130 铮, 等. 二甲双胍通过抑制 p38mapk 信号通路逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性 [ 关键词 ] 卵巢肿瘤 ; 二甲双胍 ; 抗药性, 肿瘤 ; 顺铂 ;DNA 修复 ;p38 丝裂原活化蛋白激酶类 ; 切除修复交叉互补基因 1 [ABSTRACT] Objective: To inves

Size: px

Start display at page:

Download "130 铮, 等. 二甲双胍通过抑制 p38mapk 信号通路逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性 [ 关键词 ] 卵巢肿瘤 ; 二甲双胍 ; 抗药性, 肿瘤 ; 顺铂 ;DNA 修复 ;p38 丝裂原活化蛋白激酶类 ; 切除修复交叉互补基因 1 [ABSTRACT] Objective: To inves"

沿董亮经
5 years ago
Views:

1 TUMOR Vol. 35, February 2015 肿瘤基础研究 Basic Research 二甲双胍通过抑制 p38mapk 信号通路逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性铮, 史惠蓉, 谢娅, 王静璐 Metformin reverses drug-resistance of ovarian cancer cells to cisplatin by inhibiting p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathway PENG Zheng, SHI Hui-rong, XIE Ya, WANG Jing-lu [ 摘要 ] 目的 : 探讨二甲双胍是否能够逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性, 以及其可能的作用机制方法 :CCK-8 法检测二甲双胍作用后卵巢癌细胞顺铂耐药株 C13K 和 CP70 细胞对顺铂的耐药性变化, 以及转染针对切除修复交叉互补基因 1 (excision repair cross-complemention 1,ERCC1) 的特异性小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA) 后 C13K 和 CP70 细胞耐药性的变化实时荧光定量 PCR 法检测不同浓度二甲双胍作用后,C13K 和 CP70 细胞中 ERCC1 基因表达的变化蛋白质印迹法检测二甲双胍作用后 C13K 和 CP70 细胞中腺苷酸活化蛋白激酶 (AMP-activated protein kinase,ampk) 信号通路的激活和 p38 丝裂原活化蛋白激酶 (p38 mitogen-activated protein kinase, p38mapk) 信号通路的抑制情况, 以及联合或不联合 AMPK 信号通路阻断剂 Compound C 作用后 ERCC1 蛋白的表达情况同时, 蛋白质印迹法检测 p38mapk 信号通路抑制剂 SB 作用后耐药细胞中 ERCC1 蛋白表达的变化, 以及二甲双胍作用联合 p38mapk sirna 转染前后耐药细胞中 ERCC1 蛋白的表达变化结果 : 二甲双胍能够逆转 C13K 和 CP70 细胞对顺铂的耐药性 (P < 0.05) 二甲双胍作用能够降低 C13K 和 CP70 细胞中 ERCC1 mrna 和蛋白的表达水平 (P < 0.05), 并激活 AMPK 信号通路 (P < 0.05); 而联合应用 AMPK 信号通路阻断剂 Compound C 可以阻断二甲双胍的这种作用 ( 即 ERCC1 蛋白表达水平升高 )(P < 0.01) p38mapk 信号通路抑制剂 SB 作用后,C13K 和 CP70 细胞中 ERCC1 蛋白表达水平降低 (P < 0.05); 而二甲双胍作用可降低 p38mapk 的磷酸化水平 (P < 0.01), 抑制 p38mapk 信号通路二甲双胍作用转染了 p38mapk sirna 的 C13K 和 CP70 细胞后,ERCC1 蛋白的表达水平无明显变化 (P > 0.05) DOI: /j.issn [ 作者单位 ] 郑州大学第一附属医院妇产科, 河南郑州 [ 中图分类号 ] R [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2015) [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 ( 编号 : ) AUTHORS FROM Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou , Henan Province, China Correspondence to: SHI Hui-rong( 史惠蓉 ) hrshi2011@163.com GRANT National Natural Science Foundation of China (No ) TUMOR, 2015, 35 (02): FINANCIAL DISCLOSURE: The authors have indicated they have no financial relationships relevant to this article to disclose. Received Accepted Copyright 2015 by TUMOR All rights reserved 结论 : 二甲双胍可能逆转卵巢癌顺铂耐药株对顺铂的耐药性, 并且这一作用可能是通过抑制 p38mapk 信号通路和降低细胞中 ERCC1 的表达而实现的

