250 μl 核酸沉淀剂, 冰浴 20 min 后 r/min 离心 10 min, 用双蒸水将上清液稀释合适倍数测定 OD 260 值以不加酶液的反应液作为对照在上述条件下每分钟生成的核苷酸量在 260 nm 处的吸光值差值为 1.0 时定义为一个酶活力单位 [24] 重组蛋白表达与纯化将重组载体 pmal-p4x-np1 转化 TSS- 法制备的 T7 Express 和 Origami B(DE3) 感受态细胞 [25] 挑选单克隆, 分别接种于 LB 和胰蛋白胨 - 磷酸盐培养基中 [26],28 和 20 诱导表达 8 h 后离心收集菌体, 超声波破碎后离心收集上清, 定量测定上清的比活力将诱导温度设定为 20,IPTG 终浓度设定为 0.5 mmol/l, 分析不同诱导时间点 (2 h 4 h 6 h 8 h 10 h) 酶活性的变化, 从而确定最佳诱导时间设定诱导温度为 20, 诱导时间为 8 h, 分析不同浓度 IPTG 别于和 100 中保温 30 min, 残余酶活力测定参考 1.2.3, 将最高酶活力设为 100% 将终浓度为 2.0 mmol/l 不同金属离子 (Zn 2+ Co 2+ Cu 2+ Ni 2+ Mg 2+ Fe 2+ Mn 2+ 和 Ca 2+ ) 与重组蛋白混合,25 保温 30 min 后, 残余酶活力测定参考 1.2.3, 将不外加金属离子时的酶活力设置为 100% 2 结果 2.1 NP1 的人工合成采用两轮重叠延伸 PCR 拼接获得 NP1 基因第一轮中, 重叠延伸扩增 p1~p8 获得大小约 320 bp 的目标片段 P1 ( 图 2 中第 1 泳道 ), 扩增 p7~p22 获得大小约 620 bp 的目标片段 P2 ( 图 2 中第 2 泳道 ) 以片段 P1 和 P2 为模板进行第二轮扩增获得 850 bp NP1 基因片段 ( 图 2 中第 3 泳道 ), 与预期结果一致 ( mmol/l) 对酶活性的影响, 从而确定最佳 IPTG 诱导浓度在确定的最佳条件下进行诱导表达, 收集菌体后超声裂解, 上清载入 Amylose 柱进行亲和层析分离, 具体步骤参照唐如春等的方法 [27] 使用考马斯亮蓝 G250 法对纯化获得的融合蛋白进行定量, 按照 50:1 的比例将融合蛋白和蛋白酶 Factor Xa 混合,4 过夜酶切去除 MBP 标签采用 15% SDS-PAGE 对总蛋白可溶性蛋白纯化后的融合蛋白及酶切去除 MBP 标签的目标蛋白进行电泳检测重组 NP1 的热稳定性和离子依赖性检测测定重组 NP1 的热稳定性时, 将重组蛋白分图 2 重叠延伸 PCR 产物的电泳检测 Fig. 2 Products of overlaping PCR by agarose gel electrophoresis. M: 2-log DNA ladder; 1: amplified fragment P1; 2: amplified fragment P2; 3: amplified fragment NP1.

Xa 识别位点编码序列 2.3 NP1 融合蛋白表达条件的优化重组载体转化 T7 Express 和 Origami B(DE3) 菌株诱导表达 (28 和 20,IPTG 终浓度为 0.5 mmol/l) 28 诱导获得的融合蛋白 MBP-NP1 未检测到酶活性 ; 而 20 获得的重组蛋白有活性温度为 20 IPTG 终浓度为 0.

