前言 RNA 的结构完整性是确保微阵列 cdna 文库构建,RT-PCR 及 RT-qPCR 1 之类实验成功的最重要因素采用微阵列技术及 qpcr 进行基因表达研究越来越得到重视, 这就需要可靠耐用的 RNA 完整性分析方法 2 安捷伦 2100 生物分析仪及其 RNA 完整值 (RIN) 是

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磁屈
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采用安捷伦 2200 TapeStation 系统进行 RNA 质量控制质量指标的评价应用简报核酸分析作者 Arunkumar Padmanaban 安捷伦科技公司印度班加罗尔摘要本应用简报描述了安捷伦 2200 TapeStation 系统与安捷伦 2100 生物分析仪间的性能比较及基准, 后者是 RNA 质量控制的行业标准 2200

1 采用安捷伦 2200 TapeStation 系统进行 RNA 质量控制质量指标的评价应用简报核酸分析作者 Arunkumar Padmanaban 安捷伦科技公司印度班加罗尔摘要本应用简报描述了安捷伦 2200 TapeStation 系统与安捷伦 2100 生物分析仪间的性能比较及基准, 后者是 RNA 质量控制的行业标准 2200 TapeStation 系统可对最多 96 个样品进行自动化分析, 每个样品的分析时间约为 1 分钟本应用简报展示了 2200 TapeStation 系统生成的与 2100 生物分析仪的 RIN 质量评估之间的高度相关性此外还展示了 2200 TapeStation 系统在 RNA 质量评估中所得的高度重现性因此,2200 TapeStation 系统是可靠的 RNA 质量控制系统

2 前言 RNA 的结构完整性是确保微阵列 cdna 文库构建,RT-PCR 及 RT-qPCR 1 之类实验成功的最重要因素采用微阵列技术及 qpcr 进行基因表达研究越来越得到重视, 这就需要可靠耐用的 RNA 完整性分析方法 2 安捷伦 2100 生物分析仪及其 RNA 完整值 (RIN) 是 RNA 质量评估的行业标准最新推出的安捷伦 2200 TapeStation 系统建立在 2100 生物分析仪系统的成功之上, 且分析时间更短, 每个样品成本固定的情况下, 通量灵活性提高, 且具有分析 96 孔板的能力 2200 TapeStation 系统的分析采用现成的消耗品 ScreenTape 预制胶条安捷伦 R6K ScreenTape 及安捷伦高灵敏度 R6K ScreenTape 包括 16 个独立的泳道由于 ScreenTape 消耗品中未使用的泳道可留待随后的分析, 因此在每个样品成本固定的情况下, 通量可为 2 到 96 个样品不等 2200 TapeStation 仪器可自动将制备的样品从 8 联管条中或 96 孔板中上样至 R6K ScreenTape 电泳及成像也是在该仪器中自动完成的 2200 TapeStation 软件可为每个样品提供胶图及电泳图谱结果, 并可在短至 1 分钟内进行查看采用 R6K ScreenTape 及高灵敏度 R6K ScreenTape 进行 RNA 质量分析可得到 RIN 对应值 ( ) 的值可在 1 到 10 之间, 其中 10 代表了最高质量的 RNA 样品本文中, 我们进行了一项对比研究, 比较了 R6K ScreenTape 及高灵敏度 R6K ScreenTape 所得的质量评分与 2100 生物分析仪所得的 RIN 质量指标设备仪器及试剂盒 RNA 6000 Nano 及 RNA 6000 Pico 试剂盒 2100 生物分析仪系统 2200 TapeStation 系统 R6K ScreenTape 及高灵敏度 R6K ScreenTape 试剂盒均来自安捷伦科技 3,4,5 ( 德国瓦尔德布隆 ), 并根据制造商说明使用采用安捷伦科技 ( 美国加利福尼亚州圣克拉拉市 ) 的总 RNA 分离小提试 6 剂盒, 根据制造商指南提取 HEK 293 及 HEP G2 细胞的 RNA 样品总共采用 23 个 RNA 样品进行基准研究, 并分成三种类型 : 降解样品 50 ng/µl 的人 Jurkat 细胞 RNA 样品在 90 C 下进行连续加热降解分别在时间点 t = 及 18 分钟时对 RNA 进行取样, 然后在冰上孵育以终止降解, 并立即处理进行分析样品用 RNA 6000 Nano 及 R6K 试剂盒重复分析六次, 然后稀释 50 倍, 并采用 RNA 6000 Pico 及高灵敏度 R6K 试剂盒重复分析六次提取样品采用含有 10% FBS 及 1% Pen/Strep 的 MEM 培养基在 37 C 及含 5% CO 2 的培养箱中培养两种细胞系,HEK 293( 购自 ATCC, 美国 ATCC) 和 HEP G2 (Connexious 公司, 印度班加罗尔 ) 80% 融合度时收获细胞, 冻存在 80 C 直到进商品化样品一步使用对于 HEK 293, 从细商品化的不同哺乳动物组织的总 RNA 提胞 /ml 的细胞群中提取 RNA, 而对于 HEP 取物来自安捷伦科技 ( 美国圣克拉拉市 ) G2, 从细胞 /ml 的细胞群中提标准品浓度为 1 µg/µl, 包括从人肺脑取 RNA 人胃肠道癌组织中提取的 RNA 卵巢肾上腺心脏结肠胎肝及鼠样品来自 IOB - 生物信息学研究所 ( 印度肝和肾中提取的 RNA 利用经佛波醇肉班加罗尔 ) 这些细胞系和组织的总 RNA 豆蔻酸乙酸酯 (PMA) 处理及未处理的人由 2100 生物分析仪及 2200 TapeStation Jurkat 细胞系和 Hela 细胞系提取的 RNA 系统分析, 均重复六次也来自安捷伦科技 1 µl 样品用于 RNA 6000 Nano 及 R6K 试剂盒,2 µl 用于所有的分析均在不同的三天内重复三次 RNA 6000 Pico 及高灵敏度 R6K ScreenTape 试剂盒每个样品在 50 ng/µl 浓度下用 RNA 6000 Nano 及 R6K 试剂盒重复分析四次, 然后稀释成 1000 pg/µl, 并采用 RNA 6000 Pico 及高灵敏度 R6K 试剂盒重复分析四次 2