2 130 铮, 等. 二甲双胍通过抑制 p38mapk 信号通路逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性 [ 关键词 ] 卵巢肿瘤 ; 二甲双胍 ; 抗药性, 肿瘤 ; 顺铂 ;DNA 修复 ;p38 丝裂原活化蛋白激酶类 ; 切除修复交叉互补基因 1 [ABSTRACT] Objective: To investigate whether metformin can reverse drug-resistance of ovarian cancer cells to cisplatin, and explore its underlying mechanism. Methods: Cisplatin-resistant ovarian cancer cells C13K and CP70 were used in this study. The small interfering RNAs (sirnas) targeting excision repair cross-complemention 1 (ERCC 1) gene were synthesized and transfected into C13K and CP70 cells, respectively. The change of cisplatin-resistance of C13K and CP70 cells was detected by cell count kit-8 (CCK-8) assay after metformin treatment and ERCC1 sirna transfection. The expressions of ERCC1 mrna in C13K and CP70 cells treated with different concentrations of metformin were detected by real-time fluorescent quantitative-pcr. The activation of AMP-activated protein kinase (AMPK) and suppression of p38 mitogen-activated protein kinase (p38mapk) in C13K and CP70 cells after metformin treatment were evaluated by Western blotting. Then the expression level of ERCC1 protein in C13K and CP70 cells treated with metformin (combined with Compound C, a blocking agent of AMPK signaling pathway, or p38mapk sirna transfection) or SB (an inhibitor of p38mapk signaling pathway) was detected by Western blotting. Results: Metformin could reverse drug-resistance of C13K and CP70 cells to cisplatin (P < 0.05). Metformin reduced the expression levels of ERCC1 mrna and protein in C13K and CP70 cells (P < 0.05) and activated the AMPK signaling pathway (P < 0.05), but this effect of metformin was blocked by AMPK blocking agent Compound C (P < 0.01). The p38mapk inhibitor SB suppressed the expression of ERCC1 protein in C13K and CP70 cells (P < 0.05); while metformin could suppress the p38mapk signaling pathway (P < 0.01), but not reduce the expression level of ERCC1 protein in C13K and CP70 cells transfected with p38mapk sirna (P > 0.05). Conclusion: Metformin may reverse the drug-resistance of cisplatin-resistant ovarian cancer cells to cisplatin. This effect of metformin may be due to the inhibition of p38mapk signaling pathway and the downregulation of ERCC 1 gene expression in ovarian cancer cells. [KEY WORDS] Ovarian neoplasms; Metformin; Drug resistance, neoplasm; Cisplatin; DNA repair; p38 mitogen-activated protein kinases; ERCC 1 卵巢癌是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤, 严重威胁着妇女的生命与健康, 而且大多数患者就诊时已经属于晚期, 失去了手术治疗的机会以顺铂为基础的联合化疗是卵巢上皮性癌综合治疗的重要手段之一 [1] 顺铂通过使肿瘤细胞形成 DNA 加合物, 造成肿瘤细胞的 DNA 损伤, 继而使肿瘤细胞 DNA 的复制被抑制, 细胞分裂再生停止, 最终杀灭肿瘤细胞然而, 顺铂的疗效往往会因癌细胞内在或者后天 ( 如药物诱导 ) 获得的耐药性而减弱, 耐药是导致患者治疗失败的主要原因到目前为止, 人们对顺铂的体内耐药机制并不完全清楚, 但是已知核苷酸切除修复 (nucleotide excision repair,ner) 途径在肿瘤对铂类药物的耐药过程中起着非常重要的作用 [2],

3 铮, 等. 二甲双胍通过抑制 p38mapk 信号通路逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性 131 而切除修复交叉互补蛋白 1(excision repair crosscomplemention 1,ERCC1) 便是 NER 途径中最重要的一个修复蛋白研究发现,ERCC1 可降低肿瘤细胞对铂类化疗药物的敏感性, 推测这是因为它能够及时地修复铂类造成的 DNA 损伤 [3] ; 而沉默或干扰 ERCC 1 基因表达可以增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性 [4] 丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,mapk) 信号通路在多种恶性肿瘤 ( 包括卵巢癌 ) 细胞的增殖凋亡和化疗药物治疗及耐受发生中起重要作用 [5-7] MAPK 在多数肿瘤中都存在不正常激活或异常表达有研究表明,p38MAPK 信号通路的过度激活能够导致卵巢癌的发生, 并影响其预后 [8] MAPK 信号通路在前列腺癌和非小细胞肺癌等多种肿瘤细胞的 [9, ERCC1 基因高表达中起着重要作用 10] 二甲双胍是一种常规用于治疗 2 型糖尿病的 [11, 口服降糖药 12] 最近有 2 项大型流行病学调查研究表明, 长期服用二甲双胍能够降低卵巢癌的发病率, 而且二甲双胍能够显著延长卵巢癌合并糖尿病患者的无进展生存期 [7] 同时, 实验研究发现, 二甲双胍能够抑制包括卵巢癌在内的多种 [13, 肿瘤的发生和发展 14], 而且能够增加非小细胞癌和卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性 [15], 逆转乳腺癌细胞对化疗药物的耐药性 [16], 但其具体的作用机制尚不明确因此, 本研究试图探讨二甲双胍能否逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性, 以及其是否通过调节 p38mapk 信号通路降低卵巢癌细胞中 ERCC1 基因的表达而发挥作用, 以期对卵巢癌的化学治疗提供新的理论依据 1 材料与方法 1.1 实验试剂 RPMI 1640 细胞培养液和胎牛血清购自美国 Gibco 公司 ; 实验用药物二甲双胍和顺铂购自美国 Sigma 公司 ; 腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPactivated protein kinase,ampk) 信号通路的阻断剂 Compound C 和 MAPK 信号通路的抑制剂 SB 均购自美国 Calbochem 公司 ; 细胞计数试剂盒 -8(cell count kit-8,cck-8) 购自日本株式会社同仁化学研究所 ;RIPA 裂解液购自北京索莱宝科技有限公司 ; 实时荧光定量 PCR 相关试剂购自日本 Toyobo 公司 ; 兔抗人 ERCC1 p38mapk 磷酸化 p38mapk(phosphop38mapk,p-p38mapk) AMPK 和磷酸化 AMPK(phospho-AMPK,p-AMPK) 多克隆抗体均购自美国 CST 公司, 兔抗人内参 GAPDH 多克隆抗体购自杭州贤至生物科技有限公司, 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗购自美国 EarthOx 公司 ;PCR 引物和反义小分子干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA) 序列由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成 ; 转染试剂 LipofectAMINE2000 购自美国 Invitrogen 公司 1.2 细胞及其培养人卵巢癌细胞顺铂敏感株 OV2008 和 A2780 及它们各自的顺铂耐药株 C13K 和 CP70 均由本课题组保存 4 种细胞均用含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液, 在 37 CO 2 体积分数为 5% 的恒温培养箱中培养, 并常规消化传代, 选取对数生长期细胞进行实验 1.3 sirna 转染分别设计针对 ERCC1 和 p38mapk 基因的 sirna 序列 :ERCC1-siRNA 序列为 5 -AUCG- GAAUAAGGGCUUG-3,p38MAPK-siRNA 序列为 5 -GGAGCUGGCUAAGAUGUGU-3-3 将 sirna 溶液 ( 以去离子水按的比例稀释 ) 与 LipofectAMINE2000 溶液 ( 以去离子水按的比例稀释 ) 混合, 室温反应 15 min; 然后将顺铂耐药细胞 C13K 和 CP70 接种于 24 孔板中, 每孔加入 650 μl 无血清培养液和 150 μl 上述混合物, 置于 37 CO 2 体积分数为 5% 的培养箱中培养 ;6 h 后, 换成含有血清的培养液继续培养 24 h; 最后采用实时荧光定量 PCR 法检测目的基因沉默是否成功将转染后 ERCC1 和 p38mapk 基因沉默的细胞分别命名为 si-ercc1-c13k si-ercc1-cp70 sip38mapk-c13k 和 si-p38mapk-cp70 细胞 1.4 CCK-8 法检测细胞耐药性收集对数生长期的 OV C 1 3 K