6 pmal-p4x-np1 载体的构建获得的 NP1 片段经 EcoRⅠ 和 PstⅠ 双酶切, 然后与同样双酶切处理的 pmal-p4x 载体连接, 获得重组载体 pmal-p4x-np1 ( 图 3A) 重组载体经 EcoRⅠ 和 PstⅠ 双酶切出现了预期目的片段 ( 图 3B) 在该载体中,NP1 上游融合有分泌型麦芽糖结合蛋白 (MBP) 编码区, 两者之间为蛋白酶 Factor Xa 识别位点编码序列 2.3 NP1 融合蛋白表达条件的优化重组载体转化 T7 Express 和 Origami B(DE3) 菌株诱导表达 (28 和 20,IPTG 终浓度为 0.5 mmol/l) 28 诱导获得的融合蛋白 MBP-NP1 未检测到酶活性 ; 而 20 获得的重组蛋白有活性温度为 20 IPTG 终浓度为 0.5 mmol/l 时,T7 Express 菌株的最佳诱导时间为 8 h,origami B(DE3) 菌株的最佳诱导时间为 4 h ( 图 4A) 温度为 20, 诱导时间分别为 8 h 和 4 h,t7 Express 菌株和 Origami B(DE3) 菌株最佳 IPTG 诱导浓度均为 0.75 mmol/l ( 图 4B) 图 3 pmal-p4x-np1 重组载体示意图及双酶切鉴定 Fig. 3 Schematic diagram and double digestion of recombinant plasmid pmal-p4x-np1. (A) Schematic diagram of pmal-p4x-np1. (B) Identification of recombinant plasmid pmal-p4x-np1 by double digestion. M: 2-log DNA ladder; 1: pmal-p4x-np1 digested with EcoRⅠand PstⅠ. 图 4 Fig. 4 不同诱导时间和 IPTG 浓度对酶活性的影响 Effect of time and IPTG concentration on the enzymatic activity. (A) Time. (B) IPTG. cjb@im.ac.cn

1394 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech November 25, 2012 Vol.28 No.11 2.

7 1394 ISSN CN /Q Chin J Biotech November 25, 2012 Vol.28 No MBP-NP1 融合蛋白的纯化与酶活测定将收集的菌体超声波破碎后离心, 上清液用 Amylose 亲和层析柱纯化融合蛋白 MBP-NP1 ( 分子量约为为 71 kda, 其中 NP1 为 29 kda, MBP 为 42 kda) 在 T7 Express ( 图 5A) 和 Origami B(DE3) 菌株中 ( 图 5B) 都得到表达, 且均以可溶性形式存在 ; 蛋白酶 Factor Xa 酶切融合蛋白去除 MBP 标签后获得 NP1 酶活性定量检测发现由 T7 Express 和 Origami B(DE3) 菌株获得的 MBP-NP1 融合蛋白具有一定酶活性 ; 酶切去除 MBP 标签后比活力均有增加, 分别为 U/mg 和 U/mg ( 表 2) Ying 等通过热变性超滤硫酸铵沉淀苯基琼脂糖凝胶层析离子交换层析和葡聚糖凝胶层析从 1 L 桔青霉 P. citrinum 发酵液中分离获得 1.5 mg 天然 NP1, 其比活力为 U/mg [28] 本研究获得的重组 NP1 的比活力约为天然 NP1 的 1/5; 但由于采用了亲和层析, 大幅简化了纯化流程, 两种菌株中融合蛋白的纯化效率分别可达 9.65 mg/l 和 6.30 mg/l 2.5 重组 NP1 的热稳定性由图 6 可以看出, 重组酶在 55 ~80 范围内保持了较高的残余酶活力,80 温浴 30 min 后保持 90% 以上的残余酶活力随着温度的继续升高残余酶活力明显下降因此重组 NP1 与天然酶类似, 在 55 ~80 范围内具有较好的热稳定性图 5 重组蛋白 NP1 表达及纯化的 SDS-PAGE 分析 Fig. 5 SPS-PAGE analysis of recombinant protein NP1. (A) Purification of the recombinant protein from T7 Express strain. (B) Purification of the recombinant protein from Origami B(DE3) strain. M: prestained protein marker; 1: un-induced control; 2: total protein induced with IPTG; 3: soluble protein induced with IPTG; 4: recombinant protein purified by amylose column; 5: recombinant protein cleaved by Factor Xa. 表 2 重组蛋白和天然 NP1 的酶活力比较 Table 2 Comparison of specific activity of recombinant protein and native NP1 Protein Vectors Strains Activity (U/mL) Protein (g/l) Specific activity (U/mg) MBP-NP1 pmal-p4x T7 Express 33.50± ±0.21 NP1 (cleaved) pmal-p4x T7 Express 40.37± ±0.27 MBP-NP1 pmal-p4x Origami B(DE3) 31.70± ±0.06 NP1 (cleaved) pmal-p4x Origami B(DE3) 49.04± ±3.71 NP1 (native) / P. citrinum / / [28]

