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1 857 柯萨奇病毒 A16 粘膜疫苗的制备及其免疫效果研究论著摘要 : 目的李广红, 郝瑜, 刘顺涛, 曹银光泰山医学院附属聊城市人民医院, 山东聊城利用同源重组技术将柯萨奇病毒 A16 型 (Coxsachievirus A16, CA16)VP1 基因重组入枯草芽孢杆菌基因组, 进而将 VP1 蛋白展示在芽孢表面制备 CA16 粘膜疫苗将疫苗滴鼻方式免疫小鼠, 检测小鼠血清中 VP1 特异性抗体滴度, 体外中和实验检测抗体的保护作用方法将枯草芽孢杆菌 CotB 基因与 VP1 基因连接后插入整合质粒 pdg1662 得到重组质粒 pdg1662-cotb-vp1, 电转化法将线性化重组质粒转化枯草芽孢杆菌 1A771, 抗生素抗性筛选, PCR Western-Blot 免疫荧光鉴定 VP1 基因重组及蛋白表达情况将该疫苗滴鼻免疫小鼠,ELISA 法检测血清抗体滴度, 体外中和实验分析该抗血清的中和活性结果 VP1 基因成功重组入枯草芽孢杆菌基因组中并将蛋白展示在芽孢表面该疫苗免疫小鼠后有效的诱导了小鼠体液免疫反应, 并且该抗血清在体外中和实验中表现了较好的中和活性结论 CA16 VP1 蛋白展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面制备的疫苗能刺激小鼠产生具有保护作用的中和抗体, 为研制 CA16 粘膜疫苗奠定了基础关键词 : 柯萨奇病毒 A16 型 ;VP1; 粘膜疫苗 ; 枯草芽孢杆菌芽孢中图分类号 :R7.2 文献标识码 :A 文章编号 : (2017) DOI: /j.cnki /r Methods Preparation and immune effect of a Coxsackievirus A16 mucosa vaccine LI Guanghong, HAO Yu, LIU Shuntao, CAO Yinguang Liaocheng People s Hospital of Taishan Medical University, Liaocheng, Shandong , China Corresponding author: CAO Yinguang, @16.com Abstract: Objective To prepare the Coxsackievirus A16 mucosa vaccine and investigate its immune effect. VP1 gene fused with CotB gene of Bacillus subtilis was inserted into integration vector pdg1662 to get plasmid pdg1662- CotB- VP1. The transformation of B. subtilis 1A771 was performed with linearized pdg1662- CotB- VP1 by the electric transformation method. The recombinant strains were screened by the antibiotic resistance and identified by PCR, Western-Blot and immunofluorescence. The sera of mice which were treated with the mucosa vaccine were collected, and the titers of VP1 antibody were detected by ELISA, and the protective effect was analyzed by the micro neutralization method in vitro. Results VP1 gene was integrated into B. subtilis genome successfully and VP1 was displayed on the surface of the spores effectively. The mucosa vaccine could stimulate immune