4 132 铮, 等. 二甲双胍通过抑制 p38mapk 信号通路逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性 si-ercc1-c13k A2780 CP70 和 si-ercc1- CP70 细胞, 分别将包含个细胞的 100 μl 细胞悬液 ( 用无血清培养液稀释 ) 接种于 96 孔板, 培养 24 h 后换成含血清的 RPMI 1640 培养液, 并加入终质量浓度分别为和 64 μg/ml 的顺铂, 继续培养和 72 h; 然后每孔加入 10 μl CCK-8 试剂, 继续培养 2 h, 用酶标仪测定 492 nm 波长处的吸光度 (D 值 ) 分别计算顺铂对 6 种细胞的半数抑制浓度 (50% inhibitory concentration,ic 50 ), 并进一步计算转染前后耐药细胞株 C13K 和 CP70 的耐药指数耐药指数 = 耐药细胞 IC 50 值 / 敏感细胞 IC 50 值 ; 逆转倍数即为两组细胞耐药指数的比值同时, 将转染前的耐药细胞株 C13K 和 CP70 用上述不同质量浓度的顺铂联合终浓度分别为和 10 mmol/l 的二甲双胍共处理, 培养 24 h 后测量其 D 492 nm 值每种细胞每个浓度均设 5 个平行孔, 并独立重复实验 3 次 1.5 实时荧光定量 PCR 法检测 ERCC1 mrna 的表达分别收集顺铂敏感株 OV2008 和 A2780 以及不同浓度 ( 和 10 mmol/l) 的二甲双胍作用 24 h 前后的耐药株 C13K 和 CP70 细胞, 用 RIPA 裂解液提取细胞总 RNA, 然后进行实时荧光定量 PCR 扩增, 操作步骤参照试剂盒使用说明以管家基因 GAPDH 为内参照 ERCC1 基因的引物序列 : 上游引物 5 -GGGTGACT- GAATGTCTGACCA-3, 下游引物 5 -GGG- TACTTTCAAGAAGGGCTC-3, 目的产物大小为 21 bp PCR 扩增条件 :95 60 s;95 15 s, s,72 45 s,40 个循环扩增产物用 Applied Biosystems 7500Fast 系统进行荧光定量, 得到检测基因与内参基因的 Ct 值, 最后采用 2 - ΔΔCt 方法计算目的基因 ERCC1 的相对表达量 1.6 蛋白质印迹法检测 ERCC1 以及 AMPK p-ampk p38mapk 和 p-p38mapk 蛋白的表达收集对数生长期的 OV2008 C13K sip38mapk-c13k A2780 CP70 和 si-p38mapk- CP70 细胞, 分别接种于培养皿中, 培养过夜待细胞贴壁生长后, 分组加药处理 :(1) 将敏感株 OV2008 和 A2780 细胞耐药株 C13K 和 CP70 细胞不经任何药物处理, 检测 ERCC1 蛋白的表达 ;(2) 将耐药株 C13K 和 CP70 细胞分别用 10 mmol/l 二甲双胍作用和 120 min, 检测 AMPK 和 p-ampk 蛋白的表达水平 ;(3) 将耐药株 C13K 和 CP70 细胞分别用 10 mmol/l 二甲双胍作用和 16 h, 检测 p38mapk 和 p-p38mapk 蛋白的表达水平 ; (4) 将耐药株 C13K 和 CP70 细胞分别用不同浓度 ( 和 10 mmol/l) 的二甲双胍单独或联合 10 μmol/l 的 AMPK 信号通路阻断剂 Compound C 作用 24 h, 检测 ERCC1 蛋白表达 ;(5) 将耐药株 C13K 和 CP70 细胞分别用和 15 μmol/l 的 MAPK 信号通路抑制剂 SB 作用 24 h, 检测 ERCC1 p38mapk 和 p-p38mapk 蛋白的表达水平 ;(6) 将转染 p38mapk sirna 后的耐药株 C13K 和 CP70 细胞分别用 10 mmol/l 二甲双胍作用 24 h, 检测 ERCC1 p38mapk 和 p-p38mapk 蛋白的表达水平细胞处理结束后, 用 RIPA 细胞裂解液提取细胞总蛋白, 然后将等量蛋白质溶液上样, 行 SDS-PAGE 以分离目的蛋白 ; 电泳结束后, 冰浴转膜, 用 5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h, 加入一抗 ( 稀释比例为 )4 反应过夜, 再加入二抗 ( 稀释比例为 1 800) 室温反应 1.5 h; 最后用电化学发光试剂进行显色, 用凝胶成像系统记录结果采用 Image-Pro Plus6 软件系统扫描并定量分析目的蛋白的表达水平, 以目的蛋白条带的灰度值与内参 GAPDH 蛋白条带的灰度值之比表示目的蛋白的相对表达量 1.7 统计学方法采用 SPSS 17.0 统计学软件对结果数据进行统计分析所有实验均独立重复 3 次, 结果数据用 ± s 表示 ; 多组间数据采用单因素方差分析, 然后组间两两比较采用 LSD-t 检验以 P < 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 二甲双胍和 ERCC1 基因沉默可逆转 C13K 和 CP70 细胞对顺铂的耐药性 CCK-8 法检测结果 ( 表 1) 显示, 不同质量浓度的顺铂分别作用卵巢癌顺铂耐药细胞和敏感

