采用高级微生物基因分型系统对食品中单核细胞增生李斯特菌进行同源性分析 曾静, 等 533 were 1 / 2a serotype, except two of them were 3a serotype. Conclusion DiversiLab system typing results re

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1 532 CHINESE JOURNAL OF FOOD HYGIENE 2014 年第 26 卷第 6 期 耐药性研究 [J]. 实用预防医学,2011,18(6): [ 8 ] 吕素玲, 韦程媛, 姚雪婷, 等 年广西食品中沙门菌污染状况和血清型分布及耐药谱的研究 [ J]. 应用预防医学, 2012,18(3): [ 9 ] 陈玲, 张菊梅, 杨小鹃, 等. 南方食品中沙门菌污染调查及分型 [J]. 微生物学报,2013,53(12): [10] 席昭雁, 张阿峰, 吴荣, 等. 陕西省食品中沙门菌监测研究 [J]. 中华疾病控制杂志,2011,15(8): [11] 陈玉贞, 邵坤, 关冰, 等 年山东省食源性沙门菌血清分型及药敏分析 [J].,2012,24(1):9 12. [12] 马妮, 孙葳, 郑洪, 等. 辽宁省食源性沙门菌血清分布及耐药分析 [J]. 中国卫生检验杂志,2013,15(23): [13] Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance for foodborne disease outbreaks United States, 2008 [ J ]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep,2011,60(35): [14] Analysis of the baseline survey on the prevalence of Salmonella in holdings with breeding pigs in the EU, Part A:Salmonella prevalence estimates [ J ]. European Food Safety Authority Journal,2009,7(12): [15] Boxrud D, Monson T, Stiles T, et al. The role, challenges, and support of PulseNet laboratories in detecting foodborne disease outbreaks[j]. Public Health Reports,2010,125(Suppl 2): [16] 梅玲玲, 罗芸, 叶菊莲, 等. 浙江省 209 株沙门菌 PFGE 指纹图谱研究 [J]. 中国卫生检验杂志,2009,11(19): [17] 王岚, 贾华云, 张红, 等. 湖南省食源性德尔卑沙门菌耐药谱及 PFGE 分型研究 [J]. 实用预防医学,2013,8(20): 论著 采用高级微生物基因分型系统对食品中单核细胞增生 李斯特菌进行同源性分析 曾静 1 1,, 周雪婷 2, 张锡全 1, 张琳 3, 张西萌 1, 魏海燕 1, 周熙城 1, 马丹 1 2, 倪元颖 (1. 北京出入境检验检疫局, 北京 ; 2. 中国农业大学, 北京 ; 3. 河北出入境检验检疫局, 河北石家庄 ) 摘要 : 目的采用高级微生物基因分型系统 ( DiversiLab 系统 ) 对食品中单核细胞增生李斯特菌进行基因型分析, 将分型结果与血清型和菌株的耐药性进行比对研究 方法 DiversiLab 系统是基于 rep PCR 原理对微生物进行分型, 将分型结果与菌株的血清型进行比较研究, 同时对菌株的耐药性与 rep PCR 型别进行研究 结果采用 DiversiLab 系统将 46 株单核细胞增生李斯特菌分为 9 个型别 A ~ I 血清型为 1 / 2a 的分离株以 A 型为主, 所测试的 6 株血清型为 4b 的分离株均为 H 型 ;14 株呋喃妥因耐受菌株 9 株为 A 型 1 株为 B 型 3 株为 C 型 1 株为 F 型, 除 2 株血清型为 3a 外, 其余均为 1 / 2a 结论 DiversiLab 系统分析结果, 揭示了 46 株从食品中分离的单增细胞增生李斯特菌间的亲缘关系,rep PCR 分型结果与 H 抗原结合位点存在一定联系, 呋喃妥因耐受菌株的 DNA 指纹图谱相似度高, 与耐药基因有关 关键词 : 单核细胞增生李斯特菌 ; DiversiLab 系统 ; 同源性分析 ; 食源性致病菌中图分类号 :R155;R378 文献标志码 :A 文章编号 : (2014) DOI: / j. cjfh Typing Listeria monocytogenes isolated from food by DiversiLab system ZENG Jing, ZHOU Xue ting, ZHANG Xi quan, ZHANG Lin, ZHANG Xi