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月娄
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1 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (1): 靛玉红对 ATP 引起的巨噬细胞吞噬抑制 ROS 产生和细胞死亡的影响 * 满媛, 王宇翔, 朱舒燕, 杨霜, 赵丹, 胡芬, 李俊英 ( 南开大学物理学院生物物理系, 天津 ) 摘要 : 为研究靛玉红对 ATP 引起的巨噬细胞免疫反应的影响, 采用中性红摄入法检测细胞吞噬功能, 用 MTT 法检测细胞活力, 通过 DHE 探针检测 ROS 的产生结果表明 : 细胞外 ATP 可抑制巨噬细胞吞噬导致细胞死亡并促进 ROS 产生, 靛玉红对 ATP 引起的以上免疫反应有抑制作用为了解靛玉红的作用机制, 进一步研究其对 ATP 引起的 [Ca 2+ ] i 升高和 P2X7 受体介导的膜通透性增加的影响结果显示 : 靛玉红可降低 ATP 引起的 [Ca 2+ ] i 升高, 抑制 ATP 诱发的 EB 进入结果提示, 靛玉红对 P2X7 的活化有阻断作用, 其对 ATP 引起的免疫反应的抑制效果可能是通过抑制 P2X7 受体实现的关键词 : 靛玉红 ; ATP; 巨噬细胞 ; 免疫反应 ; P2 受体中图分类号 : R963 文献标识码 : A 文章编号 : (2012) Indirubin inhibits ATP-induced phagocytosis attenuation, ROS production and cell death of macrophages MAN Yuan, WANG Yu-xiang, ZHU Shu-yan, YANG Shuang, ZHAO Dan, HU Fen, LI Jun-ying * (Department of Biophysics, School of Physics, Nankai University, Tianjin , China) Abstract: This study is to investigate the effects of indirubin on ATP-induced immune responses of macrophages. For this, neutral red dye uptake method was used to test phagocytosis, MTT assay was used for measuring cell death, and reactive oxygen species (ROS) was tested with fluorescent probe DHE. The data showed that extracellular ATP attenuated phagocytosis, induced cell death and increased ROS production, and these effects were restored by pre-treating with indirubin. This result suggested that indirubin blockade the effects of ATP on macrophages, because extracellular ATP-induced effects are dependent on P2 receptors, in particular P2X7 receptors. Furthermore, the effects of indirubin on the activation of P2 receptors were tested, in particular P2X7 receptors. The data showed that indirubin significantly decreased ATP-induced, P2 receptors mediated intracellular Ca 2+ concentration ([Ca 2+ ] i ) rise and inhibited P2X7 receptor-based ethidium bromide (EB) dye uptake. These results suggested the inhibitory effects of indirubin on the activation of P2X7 receptors, which may underlying the effects on ATP induced ROS production, phagocytosis attenuation and cell death of macrophages. Key words: indirubin; ATP; macrophage; immune response; P2 receptor 细胞损伤死亡缺氧炎症等病理条件可引起收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 中央高校基本科研业务费专项资金资助 ( ). * 通讯作者 Tel: , Fax: , jyli04@nankai.edu.cn 细胞内的 ATP 释放到组织间, 细胞外 ATP 作为一种危险信号, 可激活机体的免疫系统, 引起多种免 [1, 疫反应 2] 胞外 ATP 通过激活膜上的 P2 受体而产生作用, P2 受体包括 P2X 和 P2Y 两类, P2X 为 ATP 门控的阳离子通道, 包括 7 种亚型 (P2X1-7), P2Y 为

