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1 中南大学学报 ( 医学版 ) 犑犆犛犝狏 ( 犕犱犛 ) 2011,36(3) htp://xbyx.xysm.net 261 转化生长因子 3 在小鼠牙胚钟状晚期以后发育中的表达和分布阙国鹰 1, 李恒 2, 张磊 2, 邹莉 2, 吴英 1 ( 中南大学 1. 湘雅医院口腔科 ;2. 口腔医学院, 长沙 ) [ 摘要 ] 目的 : 观察转化生长因子 3(transforminggrowthfactor3,TGF 3) 在小鼠牙胚钟状晚期以后发育中的表达分布, 探讨其在小鼠牙胚钟状晚期以后发育中的作用方法 : 取近交系 BALB/C 小鼠出生后 4 d(4dayspostnatal,4dpn) 11d(11dpn) 及 18d(18dpn) 的牙胚, 常规固定脱钙包埋切片, 用 SP 法免疫组织化学染色技术检测 TGF 3 在各牙胚中的表达结果 :4dpn 牙胚成釉细胞层成牙本质细胞层呈强阳性表达, 牙乳头周边区域细胞呈阳性表达, 中间区域呈弱阳性表达 ;11dpn 牙胚成釉细胞层呈弱阳性表达, 成牙本质细胞层牙乳头细胞呈阴性表达 ;18dpn 牙胚牙周膜中的血管壁及周围呈强阳性表达, 牙本质牙骨质牙周膜成纤维细胞呈阴性表达结论 :TGF 3 在小鼠牙胚钟状晚期以后发育过程中的表达具有一定的时空分布性, 可能在牙胚发育中有一定的调控作用, 这种作用可能随着牙胚的发育而逐渐减弱 [ 关键词 ] 牙胚 ; 转化生长因子 3; 免疫组织化学 DOI: /j.issn 犈狓狆犱犱犫犳犳犿犵犵狑犳 3 犿犵犿犱犵犱狏狆犿犳犱狏犱犫犵 QUEGuoying 1,LIHeng 2,ZHANGLei 2,ZOULi 2,WU Ying 1 (1. 犇狆犿犳犛犿犵狔, 犡犵狔犎狆 ; 2. 犛犳犛犿犵狔, 犆犛犝狏狔, 犆犵 , 犆 ) 犃犫 : 犗犫犼狏 Toobservetheexpressionanddistributionoftransforming growthfactor3(tgf 3)inthemousetoothgermafteradvancedbelstage,andtodiscuss theroleoftgf 3duringthedevelopmentoftoothgerms. 犕犱 BALB/C smouse toothgermsat4,11,and18dayspostnatal(4dpn,11dpn,and18dpn)werecolectedand processedforroutinefixation,decalcification,embedding,andslicing.theexpressionof TGF 3wasdetectedbyimmunohistochemisty. 犚 Asto4dpntoothgerm:Positive expressionoftgf 3wasfoundinenameloblasts,odontoblasts,ambitusofdentalpupila, withweakpositiveexpressionintheintermedialofdentalpapila.asto11dpntoothgerm: Positiveexpressionwasseeninenameloblasts,withnegativeexpressioninodontoblastsand dentalpapila.asto18dpntooth,positiveexpressionoftgf 3wasshowedinthevessel walanditssurounding,withnegativeexpressioninotherareas. 犆 Thedistribu tionoftgf 3expressionshowedatime spacecharacteristicduringthemousetoothgerm developmentafteradvancedbelstage,whichmayexertaregulatoryefectontoothdevelop 收稿日期 ( 犇犳狆 ) 作者简介 ( 犅犵狆狔 ) 阙国鹰, 硕士, 教授, 主要从事儿童牙病和口腔预防研究通信作者 ( 犆狆犱犵 ) 李恒,E mail:liheng_8421.student@sina.com 基金项目 ( 犱犿 ) 中南大学大学生创新性试验计划 (YA07053) ThisworkwassupportedbyInnovativeTrialPro gramforstudentsofcentralsouthuniversity,p.r.china(ya07053).