meng, WEI Hai yan, ZHOU Xi cheng, MA Dan, NI Yuan ying ( Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing , China) Abstract: Objective L monocytogenes isolates were typed by DiversiLab system. The result was compared with the results of serotype and the antibiotic resistance. Methods The DiversiLab system was based on the principle of rep PCR. Results The 46 isolates were classified as nine types, type A to I. The 1 / 2a serotype isolates mainly belonged to A type. Six 4b serotype isolates belonged to H type. Among 14 nitrofurantoin resistance isolates, nine of them were A type, one isolate was B type, three isolates were C type, and one isolate was F type. Most of the nitrofurantoin resistance isolates 收稿日期 : 基金项目 : 国家质检总局公益性行业科研专项 ( ) 作者简介 : 曾静女研究员研究方向为食品微生物检验方法 E mail:jingzeng_cn@ 163. com

2 采用高级微生物基因分型系统对食品中单核细胞增生李斯特菌进行同源性分析 曾静, 等 533 were 1 / 2a serotype, except two of them were 3a serotype. Conclusion DiversiLab system typing results revealed the genetic characters and relationship of 46 foodborne L. monocytogenes. The typing results related to the H sites of serotype. The similarity of 14 nitrofurantoin resistance isolates was high, and related to anti nitrofurantoin resistance genes. Key words: Listeria monocytogenes; DiversiLab system; homologous analysis; foodborne pathogen 单核细胞增生李斯特菌 (L monocytogenes) 属于 李斯特菌属, 为革兰氏阳性短杆菌 其在自然界中 分布广泛, 可以在低温 酸性 高盐的环境中生 长 [1-2], 抗逆性强, 主要引起人类败血症 脑膜炎 肺 炎 流产等多种疾病 其易感人群多为 60 岁以上老 人 孕妇 新生儿及患有免疫缺陷症的人群 该菌 的致病性强, 致死率高达 20% ~ 30% [3] 细菌基因组重复序列 PCR 技术 (rep PCR) 是一 种细菌基因组指纹分析方法, 通过扩增细菌基因组 中广泛分布的短重复序列, 对电泳条带进行比较分 析, 揭示基因组间的差异 [4-6] 本研究采用基于 rep PCR 原理的高级微生物基因分型系统 (DiversiLab) 对从食品中分离的 46 株单核细胞增生 李斯特菌进行基因分型, 并将分型结果与分离株的 血清型和耐药性进行比较研究 1 材料与方法 材料 46 株单增细胞增生李斯特菌均分离自食品, 是 北京出入境检验经法国生物梅里埃有限公司的 VITEK 鉴定卡进行鉴定, 菌株详细信息见表 1 表 1 46 株单增细胞增生李斯特菌 Table 1 Origins of 46 L. monocytogenes strains 菌株编号菌株数 / 株 BJ LMO 3,6,7,17,19,20,21,24,25, 26,30,32,34,36,38,39,40,41,42, 43,44,45,50,51,55,56,58,59,60, 61,64,65,66 蚌 BJ LMO 5 1 冻牛筋串 BJ LMO 8 1 BJ LMO 11,37,46 3 猪肉 BJ LMO 18 1 冻肋排 BJ LMO 31 1 金枪鱼头 BJ LMO 35 1 鳌龙虾 BJ LMO 47 1 冻牛肉 BJ LMO 48,54 2 多宝鱼 BJ LMO 49 1 海鲈鱼 BJ LMO 主要仪器与试剂 Agilent Bioanalyzer 2100 型 DiversiLab 分型系统 ( 美国 Agilent),PE 9700 型 PCR 仪 ( 美国 