2 46 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (1): G 蛋白偶联受体免疫系统表达多种 P2 受体, 其中 [3, P2X7 亚型在巨噬细胞中高表达 4] 研究表明, 胞外 ATP 可通过活化 P2X7 等 P2 类受体调节巨噬细胞的免疫反应, 如 : 引起细胞因子分泌 [5] 促进活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 和一氧化氮 (NO) 的产生 [6] [7, 抑制细胞吞噬等 8], 另外高浓度的 ATP 还会导致细胞死亡 [9] 靛玉红是从青黛中分离出的吲哚类化合物, 是青黛大青叶板蓝根等中药的有效成分, 具有抗肿瘤抗炎的生物学效应 [10 13], 应用于慢性粒细胞白血病的治疗中 [14] 关于靛玉红的作用机制, 目前研究主要集中在抗肿瘤方面, 有关抗炎方面的报道较少, 有研究显示靛玉红对自身免疫系统疾病有治疗作用 [15] 为深入了解靛玉红抗炎作用的机制, 本文以巨噬细胞为材料, 首先研究了靛玉红对 ATP 引起的吞噬抑制产生 ROS 等免疫反应的影响, 在此基础上, 进一步探讨了靛玉红对 P2 类受体, 特别是 P2X7 受体的作用材料与方法实验材料雄性 Wistar 大鼠, 体重 250~300 g, 由中国医学科学院放射医学研究所提供 ( 二级 ) 含酚红 DMEM 培养基和胎牛血清购自美国 Gibco 公司 ; 三磷酸腺苷 (ATP) 溴化乙锭 (ethidium bromide, EB) 噻唑蓝 (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]- 2, 5-diphenyltetrazolium bromide, MTT) 及二氢乙锭 (dihydroethidium, DHE) 均购自美国 Sigma 公司 ; Fura-2/AM 购于 Biotium 公司 ; 中性红购于天津市大茂化学试剂厂 ; 靛玉红 (indirubin) 购自中国药品生物制品检定所 ; 其他试剂为国产分析纯大鼠腹腔巨噬细胞的提取和培养大鼠腹腔巨噬细胞的提取参照文献 [16] 进行, 细胞中加入含 10% 血清的 DMEM 培养基, 置于 37 5% CO 2 条件下培养 4 h 贴壁, 去除不贴壁的细胞, 于 37 再培养 12 h 后用于实验巨噬细胞吞噬功能的检测采用中性红摄入的方法检测巨噬细胞的吞噬作用细胞按每孔个接种于 96 孔板, 每孔加培养基 100 μl 每组实验设置 5 个复孔 ( 以下相同 ) 同时加入 ATP 和中性红, 使每孔中性红的终浓度均为 0.1%, ATP 的终浓度分别为和 1 mmol L 1, 将细胞于 37 下孵育 30 min, 弃上清液, 用 PBS 洗 3 次, 去掉细胞外的中性红后, 每孔加入 100 μl 的裂解液 (50% 乙酸 + 50% 乙醇 ) 作用 15 min, 然后用酶联仪测定 550 nm 处的光吸收度 (A 550 nm ) 值对于靛玉红组, 在细胞培养液中分别加入终浓度为和 57 μmol L 1 的靛玉红, 37 处理 2 h 后, 再加入 1 mmol L 1 ATP 和 0.1% 中性红, 参照上述步骤处理, 以不加靛玉红的细胞作为对照细胞内 ROS 的检测利用 DHE 荧光探针检测巨噬细胞内的 ROS 将细胞接种于 96 孔板中, 在培养液中分别加入终浓度为和 1 mmol L 1 的 ATP, 于 37 5% CO 2 下作用 40 min, 弃上清液, 用 PBS 洗 3 次, 然后加入 5 μmol L 1 DHE, 37 染色 30 min 后, 检测 488 nm 波长激发下细胞的荧光强度对于靛玉红组, 在加入 1 mmol L 1 ATP 的同时加入靛玉红, 终浓度分别为和 57 μmol L 1, 按上述步骤检测细胞内 ROS 的量, 不加靛玉红的细胞作为对照细胞活力的检测采用 MTT 法检测细胞存活数量实验步骤参照文献 [17], 首先检测 ATP 对巨噬细胞存活的影响, 分别加入终浓度为 1 2 和 5 mmol L 1 的 ATP, 37 下作用 30 min 后, 通过 MTT 反应检测细胞存活情况, 以不加 ATP 的作为对照靛玉红组则首先加入和 57 μmol L 1 的靛玉红, 37 下孵育 3 h, 然后再加入 5 mmol L 1 ATP, 作用 30 min, 用 MTT 法检测活细胞数量, 以不加靛玉红的细胞作为对照细胞内 Ca 2+ 浓度变化的检测用 Fura-2/AM 为探针标记细胞内 Ca 2+ 浓度 ([Ca 2+ ] i ), Fura-2/AM 在 340 和 380 nm 波长激发下的荧光强度的比值 (F 340 /F 380 ratio) 与细胞内自由 Ca 2+ 的浓度呈正比将巨噬细胞铺于底部置有盖玻片的 6 孔板中, 每孔加入含 Fura-2/ AM (3 μg L 1 ) 的 HBSS 1 ml, 避光室温放置 50 min 染色, 然后用 HBSS 洗 3 次, 去掉细胞外的 Fura-2/AM, 再加入 HBSS 1 ml 待测将负载好的细胞用不同浓度靛玉红室温下孵育 20 min 后, 置于倒置显微镜上, 由 CCD ( 型号 : 480 TVL Colour Digital CCD) 