5 铮, 等. 二甲双胍通过抑制 p38mapk 信号通路逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性 133 细胞 24 h 后, 细胞生长均被不同程度地抑制, 其中顺铂耐药株 C13K 和 CP70 细胞的耐药指数分别是各自亲本细胞 OV2008 和 A2780 的 6.99 和 9.36 倍 ; 用不同浓度的二甲双胍作用耐药株细胞 24 h 后, 顺铂对 C13K 和 CP70 细胞的 IC 50 值随着二甲双胍浓度的增加而降低, 与二甲双胍未处理组相比差异均有统计学意义 ( 均 P < 0.05), 各浓度之间两两比较差异也存在统计学意义 ( 均 P < 0.05) 以上结果提示, 一定浓度的二甲双胍能够提高卵巢癌顺铂耐药细胞对顺铂的敏感性, 耐药性逆转倍数呈浓度依赖性另外, 与未转染的耐药细胞相比, 转染了 ERCC1 sirna 后的 C13K 和 CP70 细胞对顺铂的敏感性也明显提高 (P < 0.01), 提示 ERCC1 基因表达与卵巢癌细胞对顺铂的耐药性有关 2.2 二甲双胍可下调 C13K 和 CP70 细胞中 ERCC1 基因的表达实时荧光定量 PCR 法检测结果 ( 图 1) 显示, 卵巢癌顺铂耐药株 C13K 和 CP70 细胞的 ERCC1 基因表达量高于相应的敏感株 OV2008 和 A2780 细胞 ( 均 P < 0.01); 当给予耐药株细胞不同浓度的二甲双胍 ( 终浓度分别为和 10 mmol/l) 作用 24 h 时, 与未经二甲双胍处理的耐药株相比,0.01 mmol/l 浓度组细胞的 ERCC1 基因表达水平无明显差异 (P > 0.05), 而和 10 mmol/l 浓度组细胞的 ERCC1 基因表达均明显降低 ( 均 P < 0.01) 2.3 二甲双胍作用 C13K 和 CP70 细胞后 AMPK 信号通路被激活, 而 p38mapk 信号通路被抑制将 10 mmol/l 二甲双胍分别作用 2 种耐药株 C13K 和 CP70 细胞和 120 min 后, 蛋白质印迹法检测结果 ( 图 2A) 显示, 相对于未经二甲双胍处理的细胞, 二甲双胍处理不同时间组细胞中 p-ampk 和 AMPK 蛋白表达水平的比值 ( 即二者相对表达水平 ) 均明显升高, 且各时间组之间差异也有统计学意义 ( 均 P < 0.05) 结果提示, 耐药细胞中 AMPK 信号通路可以被二甲双胍激活, 且具有时间依赖性将 10 mmol/l 二甲双胍分别作用 2 种耐药株 C13K 和 CP70 细胞和 16 h 后, 蛋白质印迹法检测结果 ( 图 2B) 显示, 相对于未经二甲双胍处理的细胞, 二甲双胍处理不同时间组表 1 二甲双胍作用和 ERCC1 sirna 转染后卵巢癌细胞对顺铂的耐药性变化 Table 1 The change of drug-resistance of ovarian cancer cells to cisplatin after metformin (Met) treatment and small interfering RNA (sirna) transfection targeting excision repair cross-complemention 1 (ERCC 1) gene Cell line IC 50 ρ/(μg ml - 1 ) Resistance index Reversal fold OV ±0.259 C13K 0 mmol/l Met 19.66± mmol/l Met 18.78±0.761 * mmol/l Met 16.07±0.242 * mmol/l Met 13.29±1.867 * mmol/l Met 5.98±0.146 ** ERCC1 sirna 4.32±0.121 ** A ±0.048 CP70 0 mmol/l Met 29.22± mmol/l Met 26.45±0.444 * mmol/l Met 23.53±0.460 * mmol/l Met 19.28±0.200 * mmol/l Met 10.03±0.328 ** ERCC1 sirna 6.08±0.596 ** C13K and CP70 are two cisplatin-resistant cell lines devived from ovarian cancer OV2008 and A2780 cell lines, respectively. * P < 0.05, ** P < 0.01, vs C13K or CP70 cells without Met treatment.