2 262 中南大学学报 ( 医学版 ),2011,36(3) htp://xbyx.xysm.net mentandthisefectisgradualygetingweakwiththedevelopmentoftoothgerms. 犓狔狑犱 : toothgerm; transforminggrowthfactor3; immunohistochemistry 由基质介导的上皮 - 间充质间的相互作用, 控制了牙胚形态发生成牙本质细胞和成釉细胞的分化以及牙本质和牙釉质基质的形成, 但细胞与基质相互作用调控牙胚发育的确切分子机制仍不清楚生长因子在上皮 - 间充质相互作用中转导细胞与基质 [1] 之间信号联系方面起重要作用, 其中转化因子 3 (transforminggrowthfactor3,tgf 3) 在间充质 [2] 细胞系中表达最为明显, 其生物学功能主要包括诱导间质细胞的增殖和分化促进细胞外基质的形 [1] 成抑制上皮细胞的增殖与分化抑制免疫反应 [3 4] 等, 现已成为细胞因子家族中的研究热点之一以往关于 TGF 3 在牙胚中分布的报道, 不论是研究鼠牙胚还是人牙胚, 都仅限于钟状晚期之 [5 6] 前, 本实验取钟状晚期之后不同时期的小鼠牙胚, 连续观察 TGF 3 的表达和分布, 探讨 TGF 3 在小鼠牙胚钟状晚期以后发育中的作用 1 材料与方法 1.1 实验动物及取材出生后 4d(4dayspostnatal,4dpn) 的近交系 BALB/C 小鼠 6 只 ( 中南大学动物学部提供 ) 分别取 4dpn,11d(11dpn) 及 18d(18dpn) 小鼠的下颌第 1 磨牙牙胚各 2 个, 置于 10% 多聚甲醛中固定 1.2 实验设备和材料兔抗小鼠 TGF 3 抗体 (bs 0099R) 系北京博奥森生物技术有限公司产品 PBS 缓冲液 0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液 DAB 显色剂二甲苯无水乙醇过氧化物酶阻断剂苏木精复染液等均为北京鼎国昌盛生物技术公司提供 1.3 切片制作方法和步骤标本在 10% 多聚甲醛液中充分固定, 低温脱钙, 常规石蜡包埋,4~5μm 连续切片将多聚赖氨酸防脱载玻片即刻置于 60 烤箱烤片 4h 以上, 脱蜡, 透明 ; 加 50μL 过氧化酶阻断剂, 室温下孵育 10 min; 热修复抗原, 每张切片加 50μL 正常山羊血清, 室温下孵育 30min; 加 50μL 的第 1 抗体 (TGF 倍稀释 ),37 孵育 60min; 加 50μL 生物素标记的第 2 抗体 ( 生物素标记山羊抗兔 IgG),37 孵育 30min; 加 50μL 辣根过氧化酶标记的链亲和素溶液 ( 倍稀释 ),37 孵育 30min 以上每两步间用 PBS 液洗 3min 共 3 次,DAB 显色, 自来水充分冲洗 10 min, 苏木精复染, 自来水冲洗 10~15 min 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片, 显微镜下检查 1.4 结果判读用 PBS 代替一抗作为染色的阴性对照, 请两位经验丰富的阅片者进行审阅 TGF 3 阳性表达呈黄色至棕黄色颗粒状, 主要位于细胞浆细胞膜及胞外基质, 阴性对照无表达将 HE 切片与免疫组织化学 ( 免疫组织化学 ) 染色切片对照观察, 判定免疫组织化学阳性表达的部位和细胞种类, 按有无表达和表达的细胞多少及染色深浅程度, 分为阴性弱阳性阳性强阳性 : 阴性无表达 ; 弱阳性的阳性细胞很少, 染色呈浅黄色 ; 阳性的阳性细胞较多, 染色呈黄色 ; 强阳性的阳性细胞很多, 连成条带状或者片状, 染色呈深黄色至棕黄色 2 结果 2.1 4dpn 牙胚处于钟状晚期, 内釉上皮细胞分化为成釉细胞, 呈高柱状, 并开始分泌釉质基质 ; 牙乳头周边的成牙本质细胞极化, 开始分泌前期牙本质基质 ; 主要牙尖区牙本质基质较厚, 极化的成釉细胞分泌型成牙本质细胞及基底膜全层染成棕色,TGF 3 呈强阳性表达 ; 牙乳头临近周边区域的阳性细胞染成黄色, 呈阳性表达, 中间区域的阳性细胞分散排列, 呈弱阳性表达 ( 图 1) dpn 牙胚成釉细胞及成牙本质细胞分化成熟, 已分泌一定厚度的牙釉质及牙本质层, 基底膜已断裂消失, 成釉细胞层染成黄色,TGF 3 表达为阳性, 成牙本质细胞牙乳头细胞染成淡黄色, 均表达为弱阳性 ( 图 2) dpn 牙胚牙冠部分发育完成, 牙周膜中的血管壁及周围染成黄色,TGF 3 表达为阳性 ; 牙本质牙骨质牙周膜成纤维细胞无染色, 表达为阴性 ( 图 3)