response effectively in the mice and the sera showed a favorable protective effect in the micro neutralization experiments in vitro. Conclusion B. subtilis spores which display VP1 on the surface could stimulate the neutralization antibodies in mice. The experiments lay a foundation of further study on mucosa vaccine of CA16. Key words: Coxsackievirus A16; VP1; mucosa vaccine; Bacillus subtilis spore 手足口病 (hand foot and mouth disease,hfmd) 是 [1-5] 威胁婴幼儿健康的重要疾病,2008 年我国将其列入中华人民共和国传染病防治法规定报告的丙类传染病管理引起 HFMD 病原以肠道病毒 71 型 (Enterovirus 71,EV71) 和柯萨奇病毒 A16 型 [6-8] (Coxsachievirus A16, CA16) 为主其中,CAl6 还是引起心肌炎心肌病心包炎及其他严重疾病的重要 [9] 病原, 常占感染总人数的 60% 以上 1958 CA16 首先在加拿大被分离到, 归类于小 RNA 病毒科 (Picornaradae) 肠道病毒属 (Enterovirus), 其结构蛋白有 VP1 VP2 VP VP4, 其中 VP1 VP2 VP 存在于病毒体的表面, 而 VP4 在其内部紧靠 RNA 虽然关于 CA16 的研究有大量的文献报道, 但是到目前为止, 仍然没有有效的治疗药物及疫苗, 可见, 传统方法制备的疫苗及筛选的药物很难解决 CA16 感染的防控问题因此, 本实验室将 CA16 VP1 基因与枯草芽孢杆菌 CotB 基因连接后重组到枯草芽孢杆菌基因组中, 进而将 VP1 蛋白展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面, 以枯草芽孢杆菌芽孢为佐剂制备 CA16 粘膜途径疫苗, 为 CA16 疫苗的研制提供新的思路和方向 1 材料与方法 1.1 材料质粒 pdg1662 枯草芽孢杆菌 1A771 购自基金项目 : 中国博士后科学基金 (No.2014M56197); 山东省医药卫生科技发展项目 (No.2014WS0299) 作者简介 : 李广红 (1967 ), 女, 本科, 主管药师, 研究方向 : 生物制药通信作者 : 曹银光, @16.com

2 858 中国热带医学 2017 年第 17 卷第 9 期 Bacillus Genetic Stock Center;CA16 病毒分离于聊城市人民医院手足口病患者粪便标本 ;BALB/c 小鼠购自山东大学实验动物中心 ; 克隆载体 pmd18-t pfu DNA 聚合酶购自济南星宝生物技术有限公司 ;RNA 提取试剂盒 DNA 凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司 ; 限制性内切酶及逆转录试剂盒购自宝日医生物技术 ( 北京 ) 有限公司 ;HRP 标记山羊抗小鼠 IgG 购自北京索莱宝生物技术有限公司 ;HRP 标记山羊抗小鼠 IgA 购自 Abcam;FITC 标记山羊抗小鼠 IgG 购自武汉博士德生物工程有限公司, 完全福氏佐剂及不完全福氏佐剂购自 Sigma 1.2 方法目的基因的调取查询 GeneBank 中枯草芽孢杆菌 CotB 及科萨奇 A16 VP1 基因序列, 设计引物, 序列如下 :CotB1:5 - GAATTCGAATCCGAGTTTC GCAAGTCCT- ;CotB2:5 - AAGCTTGATGATT GATCATCTGAAGAT- ;VP1.1:5 - AAGCTT GGGGACCCCATTGCAGATATGAT- ;VP1.2:5 - GGATCCCAGCGTTGTTATCTTGTCTCTACT- ( 目的片段长 90 bp), 由上海博亚生物有限公司合成 RNA 提取试剂盒提取 CA16 基因组, 以 