134 铮, 等. 二甲双胍通过抑制 p38mapk 信号通路逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性 Relative expression level of ERCC1 mrna 1.5 1.0 0.5 OV2008 C13K Relative expression level of ERCC1 mrna 1.5 1.0 0.5 A2780 CP70 0.0 - - 0.01 0.

6 134 铮, 等. 二甲双胍通过抑制 p38mapk 信号通路逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性 Relative expression level of ERCC1 mrna OV2008 C13K Relative expression level of ERCC1 mrna A2780 CP Metformin c/(mmol L -1 ) Metformin c/(mmol L -1 ) Fig. 1 The expression levels of excision repair cross-complemention 1 (ERCC1) mrnas in ovarian cancer cell lines (C13K and CP70 are cisplatin-resistant cells, while OV2008 and A2780 are cisplatin-sensitive cells) treated with different concentrations of metformin were detected by real-time fluorescent quantitative-pcr. The results showed that metformin reduced the expression of ERCC1 mrna in cisplatin-resistant ovarian cancer C13K and CP70 cells ( ** P<0.01, vs C13K or CP70 cells without metformin treatment; n=3). 图 1 实时荧光定量 PCR 法检测不同浓度的二甲双胍作用后卵巢癌顺铂敏感株和耐药株细胞的 ERCC 1 基因表达水平 Fig. 2 Effects of metformin (10 mmol/l) on AMP-activated protein kinase protein (AMPK) and p38 mitogen-activated protein kinase (p38mapk) signaling pathways in cisplatin-resistant ovarian cancer C13K and CP70 cells were detected by Western blotting. The results showed that metformin could activate the AMPK signaling pathway, but suppress the p38mapk signaling pathway ( * P<0.05, ** P<0.01, vs C13K or CP70 cells at 0 h; n =3). p-ampk: Phospho-AMPK; p-p38mapk: Phospho-p38MAPK. 图 2 蛋白质印迹法检测二甲双胍作用对卵巢癌顺铂耐药细胞 C13K 和 CP70 中 AMPK 和 p38mapk 信号通路的影响细胞中 p-p38mapk/p38mapk 蛋白的相对表达水平均明显降低, 且各时间组之间差异也有统计学意义 ( 均 P < 0.01) 结果提示, 耐药细胞中 p38mapk 信号通路可以被二甲双胍抑制, 且具有时间依赖性 2.4 二甲双胍抑制 ERCC1 蛋白表达, 而 AMPK 信号通路阻断剂 Compound C 可逆转该抑制作用蛋白质印迹法检测结果 ( 图 3A) 显示, 卵巢癌顺铂耐药株 C13K 和 CP70 细胞中 ERCC1 蛋白表达水平明显高于相应的敏感株细胞 (P < 0.01);

7 铮, 等. 二甲双胍通过抑制 p38mapk 信号通路逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性 135 Fig. 3 Effects of Compound C [a blocking agent of AMP-activated protein kinase (AMPK) signaling pathway], SB (an inhibitor of p38mapk signaling pathway) and the small interfering RNA (sirna) targeting p38mapk gene on excision repair cross-complemention 1 (ERCC1) protein expression in cisplatinresistant ovarian cancer C13K and CP70 cells were detected by Western blotting. A: Metformin reduced the expression of ERCC1 protein in C13K and CP70 cells, whereas Compound C reversed the influence of metformin ( * P<0.05, ** P<0.01, vs C13K or CP70 cells without any treatment; P<0.01, vs C13K or CP70 cells treated with 10 mmol/l metformin alone; n=3). B: SB inhibited the activation of p38mapk signaling pathway and suppressed the expression of ERCC1 protein in C13K and CP70 cells ( * P <0.05, ** P <0.01, vs C13K or CP70 cells without SB treatment; n =3). C: Metformin downregulated the expressions of p-p38mapk and ERCC1 proteins in C13K and CP70 cells without sirna transfection (sicontrol), but had no effect on the expression of ERCC1 protein in C13K and CP70 cells transfected with p38mapk sirna (si-p38mapk)( ** P<0.01; n=3). 图 3 蛋白质印迹法检测 AMPK 信号通路阻断剂 Compound C(A) p38mapk 信号通路抑制剂 SB (B) 和 p38mapk sirna 转染 (C) 对卵巢癌顺铂耐药细胞 C13K 和 CP70 中 ERCC1 表达的影响