3 转化生长因子３在小鼠牙胚钟状晚期以后发育中的表达和分布阙国鹰等２６３图１４犱狆牙胚的免疫组化染色极化的成釉细胞分泌型成牙本质细胞及基底膜全层染成棕色牙乳头临近周边区域的阳性细胞染成黄色中间区域的阳性细胞分散排列ＡＨＥ１００ＢＨＥ４００１犐犿犿犿犳４犱狆犵犿Ｓｏｇｏｏｍｄｏｄｏｏ犵犵ｏｍｂｕｏｆｄｄｗｋｏｏｍｄｏｆｂｏｄＡＨＥ１００ＢＨＥ４００图２１成牙本质细胞牙乳头细胞无染色Ａ１犱牙胚的免疫组化染色成釉细胞层染成淡黄色ＨＥ１００ＢＨＥ狆４００犿犳１１犱狆犵犿Ｗｋｏｏｍｄｇ犵２犐犿犿犵ｏｏｄｏｄｄｏｗｄＡＨＥ１００ＢＨＥ４００性模式表达说明其在调控上皮间充质相互作用及成牙本质细胞和成釉细胞的分化中起了重要作用本实验结果显示４１１及１８ｄ小鼠牙胚３的表达分布不断变化其变化规律在不同的组织中各有特点４ｄ小鼠牙胚处于钟状晚期成釉细胞和成牙本质细胞的分化接近完成并已开始分泌釉质基质和牙本质基质成釉细胞层成牙本图３１８犱狆牙胚的免疫组化染色犎犈４００牙本质牙骨质牙周膜成纤维细胞无染色牙周膜中的血管壁及周围染成黄色犿犳１８犱狆犵３犐犿犿犵犿犎犈４００Ｐｏｏ犵ｗｄｕｏｕｄｇｄｘｇｏｏｄ３讨论３通过与靶细胞上的受体结合后进行一系列信号转导从而发挥其调控作用以往的研究５６表明３在牙胚发育过程中均呈时间空间特异质细胞层基底膜中３均呈强阳性表达牙乳头细胞呈阳性表达这一结果与朱奇等５检测的结果基本一致１１ｄ小鼠牙胚成釉细胞和成牙本质细胞已分化成熟已有矿化的牙釉质和牙本质层此时的牙乳头虽可以称为牙髓但牙乳头细胞尚未全部分化为牙髓细胞３在成釉细胞层表达为弱阳性成牙本质细胞牙乳头细胞都表达为阴性１８ｄ小鼠牙胚冠部发育已结束牙釉质及冠部牙本质已发育完成牙根正在发育中３在牙周膜中的血管壁及周围表达为阳性牙本质牙骨质牙周膜成纤维细胞中表达阴性３在成釉细胞中的表达随着牙胚的发育而逐渐减弱提示

4 264 中南大学学报 ( 医学版 ),2011,36(3) htp://xbyx.xysm.net TGF 3 对成釉细胞的调控作用可能随着时间的增加而逐渐衰减 4dpn 小鼠牙胚的成牙本质细胞层表达为强阳性, 表明 TGF 3 对此期成牙本质细胞的分化可能有重要的调控作用, 而在 11dpn 及 18dpn 则为阴性, 提示调控作用可能只发生在牙本质发育的早期成牙本质细胞分化和分泌开始的阶段许多研究证实 TGF 3 对多种间充质细胞的分化有促进作 [7 8] 用, 同时具有刺激 I 型胶原合成与成熟的作 [9] [10] 用, 牙本质基质的主要有机成分为 I 型胶原, 推测 TGF 3 可能通过刺激成牙本质细胞 I 型胶原的合成与分泌从而促进早期牙本质基质的分泌和沉积在晚期成牙本质细胞分化完成牙本质进入矿化阶段,TGF 3 的表达为阴性, 提示此时 TGF 3 可能已失去了对牙本质形成的调控作用结合 TGF 3 在牙釉质牙本质发育过程中的表达变化, 笔者认为其对牙体硬组织发育的调控可能仅在早期起作用, 后期牙体硬组织的发育可能主要由其他细胞因子调控在牙胚的发育过程中, 上皮 - 间充质的相互诱导作用非常重要, 上皮来源的 TGF 3 可能主要以自分泌方式调控间充质细胞的生长和分化, 以旁分 [11 12] 泌方式调控上皮 - 间充质相互作用研究证明, 内釉上皮对成牙本质细胞的调控作用是通过基底膜实现的在成牙本质细胞开始分化前, 基底膜是完整连续的, 其主要成分为各种细胞外基质蛋白, 内釉上皮诱导成牙本质细胞分化时, 一些细胞因子从内釉上皮中分泌出来, 透过基底膜扩散, 导致基底膜逐渐变为不连续直到最终消失 4dpn 的牙胚基底膜 TGF 3 表达呈强阳性, 表明在成牙本质细胞分化过程中 TGF 3 可能作为一种从内釉细胞分泌出的细胞因子参与诱导成牙本质细胞的分化, 从而调控上皮 - 间充质的相互诱导 11dpn 及 18dpn 时牙胚的基底膜已断裂消失, 其介导上皮间充质相互作用的功能随着结构的改变而减退, 导致未检测到 TGF 3 的表达另外, 在 18dpn 小鼠牙胚的牙周膜中血管壁及管周可见 TGF 3 表达阳性, 说明 TGF 3 对牙周膜血管的发生可能具有一定作用, 具体机制有待进一步研究本实验表明 :TGF 3 在小鼠牙胚钟状晚期以后发育过程中的表达具有一定的时空分布性, 可能在牙胚的发育中有一定作用, 这种作用可能随着牙胚的发育而逐渐减弱参考文献 : tionalsignificanceinregulatingthefateofcranialneural crestcels[j].critrevoralbiolmed,2003,14(2): [2] Garcia MolinaJA,Valespi MiroG.Theroleoffibroblast growthfactor (FGF)andtypebetatransforminggrowth factor(tgf beta1 beata2 beta3)duringratcraniofacial development[j].bulgroupintrechscistomatolodon tol,2003,45(2/3): [3] SchultzeS,WehrhanF,AmannK,etal.invivoTGF beta3 expressionduring woundhealinginiradiatedtissue[j]. StrahlentherOnkol,2003,179(6): [4] BefagnaG,OcchiG,NavaA,etal.Regulatorymutationsin transforminggrowthfaetor beta3genecausearhythmo genicrightventricularcardomyopathytype1[j].cardiovasc Res,2005,65(2): [5] 朱奇, 樊明文. 