Oligo(dT) 为引物反转录得到 cdna 分别以反转录得到的 cdna 及枯草芽孢杆菌 1A771 为模板调取目的基因将上述目的片段连接到 pmd18-t 载体, 测序鉴定重组质粒的构建将质粒 pmd18- VP1 pmd18-cotb 分别用 EcoRⅠ/HindⅢ 及 HindⅢ/BamH Ⅰ 进行双酶切, 将酶切产物顺序连接到 pdg1662 中 ( 图 1), 将所得质粒分别以 CotB1- CotB2 VP1.1- VP1.2 CotB1-VP1.2 为引物 PCR 鉴定, 然后用 EcoRⅠ/ HindⅢ HindⅢ/BamHⅠ 及 EcoR/BamHⅠ 酶切鉴定图 1 Fig. 1 amye' CotB pdg1662 cat VP1 amye' CotB 及 VP1 基因连接后插入整合载体 pdg1662 Schematic representation of the fusion gene in pdg 转化及筛选方法参考以往文献 [10], 将 1A771 种子接种于 80 ml 生长培养基中, 于 7 条件下震荡培养 h 将培养物放入冰水中孵育 10 min, g, 离心收集菌体用冰冷的电击缓冲液洗涤细胞次用 2 ml 电击缓冲液重悬细胞即为枯草芽孢杆菌感受态细胞将提取的质粒 pdg1662-cotb- VP1 用 NdeⅠ 酶切线性化后加入到感受态细胞混匀并转移到冰冷的电转化杯中, 冰浴 1.5 min,1 800 V 电击后加入 1 ml 复苏培养基 7 摇床震荡培养 h, 将复苏物涂布在氯霉素抗性 LB 平板上,7 培养过夜挑取单菌落, 氯霉素抗性 LB 培养基 7 摇床震荡培养过夜, 将菌液接种红霉素抗性 LB 培养基 7 摇床震荡培养过夜对红霉素敏感而具有氯霉素抗性的克隆即为正确重组的菌株重组菌的 PCR 鉴定将筛选阳性菌株接种到 10 ml 氯霉素抗性 LB 液体培养基中,7 摇床震荡培养过夜离心收集菌体, 酚氯仿法提取细菌基因组, 野生菌株做同样处理分别以重组菌和野生菌基因组为模版,VP1 引物 PCR 扩增, 琼脂糖凝胶电泳观察结果重组菌 Western-Blot 鉴定重组菌氯霉素抗性 LB 液体培养基中 7 摇床震荡培养 24 h 后于室温静置 48 h 使芽孢充分生成, g 离心收集菌体, 用溶菌酶 (20 mmol/l Tris-HCl 缓冲液,pH 8.0, 溶菌酶 1 g/l) 处理菌体,7 1 h, 离心收集芽孢 10 ml 脱壳缓冲液重悬芽孢, r/min 孵育 1 h, g 离心 10 min, 上清即为衣壳蛋白溶液, 野生菌株做同样处理衣壳蛋白与 2 上样缓冲液等量混匀后煮沸 min,sds-page 电泳后转 NC 膜以灭活 CA16 免疫小鼠制备的多抗为一抗,HRP 标记山羊抗小鼠 IgG 为二抗,ECL 化学发光法检测 VP1 表达情况重组菌免疫荧光鉴定将收集的芽孢用 PBS 洗次, 与 CA16 多抗 4 共孵育过夜,PBST 洗芽孢次后重悬芽孢与 FITC 标记山羊抗小鼠 IgG 7 摇床轻微震荡共孵育 1 h,pbst 洗芽孢次后涂玻片, 野生菌株做同样处理, 于荧光显微镜 (Nikon Eclipse Ti-S) 下观察结果免疫动物将 26 只 BALB/c 小鼠随机分为和,10 只 / 组, 其余 6 只作为阴性对照, 分别接种上述重组枯草芽孢原核表达的 VP1 蛋白及生理盐水, 滴鼻免疫, 每周 2 次, 共持续 6 周第 7 周于眼动脉丛取血, 收集血清于 80 保存待用 ELISA 法测定血清抗体滴度灭活 CA16 包板,5% 脱脂奶粉封闭,PBS 2 倍比稀释血清,100 μl/ 孔, 每个稀释度重复 2 孔,7 孵育 1 h,hrp 标记山羊抗小鼠 IgG 及 HRP 标记山羊抗小鼠 IgA PBS 稀释后分别加孔,100 μl/ 孔 7 孵育 1 h TMB 显色,2 mol/l 硫酸终止后测定 A450,SPSS1.0 分析小鼠血清抗体滴度

血清对照和正常细胞对照观察细胞病变, 以 100% 不出病变的最高血清稀释度为中和效价,SPSS1.0 分析结果 2 结果 2.1 调取目的基因电泳图结果表明调取 CotB 及 VP1 基因, 大小分别为 1 05 bp 904 bp( 图 2), 将调取的基因片段连接到 pmd18-t 载体后测序正确从而得到质粒 pmd18-vp1 和 pmd18-cotb 注 :M.