实时拍摄细胞内荧光强度动态变化, 并用 Matefluor 软件测量细胞的 F 340 和 F 380, 用其比值 (ratio) 表征细胞 [Ca 2+ ] i, 检测 5 mmol L 1 ATP 引起的 [Ca 2+ ] i 变化, 以不用靛玉红处理的样品作为对照细胞对 EB 通透能力的检测将巨噬细胞接种于 96 孔板中, 贴壁后弃去培养基, 分别加入含有和 57 μmol L 1 靛玉红的 HBSS; 37 5% CO 2 孵育 20 min, 弃上清液, 再加入含有 5 mmol L 1 ATP 和 6 μmol L 1 EB 的 HBSS 孵育 10 min; 然后, 用 PBS 洗 3 次, 去掉细胞外 EB, 用倒置荧光显微镜检测 488 nm 波长激发下细胞的荧光强度, 以不加靛玉红和 ATP

3 满媛等 : 靛玉红对 ATP 引起的巨噬细胞吞噬抑制 ROS 产生和细胞死亡的影响 47 的细胞作为对照统计学分析细胞吞噬功能和细胞活力的检测中每组实验设置 5 个复孔, 细胞的 ROS [Ca 2+ ] i 和 EB 通透能力的检测中每组随机选取 10~20 个细胞每组实验在相同条件下重复 3 次以上数据以 x ± s 表示, 用 t 检验考察显著性差异结果 1 靛玉红抑制 ATP 引起的巨噬细胞吞噬功能降低在细胞培养基中加入中性红, 巨噬细胞摄入中性红的量代表了细胞吞噬能力的强弱首先检测不同浓度 ATP 对细胞吞噬功能的影响, 分别用和 1 mmol L 1 的 ATP 处理后, 细胞中性红的摄入量显著降低, 分别为不加 ATP 的对照组的 86% 72% 和 62% ( 图 1A), 表明细胞外 ATP 可以抑制巨噬细胞的吞噬功能巨噬细胞先分别用和 57 μmol L 1 的靛玉红处理 2 h, 然后再加入 1 mmol L 1 ATP, 在此条件下, 中性红的摄入量分别为对照组的 82% 86% 和 102%, 显著高于单独 1 mmol L 1 ATP 组 (P < 0.05, 图 1B) 以上结果表明, 细胞外 ATP 可以降低巨噬细胞的吞噬功能, 靛玉红对此有显著的抑制作用, 并且药物的作用随着剂量增加而增强 2 靛玉红抑制 ATP 引起的巨噬细胞产生 ROS 以 DHE 作为 ROS 检测的探针, 其荧光强度代表了细胞内 ROS 的量细胞分别用和 1 mmol L 1 的 ATP 刺激 40 min 后, ROS 产生量显著升高, 分别为对照组 ( 无 ATP 和靛玉红 ) 的 2.6 倍 2.8 倍和 5.4 倍 (P < 0.05, 图 2A) 在加入 1 mmol L 1 ATP 的同时加入或 57 μmol L 1 的靛玉红, 其 ROS 的产生量显著降低 ; 其中, 19 μmol L 1 效果最明显, 其 ROS 量仅为单独 1 mmol L 1 ATP 组的 36% ( 图 2B) 以上结果表明, 细胞外 ATP 可以促进巨噬细胞产生 ROS, 靛玉红对 ATP 引起的 ROS 产生有抑制作用, 其抑制效果与剂量呈钟型曲线关系, 中等浓度的药物作用最强 3 靛玉红对 ATP 引起的巨噬细胞死亡有抑制作用用高浓度的 ATP 刺激巨噬细胞 30 min, 去掉 ATP, 24 h 后用 MTT 法检测存活细胞的数量, 设定 Figure 1 Effect of indirubin on ATP-induced phagocytotic decrease of macrophages. A: The uptake of neutral red by macrophage in the absence and presence of ATP, showing the value of control (no ATP) was set as 100%, * P < 0.05 vs control group (n = 5). B: Pre-treating with or without indirubin for 2 h, showing the uptake of neutral red by macrophages in the presence of 1 mmol L 1 ATP, # P < 0.05 vs 1 mmol L 1 ATP alone (no indirubin) group (n = 5) Figure 2 Effect of indirubin on ATP-induced ROS production of macrophages. A: The ROS production induced by extracellular ATP, showing the value of control (no ATP) was set as 100%, * P< 0.05 vs control group (n = 10). B: The ROS production induced by 1 mmol L 1 ATP in the presence or absence of indirubin, # P < 0.05 vs 1 mmol L 1 ATP alone (no indirubin) group (n = 10)

48 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (1): 45 50 对照组 ( 无 ATP) 的细胞存活率为 100%, ATP (1 mmol L 1 ) 对巨噬细胞存活无显著影响, ATP (2 和 5 mmol L 1 ) 组细胞数量显著下降 (P < 0.