life) VITEK 生化鉴定卡 Ultra Clean Microbial DNA 提取试剂盒 rep PCR 指纹图谱试剂盒 DNA Chip Reagents and Supplies 试剂盒 微流体芯片均购自法 33 国梅里埃 1 2 方法 DNA 提取挑选单个菌落于羊血琼脂培养基上 37 过夜培养 用 MO BIO Ultra Clean Microbial DNA 提取试剂盒提取细菌 DNA 按照说明书推荐步骤提取 DNA,DNA 浓度控制在 25 ~ 50 ng / μl rep PCR 分型以提取的单增细胞增生李斯特氏菌 DNA 为模版, 使用 DiversiLab 配套的 rep PCR 试剂盒, 按照说明书进行 PCR 扩增,PCR 循环参数为 :94 2 min; s,50 30 s,70 90 s,35 个循环 ;72 3 min, 反应体积为 25 μl PCR 扩增产物注入微流体芯片, 放入 DiversiLab 分型系统进行电泳, 其自动生成分析报告 DiversiLab 根据 Pearson 相关系数确定菌株间的距离矩阵, 用非加权配对算术平均法 (UPGMA) 建立树状图 2 结果 2 1 单核细胞增生李斯特氏菌 rep PCR 分型结果利用 DiversiLab 系统, 相似度系数为 94% 时, 46 株单核细胞增生李斯特菌被分为 4 个群 ; 相似度系数为 97% 时, 进一步分为 9 个型别即 A ~ I 型 其中,1 群包括 A 型 (21 株 ) B 型 (3 株 ) 和 C 型 (5 株 ), 共 29 株 ;2 群包括 D 型 (1 株 ) E 型 (1 株 ) 和 F 型 (2 株 ), 共 4 株 ;3 群仅 G 型,1 株 ;4 群包括 H 型 (10 株 ) 和 I 型 (2 株 ), 共 12 株, 见图 单核细胞增生李斯特菌 rep PCR 分型结果与血清型根据鞭毛 (H) 抗原和菌体 ( O) 抗原, 单核细胞增生李斯特菌分为 13 个血清型, 分别是 1 / 2a 1 / 2b 1 / 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4ab 4c 4d 4e 和 7 [7] 根据我们实验室以前的研究结果, 本研究采用的 46 株单核细胞增生李斯特菌分离株的血清型包括 1 / 2a 4b 1 / 2b 1 / 2c 3a 和 4d [8] 对比血清分型和分子分型结果显示, 血清分型将 46 株单核细胞增生李斯特菌划分为 6 个血清型,rep PCR 分子分型以相似度系数 97% 将其划分为 9 个基因型, 相同血清型可被分为不同的基因型 值得注意的是, 主要的血清型中,1 / 2a 以 A 型为主 ; 4b 以 H 型为主 ; 其他血清型中, 不同基因型分布不一, 见表 2

3 INESE JOURNL OF FOOD YGIENE 534 图1 2 3 46 株单核细胞增生李斯特菌 rep PR 分子分型树状图及虚拟凝胶图 Figure 1 Rep PR dendrogram and gel images for 46 L monocytogenes strains 单核细胞增生李斯特菌耐药性和 rep PR 分 sequence based PR rep PR 是在随机引物 PR 根据本实验室以前的研究结果 本研究采用的 利用细菌基因组中广泛分布的 小的 高度保守的 子分型 菌株中有 14 株对呋喃妥因存在耐药性 9 rep PR 分子分型结果显示 其相似度在 91 0 99 6 之 间 以相似度 94 为分割线 13 株 92 9 呋喃 妥因耐受菌株属于 1 群 以相似度 97 为分割线 9 株 64 3 呋喃妥因耐受菌株属于 型 1 株 型 3 株 21 4 型 另有 1 株为 F 型 见图 2 通过对比 14 株呋喃妥因耐受菌株 DN 指纹图 谱发现 rep PR DN 扩 增 片 段 间 只 有 少 数 1 2 条 条带存在细微差异 见图 3 4 3 2014 年第 26 卷第 6 期 讨论 DiversiLab 系统基因组重复序列 PR repetitive 基础上发展的 DN 指纹图谱分析的一种新方法 特点且重复的寡居核苷酸序列为引物扩增 DN 并 通过电泳条带比较分析 揭示基因组间的差异和判 定细菌 间 的 亲 缘 关 系 10 DiversiLab 系 统 是 基 于 rep PR 技术发展出的一种新的分子分型方法 通 过 rep PR 扩增细菌基因组的非编码重复序列后根 据扩增片段长度差异 形成由多条带组成的 强弱 不一的 rep PR DN 指纹图谱 从而比较菌株间的 相似性 该系统已被逐渐应用于分子流行病学研 究 目前国内的相关报道尚不多见 可重复性强 数据标准化是 DiversiLab 系统最大的优势 由于采 用了标准化的操作 高分辨率的微流体芯片和荧光 检测系统 及 统 一 的 数 据 处 理 软 件 克 服 了 重 复 性