2 重组质粒的构建从质粒 pmd18- CotB 和 pmd18-vp1 切下目的片段 CotB 及 VP1, 依次插入 pdg1662 中得到 pdg1662-cotb-vp1 质粒将 PCR 鉴定阳性的 pdg1662-cotb-vp1 质粒分别用 EcoRⅠ/ HindIII HindIII/BamHⅠ 及 EcoR/BamHⅠ 双酶切产物电泳在 1 05 bp 904 bp 2

2 为引物 PCR, 电泳出现 904 bp 大小目的片段, 而阴性对照无条带出现 ( 图 4), 表明科萨奇病毒 A16 VP1 基因成功重组到枯草芽孢杆菌基因组中 2.

3 微量细胞中和试验参考已有文献 [10-12], 小鼠血清 1 10 稀释后 56 灭活 0 min, 从 1 10 倍比稀释, 每个稀释度加等体积 400 TCID 50 的病毒液, 混匀后 7 孵育 1 h, 每一稀释度接种 96 孔细胞培养板 RD 细胞上,50 μl/ 孔, 再各补加细胞维持液 50 μl/ 孔, 7, 5% CO 2 孵箱中培养同时设立病毒对照正常血清对照和正常细胞对照观察细胞病变, 以 100% 不出病变的最高血清稀释度为中和效价,SPSS1.0 分析结果 2 结果 2.1 调取目的基因电泳图结果表明调取 CotB 及 VP1 基因, 大小分别为 1 05 bp 904 bp( 图 2), 将调取的基因片段连接到 pmd18-t 载体后测序正确从而得到质粒 pmd18-vp1 和 pmd18-cotb 注 :M. D2000 plus DNA marker;a. VP1 PCR 产物 ;B. CotB PCR 产物 Note: M. D2000 plus DNA marker; A. PCR product of VP1; B. PCR product of CotB. Fig bp 2.2 重组质粒的构建从质粒 pmd18- CotB 和 pmd18-vp1 切下目的片段 CotB 及 VP1, 依次插入 pdg1662 中得到 pdg1662-cotb-vp1 质粒将 PCR 鉴定阳性的 pdg1662-cotb-vp1 质粒分别用 EcoRⅠ/ HindIII HindIII/BamHⅠ 及 EcoR/BamHⅠ 双酶切产物电泳在 1 05 bp 904 bp bp 大小出现目的条带 ( 图 ), 表明成功将 CotB 和 VP1 基因融合构建到质粒 pdg1662 中图 2 M A B 目的基因调取电泳图 Agarose gels electrophoresis analysis of PCR 2. 重组菌鉴定以提取重组菌基因组 DNA 为模板,VP1.1-VP1.2 为引物 PCR, 电泳出现 904 bp 大小目的片段, 而阴性对照无条带出现 ( 图 4), 表明科萨奇病毒 A16 VP1 基因成功重组到枯草芽孢杆菌基因组中 2.4 蛋白表达鉴定提取重组菌及野生型菌芽孢蛋白后 SDS-PAGE 电泳转 PVDF 膜,5% 脱脂奶粉封闭后以柯萨奇病毒 A6 VP1 蛋白多抗为一抗, 辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG 为二抗,ECL 化学发光法观察结果, 重组菌出现目的条带, 而野生菌对照无条带出现 ( 图 5), 结果提示科萨奇病毒 A16 的 VP1 蛋白在芽孢中得到了表达注 :M. D2000 plus DNA marker;a. 重组质粒 HindⅢ/BamHⅠ 双酶切产物 ;B. 重组质粒 EcoRⅠ/HindⅢ 双酶切产物 ;C. 重组质粒 EcoRⅠ/ BamHⅠ 双酶切产物 Note: M. D2000 plus DNA marker ; A. Product of pdg1662- cotb- VP1 digested by Hind Ⅲ/BamH Ⅰ I; B. Product of pdg1662- cotb- VP1 digested by EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ; C. Product of pdg1662-cotb-vp1 digested by EcoRI/BamHI. Fig. 4 Fig bp bp 000 bp 图重组质粒双酶切电泳图 Agarose gels electrophoresis analysis of double restriction enzyme digested recombinant plasmid 注 :M. D2000 DNA marker;a. 野生菌株对照 PCR 产物 ;B,C. 重组菌株 PCR 产物 Note: M. D2000 DNA marker ; A. PCR product of wildtype strain; B,C. PCR product of recombinant strain. 图 4 M A B C M A B C 枯草芽孢杆菌基因组 PCR 电泳图 Agarose gels electrophoresis analysis of Bacillus subtilis 图 5 genome 注 :A. 重组菌株 ;B. 野生菌株 Note: A. Recombinant strain; B. Wild-type strain. Fig. 5 A 芽孢衣壳蛋白 Western-Blot 结果 Western blot analysis of spore coat proteins 2.5 免疫荧光鉴定重组菌将重组菌及野生同基因型菌芽孢依次与 VP1 多抗共孵育, 然后加入 FITC 标记山羊抗小鼠 IgG 共孵育, 涂玻片, 于荧光显微镜下观察结果, 重组菌出现强荧光信号, 而对照菌无绿色 B

中国热带医学 2017 年第 17 卷第 9 期 China Tropical Medicine September 2017 Vol.17 No.