4 48 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (1): 对照组 ( 无 ATP) 的细胞存活率为 100%, ATP (1 mmol L 1 ) 对巨噬细胞存活无显著影响, ATP (2 和 5 mmol L 1 ) 组细胞数量显著下降 (P < 0.05), 分别为对照组的 84% 和 72% ( 图 3A), 说明高浓度 ATP 可以引起巨噬细胞死亡细胞用和 57 μmol L 1 的靛玉红预处理 3 h 后, 再加入 5 mmol L 1 ATP, 此时靛玉红 (3.8 和 19 μmol L 1 ) 组的细胞存活率分别为对照组的 85% 和 88%, 显著高于单独 5 mmol L 1 ATP 组 (P < 0.05, 图 3B); 靛玉红 (57 μmol L 1 ) 组的存活率为 75%, 略高于单独 5 mmol L 1 ATP 组以上结果表明, 靛玉红对高浓度 ATP 引起的巨噬细胞死亡有抑制作用, 药物的作用与剂量呈钟型曲线关系 4 靛玉红抑制 ATP 引起的巨噬细胞内 Ca 2+ 浓度升高 ATP 引起 [Ca 2+ ] i 浓度变化的动力学曲线如图 4 所示, 5 mmol L 1 ATP 可使 [Ca 2+ ] i 快速上升, 达到最大值后略有下降, 然后持续保持高 [Ca 2+ ] i 水平, 形成平台分别用和 57 μmol L 1 的靛玉红孵育细胞 5 min 后再加 ATP, [Ca 2+ ] i 升高的峰值和平台值显著下降, 其中 19 μmol L 1 靛玉红的作用最为显著, 峰值和平台值 ( 以加药后 150 s 的值表示 ) 分别为对照组的 47% 和 50% ( 图 4B 和 4C) 以上结果表明, 靛玉红对 P2 受体有一定的阻断作用, 药物的作用与剂量呈钟型曲线关系 Figure 3 Effect of indirubin on ATP-induced macrophages death. A: The cell viability after treating with ATP for 30 min, and the value of control (no ATP) was set as 100%, * P < 0.05 vs control group (n = 5). B: Following pre-treating with or without indirubin for 3 h, the cells were treated with 5 mmol L 1 ATP, and showing the viability of cells, # P < 0.05 vs 5 mmol L 1 ATP alone (no indirubin) group (n = 5) Figure 4 Effect of indirubin on ATP-induced increase in [Ca 2+ ] i in macrophages. A: Representative changes in F 340/F 380 in control cells (no indirubin) and cells pretreated with indirubin. Arrows indicate applications of 5 mmol L 1 ATP. B: Summary of the maximum changes in F 340/F 380 after ATP application. C: Summary of the changes in F 340/F 380 at 150 s after application of ATP. * P< 0.05 vs control group (n = 15)

5 满媛等 : 靛玉红对 ATP 引起的巨噬细胞吞噬抑制 ROS 产生和细胞死亡的影响 49 5 靛玉红抑制 ATP 引起的细胞膜通透性增加以 EB 作为探针研究靛玉红对 P2X7 活化的作用结果如图 5 所示, 5 mmol L 1 ATP 处理 10 min, 细胞的荧光强度显著高于只加入 EB 的对照组细胞, 提前用和 57 μmol L 1 的靛玉红孵育细胞 20 min, 然后再加入 ATP, 在此条件下, 细胞的荧光强度显著降低, 分别为只加 ATP 组的 83% 57% 和 82% (P < 0.05), 说明 ATP 引起的细胞对 EB 的通透可以被靛玉红抑制, 提示药物对 P2X7 的活化有阻断作用, 并且药物的作用与剂量呈钟型曲线关系, 中浓度 (19 μmol L 1 ) 的靛玉红作用最强讨论细胞外的 ATP 作为信号分子, 通过活化膜上的 P2 受体引起多种生物学效应, 如调节细胞增殖分化引起免疫反应参与动脉粥样硬化等本文以大鼠腹腔巨噬细胞为材料, 首先检测了 ATP 对细胞免疫功能的影响, 结果表明 ATP 抑制巨噬细胞吞噬, 促进 ROS 产生, 高浓度的 ATP 可导致细胞死亡该结果与文 [6 9] 献以神经小胶质细胞 J774.2 THP-1 细胞系等为材料的研究结果相似细胞外的 ATP 通过激活膜上的 P2X 和 ( 或 ) P2Y 受体而发挥作用, 免疫系统表达多种 P2 受体, 许多研究表明, P2X7 亚型在 ATP 引起的吞噬抑制 ROS 产生和细胞凋亡中起关键作用 [1, 6 9] 