转化生长因子 3mRNA 在小鼠磨牙牙胚发育过程中的表达 [J]. 武汉大学学报 : 医学版,2007,28(4): ZHU Qi,FAN Mingwen.Expression of transforming growthfactor beta3 mrna during mouse molardevelop ment[j].medicaljournalofwuhan University,2007,28 (4): [6] MoriguchiM,YamadaM,MiakeY,etal.Transforminggrowth factorbetainducibleapoptoticcascadeinepithelialcelsduringrat molartootheruptions[j].anatsciint,2010,85(2): [7] 郑东, 杨述华. 工程化生长转化因子 3 促进软骨前体细胞向软骨分化的实验研究 [J]. 南京医科大学学报 : 自然科学版,2007,27(6): ZHENG Dong,YANG Shuhua.Theengineered TGF 3 promotedthediferentiationofchondrogenicprogenitorcels intochondrocytesinvitro[j].actauniversitatismedicinalis Nanjing,2007,27(6): [8] 赵基栋, 祝建中.TGF 3 诱导骨髓间充质干细胞表达软骨细胞表型的实验研究 [J]. 实用临床医药杂志,2005,9(11): ZHAOJidong,ZHUJianzhong.Theexperimentstudyof thediferentiationofbonemarowmesenchmalstemcelsto experssthephenotyppeofchondrocytelinegebytransfor minggrowthfactor 3invitro[J].JournalofClinicalMedi cineinpractice,2005,9(11): [9] 张世平, 卢日峰. 人转化生长因子 3 的构建 [J]. 吉林大学学报 : 医学版,2006,32(4): ZHANGShiping,LURifeng.Constructionofhumantrans forminggrowthfactor beta3[j].journalofjilinuniversity. MedicineEdition,2006,32(4): [10] 于世凤. 口腔组织病理学 [M]. 北京 : 人民卫生出版社, 2007:55. YUShifeng.Oralhistologyandpathology[M].Beijing:Peo ple smedicalpublishinghouse,2007:55. [11]HuojiaM,MuraokaN,YoshizakiK,etal.TGF beta3induces ecdopicmineralizationinfetalmousedentalpulpduringtooth [1] ChaiY,ItoY,HanJ.TGF betasignalinganditsfunc germdevelopment[j].devgrowthdifer,2005,47(3):141

5 转化生长因子 3 在小鼠牙胚钟状晚期以后发育中的表达和分布阙国鹰, 等 [12]IoharaK,NakashimaM,ItoM,etal.Dentinregenerationby dentalpulpstemceltherapywithrecombinanthumanbone morphogeneticprotein2[j].jdentres,2004,83(8): ( 本文编辑陈丽文 )

牙的发育

第二章牙的发育 Chapter 2 Development of Teeth Designed and produced by Dr. Wang Li 1 概述牙及其支持组织是从上下颌突和额鼻突的外胚层及外胚间叶细胞发育而来牙齿发育是一长期复杂的生物学过程牙齿发育是一个连续的过程, 包括牙胚的发生牙体组织形成和牙齿的萌出 Designed and produced by Dr. Wang