2 B 1 0 注 Note:. P 0.05 注 A. 重组菌株荧光显微镜图片 B. 野生菌株荧光显微镜图片图8 Note: A. Phase of fluorescence microscope of recombination strain; B. Fig. 8 Phase of fluorescence microscope of wild-type strain. 图6 Fig.

6 ELISA 法测定血清抗体滴度以灭活 CA16 为抗原测定小鼠血清中 IgG IgA 抗体滴度由结果图 7 可见小鼠产生了 CA16 特异性抗体 IgA 最高及最低滴度分别为 1 1 280 1 20 几何平均滴度为 1 597 IgG 最高及最低滴度分别为 1 5 120 1 640 平均滴度为 1 2 078 与 VP1 免疫组及比较差异均有统计学意义 P 0.

4 中国热带医学 2017 年第 17 卷第 9 期 China Tropical Medicine September 2017 Vol.17 No 荧光出现图 6 表明 VP1 成功展示在芽孢表面并且能与特异性抗体反应具有良好的免疫反应性 A 高及最低分别为及 1 64 几何平均滴度为与只免疫 VP1 比较差异有统计学意义图 8 结果提示芽孢免疫组血清不仅 ELISA 滴度显著增高中和滴度也得到了有效的增强 Log 稀释度 Log dilution degree 2 B 1 0 注 Note:. P 0.05 注 A. 重组菌株荧光显微镜图片 B. 野生菌株荧光显微镜图片图8 Note: A. Phase of fluorescence microscope of recombination strain; B. Fig. 8 Phase of fluorescence microscope of wild-type strain. 图6 Fig. 6 免疫荧光结果图 Immunofluorescence microscopy analysis 2.6 ELISA 法测定血清抗体滴度以灭活 CA16 为抗原测定小鼠血清中 IgG IgA 抗体滴度由结果图 7 可见小鼠产生了 CA16 特异性抗体 IgA 最高及最低滴度分别为几何平均滴度为 IgG 最高及最低滴度分别为平均滴度为与 VP1 免疫组及比较差异均有统计学意义 P 0.05 表明该疫苗滴鼻途径免疫小鼠能诱导机体产生特异性体液免疫反应枯草芽孢显著提高了抗体水平具有较好的粘膜免疫佐剂功能 4 IgG Log 稀释度 Log dilution degree IgA 2 讨论 CA16 是引起 HFMD 的主要病原之一在我国大陆地区仍有广泛的流行[11-1] 关于 CA16 的疫苗研究已有大量文献报道拟病毒颗粒及灭活病毒制备疫苗能保护乳鼠免受致死剂量病毒攻击[14-15] 亚单位疫苗研究主要聚焦于衣壳蛋白 VP1 众所周知 CA16 衣壳蛋白由 VP1~VP4 构成其中 VP1 蛋白是最主要的衣壳蛋白具有特异性中和表位 VP1 免疫动物能产生较好的体液及细胞免疫反应 [16-17] 因此 VP1 是制备 CA16 亚单位疫苗的最佳选择不论是全病毒还是亚单位疫苗的研究均停滞在实验阶段因此开发理想的 CA16 疫苗还需另辟蹊径众所周知 IgA 是重要的免疫球蛋白之一在抵抗病原微生物尤其是经粘膜途径致病的肠道病毒感染中更为重要因此通过粘膜途径免疫疫苗诱导特异性高水平 IgA IgG 抗体为 CA16 感染的防控提供新的思路有报道将 EV71 有效地刺激机体的免疫反应[18] 与杆状病毒展示蛋白相似细菌表面展示技术在疫苗领域同样受到了广泛关注关于芽孢载体疫苗的研究亦有大量报道[19-21] 均注 Note:. P 0.05 图7 Fig. 7 Neutralizing antibody titers of mouse serum samples VP1 展示在杆状病毒表面制备的疫苗免疫小鼠后能 1 0 小鼠血清中和滴度 ELISA 检测小鼠血清 IgA 和 IgG 抗体滴度 The titers of IgA and IgG of serum samples detected by ELISA 2.7 微量细胞中和试验将各组动物血清倍比稀释微量细胞中和实验发现芽孢免疫组血清中和效价最表明芽孢载体具有安全稳定容易制备经济等优点因此成为载体疫苗的潜在有效工具大量的文献报道均提示以枯草芽孢杆菌芽孢为载体制备黏膜途径 CA16 VP1 亚单位疫苗是 CA16 疫苗研究的有益尝试并具有较好的可行性本研究从 CA16 基因组中调取 VP1 基因并将其与枯草芽孢杆菌 CotB 基因串联插入质粒 pdg1662 中利用同源重组将 VP1 基因插入枯草芽孢杆菌基因