结果和讨论 A RNA 分析商品化样品降解样品和提取样品组由 2200 TapeStation 系统进行分析样品制备后上样至 2200 TapeStation 系统图 1A 说明了在 R6K ScreenTape 上分析 4000 2000 800 600 400 HeLa- PMA HeLa+ PMA Jurkat 28S rrna 18S rrna 不同的 RNA 样品所得的结果

3 结果和讨论 A RNA 分析商品化样品降解样品和提取样品组由 2200 TapeStation 系统进行分析样品制备后上样至 2200 TapeStation 系统图 1A 说明了在 R6K ScreenTape 上分析 HeLa- PMA HeLa+ PMA Jurkat 28S rrna 18S rrna 不同的 RNA 样品所得的结果胶图表 200 示每个样品的分离谱, 显示了 28S 18S RNA 小 rrna 及下位内标每个样品的 RNA 质量由值表示, 如胶图下数字所示图 1B 展示了经 PMA 处理的 Hela 细胞所得总 RNA 的代表性电泳图谱其中对 28S 及 18S 峰进行了标注 50 B S 28S [FU] MW [nt] 图 1 利用安捷伦 2200 TapeStation 系统进行的 RNA 分析 A) 胶图展示了不同的 RNA 样品 B) 经 PMA 处理的 HelA 细胞所得总 RNA 的代表性电泳图谱, 其中标注了 18/28S 峰 3

4 加热降解 RNA 分析通过分析加热降解的 RNA 样品, 评价 2200 TapeStation 系统在降解 RNA 的质量评分中的性能采用 R6K ScreenTape 及高灵敏度 R6K ScreenTape 分析降解的 Jurkat 细胞总 RNA 样品, 并与 2100 生物分析仪系统所得结果进行比较 2200 TapeStation 及 2100 生物分析仪系统的分析均发现随着时间的进展,28S 峰逐步降解, 降解产物逐步增加图 2 展现了加热降解 RNA 样品的电泳叠加图谱, 由 R6K ScreenTape 及 RNA 6000 Nano 试剂盒分析所得 A [FU] T = 0 = 9.7 T = 5 = 6.9 T = 9 = 4.6 T = 18 = 3.7 B T = 0 RIN = 10 T = 5 RIN = 6.7 T = 9 RIN = 4.4 T = 18 RIN = 3.8 [FU] [s] 图 2 加热降解的 Jurkat 细胞 RNA 样品的电泳叠加图谱 A) R6K ScreenTape( 安捷伦 2200 TapeStation) 所得结果 B) RNA 6000 Nano 试剂盒 ( 安捷伦 2100 生物分析仪 ) 所得结果 4