8 136 铮, 等. 二甲双胍通过抑制 p38mapk 信号通路逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性给予耐药株细胞不同浓度的二甲双胍 ( 终浓度分别为和 10 mmol/l) 作用 24 h 后, ERCC1 蛋白表达水平均明显降低 (P < 0.05), 尤其是 10 mmol/l 浓度的二甲双胍抑制作用最强 (P < 0.01); 但是, 当用 10 μmol/l 的 AMPK 信号通路阻断剂 Compound C 和 10 mmol/l 二甲双胍联合处理细胞时, 发现 ERCC1 蛋白表达水平与单独 10 mmol/l 二甲双胍作用组相比显著升高 (P < 0.01), 提示二甲双胍对 ERCC1 表达的抑制作用可被 AMPK 信号通路阻断剂 Compound C 所逆转 2.5 p38mapk 信号通路抑制剂 SB 作用可下调 ERCC1 蛋白的表达用不同浓度的 p38mapk 信号通路抑制剂 SB 作用卵巢癌耐药株 C13K 和 CP70 细胞后, 蛋白质印迹法检测结果 ( 图 3B) 显示,SB 作用后细胞中 p-p38mapk/ p38mapk 蛋白的相对表达水平均明显降低 ( 均 P < 0.01), 且各浓度之间差异有统计学意义 (P < 0.05); 而 ERCC1 蛋白的表达水平也随之明显降低 ( 均 P < 0.05) 结果说明, 耐药株 C13K 和 CP70 细胞中 p38mapk 信号通路被阻断后,ERCC1 蛋白表达下调 2.6 二甲双胍作用联合 p38mapk sirna 转染前后的细胞中 ERCC1 蛋白表达无明显变化将 10 mmol/l 二甲双胍分别作用于 p38mapk sirna 转染前后的耐药株 C13K 和 CP70 细胞 24 h 后检测 ERCC1 的表达情况蛋白质印迹法检测结果 ( 图 3C) 显示, 与未经二甲双胍处理的细胞相比, 转染前耐药细胞的 ERCC1 蛋白表达和 p-p38mapk/p38mapk 蛋白相对表达水平均可被二甲双胍明显下调, 差异具有统计学意义 (P < 0.01), 而 p38mapk sirna 转染后耐药细胞的 ERCC1 蛋白表达和 p-p38mapk/ p38mapk 蛋白相对表达水平均不受二甲双胍影响, 差异无统计学意义 ( 均 P > 0.05) 这一结果验证了二甲双胍是通过抑制 p38mapk 信号通路的激活而下调 ERCC1 蛋白的表达 3 讨论卵巢癌顺铂耐药的发生是影响卵巢癌预后的最大障碍, 因此寻找一种理想的耐药逆转剂成为了提高化疗疗效的关键, 即耐药逆转剂的筛选是当前肿瘤化疗研究的热点之一二甲双胍作为治疗 2 型糖尿病的一线药物, 近年来它的抗肿瘤作用逐渐被人们关注, 它能够在体内外抑制多种类型肿瘤细胞的生长 [17-19] 研究表明, 相比单独使用顺铂和紫杉醇等化疗药物, 联合使用二甲双胍更能够抑制裸鼠体内的肿瘤生长 [15] 因此, 本实验旨在研究二甲双胍是否能够提高耐药细胞对顺铂的敏感性及其相关的作用机制目前, 卵巢癌顺铂耐药的具体机制尚不明确研究发现, 细胞通过 NER 途径修复损伤 DNA 是卵巢癌顺铂耐药发生的重要机制之一,ERCC1- 着色性干皮病基因组 F 核酸内切酶在 NER 过程中起到限速或调节作用, 且 ERCC1 与多种肿瘤细胞的顺铂耐药性有关 [20] 大量临床前研究和临床数据显示,ERCC1 是抗癌治疗的一个潜在靶基因 ; 有报道称, 在卵巢癌患者中,ERCC1 mrna 高表达者对顺铂更容易耐药, 耐药指数是 ERCC1 [21, mrna 低表达者的 9.2 倍 22] 本研究发现, ERCC1 sirna 转染后顺铂耐药株 C13K 和 CP70 细胞的顺铂耐药性逆转倍数分别为 4.54 和 4.80 倍, 说明 ERCC1 基因的存在是卵巢癌发生顺铂耐药的主要原因之一 Tseng 等 [9] 研究非小细胞肺癌细胞时发现, 二甲双胍不仅能够降低 ERCC1 的表达, 还能够增加紫杉醇诱导的细胞毒效应本研究结果也表明, 二甲双胍能够降低卵巢癌耐药细胞中 ERCC1 蛋白的表达, 具有浓度依赖性 ; 而且二甲双胍作用后, 卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性增强, 同样呈浓度依赖性由此可见, 二甲双胍能够逆转卵巢癌顺铂耐药株细胞对顺铂的耐药性, 提示二甲双胍联合顺铂治疗肿瘤可以明显降低顺铂的使用浓度, 从而降低其化疗不良反应, 减轻对人体正常细胞的伤害 ; 但是, 由于同一浓度二甲双胍对 2 种耐药细胞的抑制率不同, 因此在临床用药时, 应该注意根据肿瘤类型而特异性地选择用药浓度, 从而达到高效低毒的治疗效果