1395 2.6 重组 NP1 的金属离子依赖性已有研究表明不同的金属离子对天然 NP1 有激活或抑制作用本实验结果表明 2.0 mmol/l Zn 2+ Co 2+ 和 Fe 2+ 对重组 NP1 有激活作用, 其中 Zn 2+ 激活作用最为明显 2.

8 重组 NP1 的金属离子依赖性已有研究表明不同的金属离子对天然 NP1 有激活或抑制作用本实验结果表明 2.0 mmol/l Zn 2+ Co 2+ 和 Fe 2+ 对重组 NP1 有激活作用, 其中 Zn 2+ 激活作用最为明显 2.0 mmol/l Ca 2+ Mn 2+ Ni 2+ Mg 2+ 和 Cu 2+ 对 NP1 有不同程度的抑制作用, 其中 Cu 2+ 的抑制作用最为明显 ( 表 3) 3 讨论本研究构建了 pmal-p4x-np1 分泌型表达载体, 并利用 T7 Express 和 Origami B(DE3) 菌株, 首次实现了 NP1 在大肠杆菌内的成功表达和活性测定酶活性检测表明 Origami B(DE3) 菌株中获得的重组蛋白的活性高于 T7 Express 菌株 (75.48 U/mg:51.50 U/mg); 利用蛋白酶 Factor Xa 图 6 Fig. 6 重组 NP1 的热稳定性 Thermal stability of recombinant NP1. 切除 MBP 标签后, 两种重组蛋白的活性均有上升, 分别为 U/mg 和 U/mg 融合蛋白 MBP-NP1 具有一定的酶活力, 但融合在 N- 端的 MBP 标签对酶活性产生了一定的影响我们也曾将 His-tag 融合在 NP1 的 C- 末端, 结果获得的融合蛋白检测不到活性, 说明 NP1 的 C- 末端对酶的活性也非常重要本研究采用分泌型融合表达载体 pmal-p4x,mbp 的融合增加了目标蛋白的可溶性, 分泌型表达则降低了重组蛋白对宿主细胞的伤害, 提高了目标蛋白的表达量利用大肠杆菌表达 NP1 的研究尚未见报道, 与 Ying 等建立的桔青霉 P. citrinum 发酵和分离纯表 3 不同金属离子对 NP1 活性的影响 Table 3 Effect of different metal ions on specific activity Metal ions (2.0 mmol/l) Relative specific activity (%) Control 100 Zn ±1.32 Co ±0.42 Fe ±2.00 Ca ±0.77 Mn ±0.70 Ni ±0.48 Mg ±0.64 Cu ±0.50 化法相比 [28], 本研究获得的重组 NP1 的比活力虽然较低, 但表达量高, 纯化流程简单, 重组蛋白可达 6.30~9.65 mg/l, 且可通过高密度发酵等手段进一步提高表达效率天然 NP1 的表观分子量为 42~50 kda, 而根据氨基酸序列推导的理论分子量仅为 29 kda, 这是由于天然 NP1 存在糖基化现象 [2,4] 本研究采用了大肠杆菌系统, 因而制备的重组 NP1 不存在糖基化现象与天然 NP1 相比, 重组 NP1 的比活力约为前者的 20% 左右, 缺少糖基化修饰可能是造成活力下降的原因之一重组蛋白在 80 温浴 30 min 后保持 90% 的残余酶活力,90 温 cjb@im.ac.cn