5 861 组, 利用抗生素筛选得到了红霉素敏感氯霉素抗性的菌株, 在抗生素筛选过程中, 我们发现并不是所有具有氯霉素抗性的菌株均对红霉素敏感, 表明 pdg1662 在重组过程中并未将红霉素抗性基因剔除, 这也提示 pdg1662 在重组入细胞基因组时具有不同的插入方式经 PCR Western-Blot 及免疫荧光鉴定表明 VP1 基因成功重组到枯草芽孢杆菌基因组中, 并且 VP1 蛋白在枯草芽孢杆菌芽孢表面得到有效表达, 不足的是 Western-Blot 中阳性条带显色较浅, 表明 [10,22] VP1 的量较低, 这与已有报道相似将该疫苗通过滴鼻途径免疫小鼠后检测小鼠血清中抗体滴度, 与未免疫组及免疫蛋白组比较,VP1 特异性 IgA IgG 抗体均有显著升高, 差异有统计学意义实验结果表明以芽孢为佐剂粘膜途径免疫 VP1 蛋白能显著提高免疫效率, 更好地刺激了机体的体液免疫反应微量细胞法测定免疫血清的体外中和活性, 免疫重组芽孢组小鼠血清能显著抑制病毒的细胞病变效应, 中和滴度平均为 1 169, 与比较差异有统计学意义实验结果提示 : 芽孢为载体的粘膜疫苗不仅提高特异性抗体的 ELISA 滴度, 同时也显著提高了中和抗体的水平本研究第一次报道了以芽孢为佐剂的 CA16 VP1 亚单位疫苗, 该疫苗通过滴鼻途径免疫小鼠能较好地刺激机体产生特异性中和抗体, 并在体外中和实验中表现出较好的抑制病毒作用, 这为 CA16 疫苗的研制提供了新的思路, 为开发 CA16 粘膜疫苗奠定基础参考文献 [1] KUMAR A, SHUKLA D, KUMAR R, et al. Molecular epidemiological study of enteroviruses associated with encephalitis in children from India[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(11): [2] NI H, YI B, YIN J, et al. Epidemiological and etiological characteristics of hand, foot, and mouth disease in Ningbo, China, [J]. J Clin Virol, 2012, 54(4): [] 钟晓, 张晓丽, 郑振喜等.CVA6 型手足口病影响因素分析. 热带医学杂志, 2015, 15 (5) : [4] 李晓寒, 李一苇, 刘雅娟, 等. 菏泽市 201 年手足口病病毒核酸检测结果分析. 实用预防医学, 2015, 22 (6) : [5] QIAOYUN F, XIONGFEI J, LIHUAN L, et al. Epidemiology and etiological characteristics of hand, foot and mouth disease in Huizhou City between 2008 and 2011[J]. Arch Virol, 201, 158(4): [6] 陈熙, 李勤. 重庆市年手足口病病原流行特征分析. 热带医学杂志, 2015 (10) : [7] DU J, WANG X, HU Y, et al. Changing aetiology of hand, foot and mouth disease in Linyi, China, [J]. Clin Microbiol Infect, 2014, 20(1): [8] 王春荣, 关恒云, 韩秀云, 等年济南地区重症手足口病病原学及流行病学分析 [J]. 实用预防医学, 2015, 22(1): [9] 李琳琳, 何雅晴, 朱俊萍, 等. 柯萨奇病毒 A 组 16 型中国分离株 (Cox.A16 SHZH00-1) 全基因组序列测定及分析 [J]. 病毒学报, 2005, 21(): [10] 李志会, 岳盈盈, 宋楠楠, 等. 制备肠道病毒 71 型黏膜疫苗的初步探索 [J]. 