5 RIN 及相关性 RNA 样品, 包括商品化样品降解样品及提取样品均由 2100 生物分析仪及 2200 TapeStation 系统进行分析取每个样品重复分析的平均 R I N 值, 并将其与 TapeStation 所得的平均值进行比较 ( 图 3) 该分析说明两个系统具有高度正相关,RNA 6000 Nano 试剂盒与 R6K ScreenTape 间的 R 2 值为 , 而 RNA 6000 Pico 试剂盒与高灵敏度 R6K ScreenTape 间的 R 2 值为通常 R6K ScreenTape 所得 RIN 的偏差 <4%, 而高灵敏度 R6K ScreenTape 所得偏差 <7% A R6K y = x R² = RIN RNA 6000 Nano R6K RNA 6000 Nano - RIN 单因素方差分析指出 RNA 6000 Nano 试剂盒与 R6K ScreenTape 间 [F (5, 132) = 0.104, p = 0.991], 及 RNA 6000 Pico 试剂盒与高灵敏度 R6K ScreenTape 间 [F (5, 132) = 0.295, p = 0.914] 均无显著性差异 B 10.0 y = x R² = RIN RNA 6000 Pico HS R6K 7.0 HSR6K RNA 6000 Pico - RIN 图 3 由商品化提取及降解的 RNA 样品所得值绘制的相关性曲线 A) RNA 6000 Nano 及 R6K 试剂盒所得的 RIN 及值图 B) RNA 6000 Pico 及高灵敏度 R6K 试剂盒所得的 RIN 及值图 5

6 重现性整理对照 30 个 RNA 6000 Nano 芯片与 27 个 R6K ScreenTape 的结果, 以及 36 个 RNA 6000 Pico 芯片与 27 个高灵敏度 R6K ScreenTape 的结果, 以此通过与 2100 生物分析仪系统比较, 对 2200 TapeStation 系统的重现性进行评估计算众多样品及不同降解水平得到的 RIN 及值的重现性 CV 分别取单个芯片或 ScreenTape 所得样品的平均值, 以及多个芯片或 ScreenTape 的平均值, 计算分析内及分析间精密度表 1 列出了两个系统所得的 %CV 相比 2100 生物分析仪系统,2200 TapeStation 系统的精密度更高, 这是因为自动化样品处理及上样可降低人工移液的误差分析指标表 1 RIN 及的精密度 RNA 6000 Nano R6K ScreenTape % CV 均值 RNA 6000 Pico 分析内精密度 < 3% < 2% < 4% < 2% 分析间精密度 < 3% < 2.5% < 6% < 3% 结论安捷伦 2200 TapeStation 系统为 RNA 样品的分析提供了一种简便易用的系统, 人工干预可降至最低 R6K 及高灵敏度 R6K ScreenTape 经证实可精确可靠地进行 RNA 质量控制, 可媲美安捷伦 2100 生物分析仪系统 2200 TapeStation 系统还在样品重现性方面展示出极高的精密度高灵敏度 R6K ScreenTape 因此, 在 RNA 质量评估方面,2200 TapeStation 系统可提供与行业标准 2100 生物分析仪系统媲美的性能高通量兼容性简单易用最少人工干预, 以及不论通量大小, 每个样品的成本固定, 这些新增的优点结合起来, 使 2200 TapeStation 系统成为 RNA 质量评估的理想之选 6

7 参考文献 1. RNA integrity and the effect on the real-time qrt-pcr performance, Mol.Aspects Med. 2-3, , The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments, Clin.Chem.4, , Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide ( 安捷伦 RNA 6000 Nano 试剂盒说明 ), Agilent Technologies (p/n G ) 4. Agilent RNA 6000 Pico Kit Guide ( 安捷伦 RNA 6000 Pico 试剂盒说明 ), Agilent Technologies (p/n G ) 5. Agilent R6K ScreenTape System Quick Guide( 安捷伦 R6K ScreenTape 系统快速指南 ),Agilent Technologies (p/n G ) 6. Agilent Total RNA Isolation Mini Kit Guide( 安捷伦总 RNA 分离小提试剂盒指南 ),Agilent Technologies (p/n ) 7

8 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 3 月 1 日, 中国出版 CHCN

技术详情使用配有 Agilent TapeStation 分析软件 (A 版 ) 的 Agilent 4200 TapeStation 系统 RNA ScreenTape( 部件号 67-76) 和试剂 ( 部件号和 67-78), 以及安捷伦高灵敏度 RNA Scree

技术详情使用配有 Agilent TapeStation 分析软件 (A 版 ) 的 Agilent 4200 TapeStation 系统 RNA ScreenTape( 部件号 67-76) 和试剂 ( 部件号和 67-78), 以及安捷伦高灵敏度 RNA Scree 技术概述采用 RNA ScreenTape 分析法进行 DV 200 评估作者 Eva Graf 安捷伦科技有限公司 Waldbronn, Germany 摘要 RNA 测序文库制备工作流程的成功与否在很大程度上取决于 RNA 起始材料的质量采用 Agilent RNA ScreenTape 分析法获得的 RNA 完整值当量 (RIN e ) 是一种评估标准 RNA 测序的样品完整性的可靠且可重现的指标