4 采用高级微生物基因分型系统对食品中单核细胞增生李斯特菌进行同源性分析 曾静 等 表2 菌株编号 J LMO 3 J LMO 5 J LMO 6 J LMO 7 J LMO 8 J LMO 11 J LMO 17 J LMO 18 J LMO 19 J LMO 20 J LMO 21 J LMO 24 J LMO 25 J LMO 26 J LMO 30 J LMO 31 J LMO 32 J LMO 34 J LMO 35 J LMO 36 J LMO 37 J LMO 38 J LMO 39 Table 2 蚌 冻牛筋串 猪肉 冻肋排 金枪鱼块 535 46 株单核细胞增生李斯特氏菌血清分型和分子分型结果 Serotype and genotyping results of 46 L monocytogenes strains 血清型 基因型 D F 菌株编号 J LMO 40 J LMO 41 J LMO 42 J LMO 43 J LMO 44 J LMO 45 J LMO 46 J LMO 47 鳌龙虾 J LMO 48 冻牛肉 J LMO 49 多宝鱼 J LMO 50 J LMO 51 J LMO 54 冻牛肉 J LMO 55 J LMO 56 J LMO 58 J LMO 59 J LMO 60 基因型 J LMO 62 海鲈鱼 J LMO 64 J LMO 65 J LMO 66 I G 1 2c I F 4d J LMO 61 图3 血清型 E 9 株 型呋喃妥因耐受菌株 DN 指纹图谱对比图 Figure 3 Overlay of rep PR fingerprints of genomic DN for 9 out of 9 F300 resistant L monocytogenes strains belonging type 图2 14 株呋喃妥因耐受菌株 rep PR 相似度矩阵图 Figure 2 Rep PR similarity analysis ziggurat of 14 L monocytogenes resistant strains 差的缺 点 且 不 同 操 作 者 对 结 果 分 析 的 差 异 性 小 11 而且不同地区的数据上传到中心数据库 便 于不同实验室间的结果比较 本实验室采用 Diversilab 系统 对 46 株从不同 食品中分离的单核细胞增生李斯特氏菌进行了基 因分型 相似度系数为 94 时 46 株单核细胞增生 李斯特菌被分为 4 个群 相似度系数为 97 时 分 为 9 个型别 1 群包括 和 型 包含 29 株分离 图4 5 株 和 F 型呋喃妥因耐受菌株 DN 指纹 Figure 4 图谱对比图 Overlay of rep PR fingerprints of genomic DN for 5 of 14 F300 resistant L monocytogenes strains belonging and F type

5 536 CHINESE JOURNAL OF FOOD HYGIENE 2014 年第 26 卷第 6 期 株, 其中 26 株从进口中分离 ;2 群包括 D 型 (1 株 ) E 型 (1 株 ) 和 F 型 (2 株 ), 共 4 株 ;3 群仅 G 型,1 株 ;4 群包括 H 型 (10 株 ) 和 I 型 (2 株 ), 共 12 株 本文对 rep PCR 分型结果与血清型之间的关系 进行了分析 对 46 株单核细胞增生李斯特菌进行 血清分型, 通过比较研究发现 21 株 A 型分离株有 18 株的血清型是 1 / 2a, 另外 3 株分离株的血清型为 3a 和 1 / 2b, 有 16 株分离株为 A 型, 且血清型为 1 / 2a 的菌株来自进口 1 / 2a 1 / 2b 和 3a 血清 型 O 抗原结合位点不尽相同, 但它们有相同的 H 抗 原结合位点 ( A 和 B);6 株血清型为 4b 的分离株, rep PCR 型别为 H 型, 其他 4 株分离株的血清型为 1 / 2a 1 / 2b 和 4d, 血清型 1 / 2b 4b 和 4d 的 H 抗原的 结合位点完全相同 因此, 推论 rep PCR 分型方法 [12] 和 H 抗原结合位点存在一定联系 Brosch 等对 176 株单核细胞增生李斯特菌株进行 PFGE 分型和 血清型结果之间的分析结果表明,PFGE 分型结果 与 H 抗原密切相关 比较分析了 14 株单核细胞增 生李斯特氏菌呋喃妥因耐受菌株的 rep PCR 图谱 9 株 A 型 DNA 指纹图谱及其相似 ( 图 3),5 株其他 基因型的 DNA 指纹图谱的相似度也很高 ( 图 4), 可 能与这些菌株具有相同的耐药基因有关 综上所述, 采用 DiversiLab 分型系统对从食品 中分离的 46 株单核细胞增生李斯特菌进行基因分 型 共分为 4 个群,9 个基因型 ; 将分型结果与血清 型鉴定结果进行了比较,rep PCR 分型结果与 H 抗 原结合位点存在一定联系 ; 呋喃妥因耐受菌株的 DNA 指纹图谱相似度极高, 与耐药基因有关 参考文献 [ 1 ] Duche O, Trempulet F, Glaser P, et al. Salt stress proteins induced in Listeria monocytogenes[ J]. Appl Environ Microbial, 2002,68(4): [ 2 ] Sergelidis D, Abrahim A. Adaptive response of Listeria monocy togenes to heat and its impact on food safety[ J]. Food Control, 2009,20(1):1 10. [ 3 ] Mead P S, Slutsker L, Dietz V, et al. Food related illness and death in the United States[ J]. Emerg Infect Dis,1999,5 (5): [ 4 ] 许龙岩, 袁慕云, 林文丽, 等. DiversiLab 系统沙门氏菌分子分型评价 [J]. 食品科学,2012,33(3): [ 5 ] 劳华均, 李如松, 孙萍, 等. DiversiLab 系统用于食品中单增李斯特菌同源性分析 [J]. 食品工业,2013,33(8): [ 6 ] 刘静宇, 凌莉, 陈思强, 等. 用 DiversiLab 系统对食品中分离的金黄色葡萄球菌进行分型溯源研究 [ J]. 食品科技,2012,37 (12): [ 7 ] Doumith M, Cazalet C, Simoes N, et al. New aspects regarding evolution and virulence of Listeria monocytogenes revealed by comparative genomics and DNA arrays[ J]. Infect Immun,2004, 72(2): [ 8 ] 周雪婷, 张西萌, 曾静. 食品中单核细胞增生李斯特氏菌血清型分析 [J]. 中国公共卫生,2012,28(12 增刊 1): [ 9 ] 周雪婷, 张西萌, 曾静. 食品中单核细胞增生李斯特氏菌耐药性分析 [J]. 中国公共卫生,2012,28(12 增刊 1):1 3 [10] 金莉莉, 王秋雨, 侯潇. ERIC PCR 技术在李斯特氏菌种 菌株鉴定中的应用 [J]. 遗传,2003,25(2): [11] Wise M G,Siragusa G R,Plumblee J,et al. Prediciting Samonella enterica serotypes by repetitive sequence based PCR [ J ]. Microbiol Methods,2009,76(1): [12] Brosch R,Brett M,Catimel B,et al. Genomic fingerprinting of 80 strains from the WHO multicenter international typing study of Listeria monocytogenes via pulsed field gel electrophoresis ( PFGE) [ J]. International Journal of Food Microbiology,1996, 32(3): 欢迎订阅 2015 年 肉类研究 杂志 肉类研究 杂志创刊于 1987 年, 主办单位为中国肉类食品综合研究中心 肉类研究 是经国家新闻出版总署正式批准, 面向国内外公开发行的中文科技期刊, 国际标准刊号 :ISSN , 国内统一刊号 :CN / TS 月刊 本刊自 2011 年开始由 食品科学 杂志的编辑团队全新打造,2011 ~ 2013 年连续入选 中国科技核心期刊, 影响因子持续上升 本刊还被 中国核心期刊 ( 遴选 ) 数据库 中国期刊全文数据库 中文科技期刊数据库 中国期刊网 等数据库全文收录 肉类研究 融学术研究 产品开发和技术创新为一体, 致力于肉类科研和技术推广, 构筑学者交流平台, 培养科技研发人才, 记录行业发展历程, 展示国际前沿成果, 对推动中国肉类行业健康 快速发展具有重要作用 本刊主要面向全国各大高等院校 科研院所 各级党政机关 企事业单位的广大专家学者 工程技术人员 硕士博士研究生 管理人员等 2015 年 肉类研究 杂志继续改版升级 : 政策法规 国际科技资讯 优质实业 名师论坛 肉类联盟专栏等新创栏目以服务企业 贴近读者为目标, 内容更加精彩 ; 基础研究 加工工艺 质量安全 包装贮运 分析检测 专题论述等科研论文将更具权威与实用性, 引领肉类行业科技创新发展 发行部常年办理邮购, 月刊, 定价 :15 元 / 册, 全年定价 180 元现金订阅 : 直接通过邮局汇款至北京市西城区禄长街头条 4 号 肉类研究 编辑部收 邮政编码 : 手机 : 联系电话 : / 47 / 48 / 49 / 50 转 8010 传真 : 联系人 : 李向芳网址 :www. chnfood. cn 电子邮箱 :chnfood@ chnfood. cn 银行汇款 : 账户 : 中国食品杂志社开户行 : 工行阜外大街支行账号 :

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