靛玉红是从中药青黛中分离出的有效成分, 大量的研究显示靛玉红对白血病细胞异常增殖有抑制作用, 其作用与抑制 CDK 等激酶的活性和激活 MAPK P53 Bcl-2 等信号通路有关 [10, 11, 14] 近年来, 有研究发现靛玉红有抗炎作用, 提出靛玉红可用于自身免疫系统疾病的治疗 [13, 15], 但该方面的研究开 [13] 始不久, 文献报道较少 Kunikata 等报道靛玉红可抑制单核细胞产生干扰素和 IL-6, 但对细胞增殖没有 [12] 影响最近, Jung 等的研究显示, 靛玉红对神经小胶质细胞分泌细胞因子 TNF-α IL-1 PGE 和产生 NO 和 ROS 有抑制作用本文检测了靛玉红对 ATP 引起的巨噬细胞免疫反应的作用, 结果显示靛玉红能够逆转 ATP 引起的吞噬降低和细胞死亡, 并抑制 ATP 引起的 ROS 产生, 说明靛玉红对 ATP 引起的巨噬细胞免疫效应有阻断作用细胞外 ATP 通过活化 P2 类受体导致 [Ca 2+ ] i 升高是引起细胞反应的第一步, 对于 P2X7 亚型, 除了引起 [Ca 2+ ] i 升高外, 在高浓度 ATP 作用下, P2X7 的通道孔径增大, 形成大孔, 允许分子质量 900 D 以下的分子 ( 如细胞染料 ) 通过为了研究靛玉红对巨 Figure 5 Effect of indirubin on ATP-induced ethidium bromide (EB) dye uptake by macrophages. A: Representative fluorescent images showing dye uptake positive cells (upper panel) and phase contrast images visualizing all cells (lower panel); B: Percentage of fluorescent intensity obtained from three independent experiments. # P < 0.05 vs control group (no ATP and indirubin); * P < 0.05 vs ATP alone (no indirubin) group

6 50 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (1): 噬细胞上 P2 类, 特别是 P2X7 受体的作用, 本文检测了靛玉红对 ATP 引起的 [Ca 2+ ] i 升高和细胞膜通透性增加的影响结果表明, 靛玉红可降低 ATP 引起的 [Ca 2+ ] i 升高, 对 ATP 引起的 EB 染料进入细胞内有抑制作用这些结果提示, 靛玉红对 P2X7 受体活化有一定的抑制作用, 推测靛玉红的药物作用可能与阻断 P2X7 受体活化有关 ; 但其他 P2 类受体是否参与其中, 靛玉红对其他 P2 受体有无阻断作用, 这些问题还需要深入探讨关于靛玉红作用的量效关系, 本研究显示, 除了其对 ATP 引起吞噬抑制的效果与剂量呈正相关外, 其对 ATP 引起的 ROS 和细胞死亡的量效关系呈钟型曲线, 靛玉红对 ATP 引起的 [Ca 2+ ] i 升高和 P2X7 大孔形成的量效关系也呈钟型曲线这两者的吻合一方面支持了作者的推测, 即阻断 P2X7 的活化是靛玉红的作用机制之一 ; 另一方面, 该结果也提示靛玉红的作用机制复杂, 除了 P2X7 外可能还有其他作用位点, 不同作用途径之间可有相互作用, 但这些推测需要进一步的研究证明关于细胞吞噬, 有资料显示单独使用靛玉红可以促进巨噬细胞的吞噬作用, 作者也对此进行了检测, 实验结果与文献报道一致, 因此靛玉红抑制 ATP 引起的吞噬抑制可能有更复杂的作用机制靛玉红已经广泛应用于肿瘤的治疗中, 目前该药物也显示出治疗自身免疫性疾病的应用前景, 对其作用机制的深入探讨将为药物的在免疫系统疾病中的应用提供基础 References [1] Khakh BS, North RA. P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease [J]. Nature, 2006, 442: [2] Ralevic V, Burnstock G. Receptors for purines and pyrimidines [J]. Pharmacol Rev, 1998, 50: [3] White N, Burnstock G. P2 receptors and cancer [J]. Trends Pharmacol Sci, 2006, 27: [4] Coutinho-Silva R, Ojcius DM, Górecki DC, et al. Multiple P2X and P2Y receptor subtypes in mouse J774, spleen and peritoneal macrophages [J]. Biochem Pharmacol, 2005, 69: [5] Solle M, Labasi J, Perregaux DG, et al. Altered cytokine production in mice lacking P2X(7) receptors [J]. J Biol Chem, 2001, 276: [6] Samantha FM, Amanda BM. NADPH oxidase NOX2 mediates rapid cellular oxidation following ATP stimulation of endotoxinprimed macrophages [J]. J Immunol, 2009, 183: [7] Marques-da-Silva C, Burnstock G, Ojciusc DM, et al. Purinergic receptor agonists modulate phagocytosis and clearance of apoptotic cells in macrophages [J]. Immunobiology, 2011, 216: [8] Gu BJ, Bernadette M, Saunders CJ, et al. The P2X7-nonmuscle myosin membrane complex regulates phagocytosis of nonopsonized particles and bacteria by a pathway attenuated by extracellular ATP [J]. Blood, 2010, 115: [9] Nihei OK, Carvalho A, Savino W, et al. Pharmacologic properties of P2Z/P2X7 receptor characterized in murine dendritic cells: role on the induction of apoptosis [J]. Blood, 2000, 96: [10] Kim SA, Kwon SM, Kim JA, et al. 5'-Nitro-indirubinoxime, an indirubin derivative, suppresses metastatic ability of human head and neck cancer cells through the inhibition of integrin β1/fak/akt signaling [J]. Cancer Lett, 2011, 306: [11] Lee MJ, Kim MY, Mo JS, et al. Indirubin-3'-monoxime, a derivative of a Chinese anti-leukemia medicine, inhibits Notch1 signaling [J]. Cancer Lett, 2008, 265: [12] Jung HJ, Nam KN, Son MS, et al. Indirubin-3'-oxime inhibits inflammatory activation of rat brain microglia [J]. Neurosci Lett, 2011, 487: [13] Kunikata T, Tatefuji T, Aga H, et al. Indirubin inhibits inflammatory reactions in delayed-type hypersensitivity [J]. Eur J Pharmacol, 2000, 410: [14] Xiao ZJ, Hao YS, Liu BC, et al. Indirubin and meisoindigo in the treatment of chronic myelogenous leukemia in China [J]. Leuk Lymphoma, 2002, 43: [15] Zhang AJ, Qu Y, Zhang B, et al. The different effects of indirubin on effector and CD4+CD25+ regulatory T cells in mice: potential implication for the treatment of autoimmune diseases [J]. J Mol Med, 2007, 85: [16] Zhou XY, Yang WX, Li JY. Ca 2+ - and protein kinase C- dependent signaling pathway for nuclear factor-κb activation, inducible nitric-oxide synthase expression, and tumor necrosis factor-alpha production in lipopolysaccharide-stimulated rat peritoneal macrophages [J]. J Biol Chem, 2006, 281: [17] Liu LJ, Zou J, Liu X, et al. Inhibition of ATP-induced macrophage death by emodin via antagonizing P2X7 receptor [J]. Eur J Pharmacol, 2010, 640:

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