山东大学学报 ( 医学版 ), 2012, 50(2): [11] LI W, ZHANG X, CHEN X, et al. Epidemiology of childhood enterovirus infections in Hangzhou, China[J]. Virol J, 2015, 12:58. [12] LIU Y, DUAN C, ZHANG C, et al. Evaluation of a viral microarray based on simultaneous extraction and amplification of viral nucleotide acid for detecting human herpesviruses and enteroviruses [J]. PLoS ONE, 2015, 10():e [1] 苏明, 倪祥文, 李娟娟, 等. 保定市 EV71 和 CoxA 型所致手足口病病原学分析. 实用预防医学, 2015, 22 (2) : [14] LIU Q, YAN K, FENG Y, et al. A virus- like particle vaccine for coxsackievirus A16 potently elicits neutralizing antibodies that protect mice against lethal challenge[j]. Vaccine, 2012, 0(47): [15] CAI Y, LIU Q, HUANG X, et al. Active immunization with a Coxsackievirus A16 experimental inactivated vaccine induces neutralizing antibodies and protects mice against lethal infection[j]. Vaccine, 201, 1(18): [16] 李晓楠, 罗德炎, 赵忠鹏, 等. 手足口病 CA16 型 VP1 亚单位疫苗的构建制备及免疫原性初步分析 [J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2010, 0(): [17] SHI J, HUANG X, LIU Q, et al. Identification of conserved neutralizing linear epitopes within the VP1 protein of coxsackievirus A16[J]. Vaccine, 201, 1(17): [18] VAN GINKEL F W, NGUYEN H H, MCGHEE J R. Vaccines for mucosal immunity to combat emerging infectious diseases[j]. Emerging Infect Dis, 2000, 6(2): [19] KANG S M, COMPANS R W. Enhancement of mucosal immunization with virus- like particles of simian immunodeficiency virus[j]. J Virol, 200,77(6): [20] RYAN E J, DALY L M, MILLS K H. Immunomodulators and delivery systems for vaccination by mucosal routes[j]. Trends Biotechnol, 2001,19(8): [21] ROSENTHAL K L, GALLICHAN W S. Challenges for vaccination against sexually- transmitted diseases: induction and long- term maintenance of mucosal immune responses in the female genital tract [J]. Semin Immunol, 1997, 9(5): [22] DUC LE H, HONG H A, UYEN N Q, et al. Intracellular fate and immunogenicity of B. subtilis spores[j]. Vaccine, 2004, 22(15-16): 收稿日期 : 编辑 : 王佳燕

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