9 1396 ISSN CN /Q Chin J Biotech November 25, 2012 Vol.28 No.11 浴 30 min 后仍有 69% 的残余酶活力, 说明重组蛋白具有良好的耐热性, 其热稳定性与天然酶相当重组蛋白对金属离子的依赖性实验显示, 2.0 mmol/l Zn 2+ Co 2+ Fe 2+ 对重组蛋白均有不同程度的激活作用,Mn 2+ Ca 2+ Ni 2+ Mg 2+ Cu 2+ 则均有不同程度的抑制作用, 其中 Zn 2+ 的激活作用最显著, 而 Cu 2+ 的抑制作用最明显 [9], 这与 Ying 等的研究结果有所不同 [28] NP1 在研究中的应用日趋广泛, 而目前商品化 NP1 主要通过桔青霉 P. citrinum 发酵获得, 纯化过程繁琐本研究实现了 NP1 在大肠杆菌系统中的功能性表达和纯化, 并证明重组 NP1 具有较高的比活力和良好的热稳定性, 为研究用高纯度 NP1 的获得提供了一个新的来源 REFERENCES [1] Kuninaka A, Kibi M, Yoshino H, et al. Studies on 5'-phosphodiesterases in microorganisms Part II. Properties and application of Penicillium citrinum 5'-phosphodiesterase. Agr Biol Chem, 1961, 25(9): [2] Fujimoto M, Kuninaka A, Yoshino H. Some physical and chemical properties of nuclease P1. Agr Biol Chem, 1975, 39(10): [3] Maekawa K, Tsunasawa S, Dibo G, et al. Primary structure of nuclease P1 from Penicillium citrinum. Eur J Biochem, 1991, 200(3): [4] Volbeda A, Lahm A, Sakiyama F, et al. Crystal structure of Penicillium citrinum P1 nuclease at 2. 8 Å resolution. EMBO J, 1991, 10(7): [5] Romier C, Dominguez R, Lahm A, et al. Recognition of single-stranded DNA by nuclease P1: high resolution crystal structures of complexes with substrate analogs. Proteins, 1998, 32(4): [6] Iwamatsu A, Aoyama H, Dibó G, et al. Amino acid sequence of Nuclease S1 from Aspergillus oryzae. J Biochem, 1991, 110(1): [7] Potter BVL, Connolly BA, Eckstein F. Synthesis and configurational analysis of a dinucleoside phosphate isotopically chiral at phosphorus. stereochemical course of Penicillium citrinum nuclease P1 reaction. Biochemistry, 1983, 22(6): [8] Fujimoto M, Kuninaka A, Yoshino H. Substrate specificity of nuclease P1. Agr Biol Chem, 1974, 38(9): [9] Fujimoto M, Kuninaka A, Yoshino H. Identity of phosphodiesterase and phosphomonoesterase activities with nuclease P1 (a nuclease from Penicillium citrinum). Agr Biol Chem, 1974, 38(4): [10] Olsen DB, Eldrup AB, Bartholomew L, et al. A 7-deaza-adenosine analog is a potent and selective inhibitor of hepatitis C virus replication with excellent pharmacokinetic properties. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(10): [11] Nora HS. Dietary ribonucleotides and health. Nutrition, 2003, 19(1): [12] Köhne CH, Schöffski P, Wilke H, et al. Effective biomodulation by leucovorin of high-dose infusion fluorouracil given as a weekly 24-hour infusion: results of a randomized trial in patients with advanced colorectal cancer. J Clini Oncol, 1998, 16(2): [13] Cui GY. Flavor nucleotides and their usage in food. Chinese Condiment, 2001(10): 25 29, 32. 崔桂友. 呈味核苷酸及其在食品调味中的应用. 中国调味品, 2001(10): 25 29, 32. [14] Chango A, Nour AMA, Niquet C, et al. Simultaneous determination of genomic DNA methylation and uracil misincorporation. Med Princ Pract, 2009, 18(2): [15] Hua NP, Naganuma T. Application of CE for determination of DNA base composition. Electrophoresis, 2007, 28(3): [16] Shimelis O, Giese RW. Nuclease P1 digestion/high-performance liquid chromatography, a practical method for DNA quantitation. J

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