9 铮, 等. 二甲双胍通过抑制 p38mapk 信号通路逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性 137 化疗药物引起细胞损伤以及耐药的形成, 主要是通过磷脂酰肌醇 3- 激酶 (phosphotidylinositol 3-kinase,PI3K)/ 蛋白激酶 B(protein kinase B, PKB, 又称为 Akt) 和 MAPK 信号通路实现的 [23] MAPK 家族包括 p38mapk 细胞外信号调节蛋白激酶 (extracellular signal regulated kinase, ERK) 和 c-jun 氨基末端激酶 (c-jun N-terminal kinase,jnk) 等多个亚家族这些亚族组成多条信号转导通路, 其中最主要的有 p38mapk 途径 ERK1/2 途径和 JNK 途径 MAPK 信号通路在多种恶性肿瘤 ( 包括卵巢癌 ) 细胞的增殖凋亡和化疗耐药产生过程中发挥重要作用 [5] 有研究发现, 激活的 Akt 和 MAPK 可依次磷酸化 Bad 和 Bcl-2 蛋白, 进而削弱铂类和紫杉烷的促细胞凋亡作用, 使肿瘤细胞对化疗药物产生抵抗 [24] [25] Mansouri 等发现, 顺铂敏感细胞株在顺铂作用下表现出 JNK 和 p38mapk 活性增强, 而且信号通路激活持续的时间远长于对顺铂耐药的细胞株, 提示持续性的 JNK 和 p38mapk 激活可引起下游靶点基因的转录, 从而诱发细胞凋亡 AMPK 是主要的细胞能量调节因子, 也是细胞正常代谢和肿瘤发生互相作用的主要调节子二甲双胍能够激活 AMPK 信号通路, 从而抑制肿瘤细胞的生长 [26] 有研究表明, 二甲双胍抑制乳腺癌子宫内膜癌和卵巢癌等肿瘤细胞的生长, 主要是通过激活 AMPK 信号通路, 从而抑制 MAPK 和 PI3K/Akt 途径来实现的 [27] 本实验中, 二甲双胍能够降低细胞中 ERCC1 蛋白的表达, 且这一作用可被 AMPK 信号通路阻断剂 Compound C 所逆转 ; 同样地, 二甲双胍能够调节 MAPK 信号通路, 抑制 p38mapk 的磷酸化 Zhao 等 [28] 在研究紫外线对细胞 DNA 损伤的实验中发现,p38MAPK 在 NER 途径中有重要作用同样在前列腺癌的研究中发现,MAPK 信号通路的调节与 ERCC1 基因的表达相关 [10] 本研究中, 应用 p38mapk 信号通路抑制剂 SB 作用卵巢癌耐药细胞后, 发现细胞中 ERCC1 基因的表达受到抑制, 且呈浓度依赖性, 说明卵巢癌耐药细胞中 ERCC1 基因的表达亦受到 p38mapk 信号通路的调节有意思的是, 经 p38mapk sirna 转染后的耐药株细胞中 ERCC1 的表达不再被二甲双胍调节, 这一结果更充分说明了二甲双胍是通过调节 p38mapk 信号通路而抑制 ERCC1 的表达综上所述, 本研究验证了二甲双胍能够通过降低细胞中 ERCC1 的表达而逆转卵巢癌细胞的顺铂耐药性, 其作用机制涉及 p38mapk 信号通路, 提示二甲双胍可能作为顺铂治疗卵巢癌的一种辅助治疗药物本研究为进一步的动物体内研究和临床研究奠定了基础 [ 参考文献 ] [1] Rattan R, Graham RP, Maguire JL, et al. Metformin suppresses ovarian cancer growth and metastasis with enhancement of cisplatin cytotoxicity in vivo [J]. Neoplasia, 2011, 13(5): [2] Rosell R, Taron M, Barnadas A, et al. Nucleotide excision repair pathways involved in cisplatin resistance in non-small cell lung cancer[j]. Cancer Control, 2003, 10(4): [3] S c h e t t i n o C, B a r e s c h i n o M A, Maione P, et al. The potential role of pharmacogenomic and genomic in the adjuvant treatment of early stage non-small cell lung cancer[j]. Curr Genomics, 2008, 9(4): [4] Selvakumaran M, Pisarcik DA, Bao R, et al. Enhanced cisplatin cytotoxicity by disturbing the nucleotide excision repair pathway in ovarian cancer cell lines[j]. Cancer Res, 2003, 63(6): [5] Parakh S, Murphy C, Lau D, et al. Response to MAPK pathway inhibitors in BRAF V600M-mutated metastatic melanoma[j]. J Clin Pharm Ther, 2015, 40(1): [6] Ohta T, Ohmichi M, Hayasaka T, et al. Inhibition of phosphatidylinositol 3 - k i n a s e i n c r e a s e s e f f i c a c y o f cisplatin in vivo ovarian cancer models[j]. Endocrinology, 2006, 147(4): [7] Rattan R, Gin S, Hartmann LC, et al. M e t f o r m i n a t t e n u a t e s o v a r i a n cancer cell growth in an AMP-kinase dispensable manner[j]. J Cell Mol Med, 2011, 15(1): [8] Hernández Losa J, Parada Cobo C, Guinea Viniegra J, et al. Role of the p38mapk pathway in cisplatinbased therapy[j]. Oncogene, 2003, 22(26): [9] Tseng SC, Huang YC, Chen HJ, et al. Metformin-mediated downregulation of p38 mitogen-activated protein kinase-dependent excision repair cross-complementing 1 decreases DNA repair capacity and sensitizes

10 138 铮, 等. 二甲双胍通过抑制 p38mapk 信号通路逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性 h u m a n l u n g c a n c e r c e l l s t o paclitaxel[j]. Biochem Pharmacol, 2013, 85(4): [10] Yacoub A, Park JS, Qiao L, et al. MAPK dependence of DNA damage repair: ionizing radiation and the induction of expression of the DNA repair genes XRCC1 and ERCC1 in DU145 human prostate carcinoma cells in a MEK1/2 dependent fashion[j]. Int J Radiat Biol, 2001, 77(10): [11] Correia S, Carvalho C, Santos MS, et al. Metformin protects the brain against the oxidative imbalance promoted by type 2 diabetes[j]. Med Chem, 2008, 4(4): [12] Correia S, Carvalho C, Santos MS, et al. Mechanismsof action of metformin in type 2 diabetes and associated complications: an overview[j]. Mini Rev Med Chem, 2008, 8(13): [13] Anisimov VN, Egormin PA, Piskunova TS, et al. Metformin extends life span o f H E R - 2 / n e u t r a n s g e n i c m i c e and incombination with melatonin inhibits growth of transplantable tumors in vivo [J]. Cell Cycle, 2010, 9(1): [14] Dowling RJ, Zakikhani M, Fantus IG, et al. Metformin inhibits mammalian target of rapamycin-dependent t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n i n b r e a s t cancer cells[j]. Cancer Res, 2007, 67(22): [15] Iliopoulos D, Hirsch HA, Struhl K. Metformin decreases the dose of chemotherapy for prolonging tumor remission in mouse xenografts involving multiple cancer cell types[j]. Cancer Res, 2011,71(9): [16] Liu H, Scholz C, Zang C, et al. Metformin and the mtor inhibitor e v e r o l i m u s ( R A D ) s e n s i t i z e breast cancer cells to the cytotoxic effect of chemotherapeutic drugs in vitro [J]. Anticancer Res, 2012, 32(5): [17] Ben Sahra I, Laurent K, Loubat A, et al. The antidiabetic drug metformin exerts an antitumoral effect in vitro and in vivo through a decrease of cyclin D1 level[j]. Oncogene, 2008, 27(25): [18] Alimova IN, Liu B, Fan Z, et al. Metformin inhibits breast cancer cell growth, colony formation and induces cell cycle arrest in vitro[j]. Cell Cycle, 2009, 8(6): [19] Gotlieb WH, Saumet J, Beauchamp MC, et al. In vitro metformin anti-neoplastic activity in epithelial ovarian cancer[j]. Gynecol Oncol, 2008, 110(2): [20] Ferry KV, Hamilton TC, Johnson SW. Increased nucleotide excision repair in cisplatin-resistant ovarian cancer cells: role of ERCC1-XPF[J]. Biochem Pharmacol, 2000, 60(9): [21] Dabholkar M, Vionnet J, Bostick-Bruton F, et al. Messenger RNA levels of XPAC and ERCC1 in ovarian cancer tissue correlate with response to platinumbased chemotherapy[j]. J Clin Invest, 1994, 94(2): [22] Zhu G, Myint M, Ang WH, et al. M o n o f u n c t i o n a l p l a t i n u m - D N A adducts are strong inhibitors of transcription and substrates for nucleotide excision repair in live mammalian cells[j]. Cancer Res, 2012, 72(3): [23] Agarwal R, Kaye SB. Ovarian cancer: stategies for overcoming resistance to chemotherapy[j]. Nat Rev Cancer, 2003, 3(7): [24] Ohta T, Ohmichi M, Hayasaka T, et al. Inhibition of phosphatidylinositol 3 - k i n a s e i n c r e a s e s e f f i c a c y o f cisplatin in in vivo ovarian cancer models[j]. Endocrinology, 2006, 147(4): [25] Mansouri A, Ridqway LD, Korapati AL, et al. Sustained activation of JNK/ p38 MAPK pathways in response to cisplatin leads to Fas ligand induction and cell death in ovarian carcinoma cells[j]. J Biol Chem, 2003, 278(21): [26] 张雅雅, 包传恩, 洪节约, 等. AMPK 在肿瘤发生发展中的作用机制研究 [J]. 肿瘤, 2010, 30(8): [27] C a p a n o M, C r o m p t o n M. B a x translocates to mitochondria of heart cells during simulated ischaemia: involvement of AMP-activated and p38 mitogen-activatedprotein kinases[j]. Biochem J, 2006, 395(1): [28] Zhao Q, Barakat BM, Qin S, et al. The p38 mitogen-activated protein kinase augments nucleotide excision repair by mediating DDB2 degradation and chromatin relaxation[j]. Biol Chem, 2008, 283(47): [ 本文编辑 ] 张俊彦

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼,

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼, 1072 基础研究 Basic Research www.tumorsci.org 肿瘤 2011 年 12 月第 31 卷第 12 期 TUMOR Vol. 31, December, 2011 DOI: 10.3781/j.issn.1000-7431.2011.12. 004 Copyright 2011 by TUMOR 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat