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悦妮周
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1 摇南京农业大学学报摇 2011,34(6):77-81 摇 Journal of Nanjing Agricultural University http: / / nauxb. njau. edu. cn 試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試马欣, 刘俊, 乔俊卿, 等. 利用转座子 TnYLB-1 构建枯草芽孢杆菌的突变体文库 [J]. 南京农业大学学报,2011,34(6):77-81 利用转座子 TnYLB-1 构建枯草芽孢杆菌的突变体文库 * 马欣, 刘俊, 乔俊卿, 伍辉军, 高学文 ( 南京农业大学植物保护学院 / 农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室, 江苏南京 ) 摘要 : 为了鉴定枯草芽孢杆菌定殖和促进植物生长相关基因, 用携带转座子 TnYLB-1 的穿梭载体 pmara 转化枯草芽孢杆菌 OKB105 菌株高温诱变条件下, 筛选了个转座子插入突变的单克隆, 构建了 OKB105 菌株的突变体文库对随机挑选的 15 个突变体采用 PCR 及 Southern 杂交验证, 结果表明 : 转座子 TnYLB-1 以单拷贝随机方式插入到 OKB105 菌株的染色体上关键词 : 枯草芽孢杆菌 OKB105;TnYLB-1 转座子 ;pmara 质粒 ;Himar1 转座元件 ; 随机诱变中图分类号 :S 摇摇摇摇文献标志码 :A 摇摇摇摇文章编号 : (2011) Construction of transposition insertion library of Bacillus subtilis by using transposon TnYLB 鄄 1 MA Xin,LIU Jun,QIAO Jun 鄄 qing,wu Hui 鄄 jun,gao Xue 鄄 wen * ( College of Plant Protection / Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests, Ministry of Education,Nanjing Agricultural University,Nanjing ,China) Abstract:In order to identify new genes involved in colonizing in plant rhizosphere and promoting plant growth of Bacillus subtilis,in 鄄 sertional mutagenesis of B. subtilis OKB105 was performed by use of a Himar1 鄄 based transposon TnYLB 鄄 1. The plasmid pmara carrying the transposon TnYLB 鄄 1 were transformed into OKB105 and transposants were selected randomly under the condition of high temperature. PCR and Southern hybridization analyses of 15 transposants showed that TnYLB 鄄 1 transposed into the B. subtilis chromosome randomly. Key words:bacillus subtilis OKB105;transposon TnYLB 鄄 1;plasmid pmara;transposable element Himar1;random mutagenesis 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 是一类重要的植物根围促生细菌 (plant growth 鄄 promoting rhizobacteria, PGPR), 存在于植物根的表面 (rhizoplane) 根围 (rhizoshphere) 和根的内部, 与植物共生 [1] 它不仅具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力 [2], 而且在植物根部施用可显著促进植物生长 [3] 枯草芽孢杆菌 OKB105 菌株对防治辣椒病毒病和烟草花叶病毒病均有较好的效果, 并且能够诱导植物促生相关基因的表达, 温室施用可以显著提高烟草株高和鲜重 [4] 目前, 虽然枯草芽孢杆菌的生防优势越来越明显, 但是芽孢杆菌在植物根部定殖和促进植物生长的分子作用机制尚不清楚在大量的分子遗传研究方法中, 转座子随机诱变技术因操作简便而备受关注转座子及其衍生物作为插入突变原或分子标签已被广泛应用于基因的分离和克隆当中 [5], 特别是某些具有随机转座特性的转座子, 已成为发现新基因, 克隆功能基因, 发掘已知基因的新功能以及研究蛋白功能的有效工具 [6] Himar1 转座元件是从角蝇 (Haematobia irritans) 中分离得到的 [6], 与其他转座子相比, 具有转座频率高插入位点随机性高的突出优点本研究主要利用 Himar1 转座诱变体系构建 OKB105 菌株的突变体文库, 其中,pMarA 是专为随机诱变芽孢杆菌而设计的穿梭载体, 携带有 TnYLB-1 转座子高温敏感的芽孢杆菌复 A 制子以及依赖滓启动子引导的 Himar1 转座酶 50 益高温诱导条件下,pMarA 质粒无法复制, 在 Himar1 转座酶的催化作用下,TnYLB-1 转座子可以插入到枯草芽孢杆菌基因组任意的 TA 序列中, 导致基因被随机诱变失活 [7] 本文研究了适合 B. subtilis OKB105 菌株感受态细胞转化 pmara 质粒的方法和条件通过转座子收稿日期 : 基金项目 : 国家转基因生物新品种培育重大专项 (2011ZX ); 国际科技合作项目 (2009DFA32740); 公益性行业 ( 农业 ) 科研专项 (3-23); 国家 863 计划项目 (2006AA10Z172); 国家大学生创新性实验计划项目 ( ) 作者简介 : 马欣, 硕士研究生 * 通讯作者 : 高学文, 教授, 博导, 研究方向为分子植物病理学和植物病害生物防治,E 鄄 mail:gaoxw@ njau. edu. cn

2 78 南摇京摇农摇业摇大摇学摇学摇报第 34 卷 TnYLB-1 对 B. subtilis OKB105 进行随机突变, 并成功构建了该菌株的突变体文库, 为下一步通过生物检测等方法筛选与该菌株定殖促进植物生长及生防相关基因提供了基础 1 摇材料与方法 1. 1 摇供试菌株质粒及培养条件枯草芽孢杆菌 OKB105 菌株及其突变体大肠杆菌 DH5 琢均在 LB 培养基 (Luria broth [8] ) 上 37 益条件下培养 ; 枯草芽孢杆菌转化子 OKB105 鄄 MA 在 LB 培养基上 30 益条件下培养所用抗生素及其浓度如下 : 氨苄青霉素 100 滋 g ml -1, 红霉素 10 滋 g ml -1, 卡那霉素 5 滋 g ml -1 供试菌株及质粒见表 1 菌株 / 质粒 Strain / plasmid 摇摇 Escherichia coli Table 1 摇表 1 摇供试菌株和质粒 Bacterial strains and plasmids used in this study 相关基因型或性状 Relevant genotype or characteristics 来源或参考文献 Source or reference 摇摇摇 DH5 琢 F - 椎 80dlacZ 驻 M12 minireca Laboratory stock 摇摇 Bacillus subtilis 摇摇摇 OKB105 phea1 sfp+,surfactin producer,jh642 transformed with DNA of ATCC [9] 摇摇摇 OKB105 鄄 MA OKB105 transformed with pmara;erm r,km r This study 摇摇 Plasmids 摇摇摇 pmara Shuttle vector carrying TnYLB 鄄 1transposon and mariner 鄄 Himar1 transpose;puc replicon,thermosensitive replicon for gram 鄄 positive hosts;km r,ap r,erm r [7] 摇摇注 :Ap r : 氨苄青霉素抗性 Ampicillin resistance;km r : 卡那霉素抗性 Kanamycin resistance;erm r : 红霉素抗性 Erythromycin 1. 2 摇酶试剂和引物本研究所用的限制性内切酶 EcoR 玉和 Kpn 玉及 Taq 酶均为 TaKaRa 公司产品 ; 氨苄青霉素红霉素卡那霉素均购自 Sigma 公司 ; 其他试剂均为国产分析纯 ; 引物合成由南京金斯特公司完成, 所用引物参见表 2; 基因测序由南京金斯特公司完成引物名称 Primer name Table 2 摇表 2 摇本研究所用引物 Oligo DNA primers used in this study 引物序列 (5 忆寅 3 忆 ) Primer sequence 引物来源或参考文献 Source or reference 摇摇 oatnpfwd 摇摇 cccggtcaatggagcaattcggacgattgacaagc(kpn 玉 ) [7] 摇摇 oatnprev 摇摇 cccggtcaagtcgacgcagattccggtctaacaaag(kpn 玉 ) [7] 摇摇 oitr 摇摇 cccctgcagtaacaggttggctgataagtccccggtct(pst 玉 ) [7] 摇摇 Kan 鄄 Fwd 摇摇 TCCCCAGTAAGTCAAAAAATAG This study 摇摇 Kan 鄄 Rev 摇摇 ATCAGGCTCTTTCACTCCATCG This study 摇摇注 : 引物中的酶切位点均用下划线标出 Restriction sites in primers are underlined 摇枯草芽孢杆菌 OKB105 菌株突变体文库的构建摇 OKB105 菌株转化 pmara 质粒摇枯草芽孢杆菌 OKB105 感受态细胞的制备参照 Spizizen [10] 的方法, 菌株感受态细胞制备过程中所需的 SP 玉培养基和 SP 域培养基配方见文献 [11] 每 500 滋 L 感受态细胞中加入 15 滋 L pmara 质粒 (1 滋 g), 轻轻混匀,30 益 100 r min -1 振荡培养 30 min 此后, 加入 600 滋 L 含 5 滋 g 滋 L -1 红霉素的 LB 液体培养基,30 益 200 r min -1 继续振荡培养 1. 5 h; 取转化后的培养物 100 滋 L 涂布于含 10 滋 g 滋 L -1 红霉素的 LB 平板,30 益静置 24 h; 挑取转化子, 计数转化子数并计算转化效率 [10] 转化试验重复 3 次, 每次设 3 个重复摇转化子 OKB105 鄄 MA 的验证摇将转化子接种于含 5 滋 g ml -1 卡那霉素的 LB 液体培养基中,30 益培养 12 h, 采用 Invitrogen 公司的质粒提取试剂盒提取转化子质粒用 Kpn 玉对 1 滋 g 转化子 OKB105 鄄 MA 的质粒进行单酶切验证,20 滋 L 反应体系, 具体步骤参照 Spizizen [10] 的方法参照文献 [7] 的方法, 用引物 oatnpfwd 和 oatnprev 扩增转化子 OKB105 鄄 MA 质粒的 Himar1 转座酶编码基因片段扩增程序 :96 益 2 min;94 益 45 s,62 益 1 min,72 益 2 min,30 个循环 ;72 益 10 min 摇高温诱导 TnYLB-1 转座插入 OKB105 菌株基因组摇将转化子 OKB105 鄄 MA 接种于含 10 滋 g 滋 L -1 红霉素的 LB 液体培养基中,30 益 200 r min -1 振荡培养 18 h; 取菌液 150 滋 L 转接于含 10 滋 g 滋 L -1 红霉素的 25 ml LB 液体培养基中,30 益 200 r min -1 振荡培养 12 h; 将菌液稀释 10 5 ~ 10 6 倍, 取 200 滋 L 涂布

摇第 6 期马欣, 等 : 利用转座子 TnYLB-1 构建枯草芽孢杆菌的突变体文库 79 于含 5 滋 g 滋 L -1 卡那霉素的 LB 平板,50 益高温培养 12 ~ 16 h; 随机挑取单菌落 2 000 个, 构建突变体文库 1.

鄄 Fwd Kan 鄄 Rev 扩增转座子 TnYLB-1 中卡那霉素抗性编码基因的部分片段, 大小约 370 bp, 纯化回收后经 DIG 标记为探针 EcoR 玉过夜酶切 15 个突变体基因组, 电泳转膜进行 Southern 杂交 Southern 杂交及探针标记等参照 Roche 公司的 DIG 试剂盒操作程序进行 2 摇结果与分析 2.

3 摇第 6 期马欣, 等 : 利用转座子 TnYLB-1 构建枯草芽孢杆菌的突变体文库 79 于含 5 滋 g 滋 L -1 卡那霉素的 LB 平板,50 益高温培养 12 ~ 16 h; 随机挑取单菌落个, 构建突变体文库 1. 4 摇突变体中 TnYLB-1 插入位点随机性及拷贝数检测 [12] 从突变体文库中随机挑选 15 个突变体, 参照 Liu 等的方法提取突变体基因组参照文献 [7] 的方法, 采用引物 oitr 扩增突变体基因组的 TnYLB-1 片段扩增程序 :96 益 2 min;94 益 45 s,66 益 1 min, 72 益 2 min,30 个循环 ;72 益 10 min 用引物 Kan 鄄 Fwd Kan 鄄 Rev 扩增转座子 TnYLB-1 中卡那霉素抗性编码基因的部分片段, 大小约 370 bp, 纯化回收后经 DIG 标记为探针 EcoR 玉过夜酶切 15 个突变体基因组, 电泳转膜进行 Southern 杂交 Southern 杂交及探针标记等参照 Roche 公司的 DIG 试剂盒操作程序进行 2 摇结果与分析 2. 1 摇枯草芽孢杆菌 OKB105 菌株转化 pmara 质粒将穿梭载体 pmara 转化入枯草芽孢杆菌 OKB105 的感受态细胞中, 挑取转化子, 并对转化子 OKB105 鄄 MA 的质粒进行 Kpn 玉酶切及 PCR 验证结果显示, 用 Kpn 玉分别对 pmara 质粒和 OKB105 鄄 MA 质粒酶切后, 都形成 2 个大小约为 1. 5 kb 和 6. 5 kb 的片段 ( 图 1);PCR 扩增 OKB105 鄄 MA 质粒及 pmara 质粒中的 Himar1 转座酶编码基因, 都得到长度约为 1. 5 kb 的片段 ( 图 2) 上述结果表明,pMarA 质粒已成功转入枯草芽孢杆菌 OKB105 菌株中另外,3 次转化重复试验结果显示 ( 表 3),OKB105 菌株转化 pmara 质粒的平均转化效率为伊 10-8, 表明该菌株对 pmara 质粒的转化效率极低图 1 摇枯草芽孢杆菌 OKB105 鄄 MA 转化子质粒的 Kpn 玉酶切验证 Fig. 1 摇 Kpn 玉 digestion of the plasmid extracted 摇 from Bacillus subtilis OKB105 鄄 MA 摇摇 1. pmara;2. OKB105 鄄 MA 质粒 pmara extracted from OKB105 鄄 MA;M1. DNA marker( 姿鄄 Hind 芋 digest);m2. DNA maker(dl2000) 摇图 2 摇枯草芽孢杆菌 OKB105 鄄 MA 转化子质粒的 Himar1 转座酶编码基因 PCR 验证 Fig. 2 摇 PCR amplification of Himar1 transposase gene of the plasmid extracted from B. subtilis OKB105 鄄 MA 摇摇 1. pmara;2. OKB105 鄄 MA 质粒 pmara extracted from OKB105 鄄 MA;3. 对照 Water control;m. DNA maker(dl2000) 转化试验 Transformation test 表 3 摇 Table 3 摇 OKB105 菌株对 pmara 质粒的转化效率 Transformation efficiency of B. subtilis OKB105 转化子数 / (CFU ml -1 ) Transformants 细胞总数 / (CFU ml -1 ) Total cell count 转化效率 Transformation efficiency 摇摇第 1 次 The first time 伊伊 10-8 摇摇第 2 次 The second time 伊伊 10-8 摇摇第 3 次 The third time 伊伊摇高温诱导转座子 TnYLB-1 随机插入 OKB105 菌株基因组 [7] Le Breton 等报道, 在高温条件下 TnYLB-1 被诱导随机插入到枯草芽孢杆菌的基因组中, 而 pmara 质粒的残余部分会消失, 质粒上的红霉素抗性也会随之消失因此, 根据同一单菌落在含卡那霉素抗性的培养基上能够生长, 而在含红霉素抗性的培养基上不能生长的特性, 挑取了个突变体构成 OKB105 菌株的突变体文库

OKB105 突变体基因组中 TnYLB-1 转座子的 PCR 验证 Fig. 3 摇 PCR amplification of TnYLB 鄄 1 transposon of genomes extracted from 15 mutants randomly selected from the mutant library of B. subtilis OKB105 摇摇 1 ~ 15.

4 80 南摇京摇农摇业摇大摇学摇学摇报第 34 卷 2. 3 摇突变体中转座子插入位点随机性及拷贝数从 OKB105 菌株的突变体文库中随机挑选了 15 个突变体,PCR 检测结果 ( 图 3) 表明,15 个突变体基因组 DNA 中都扩增出约 1. 5 kb 的片段, 与以质粒 pmara 为模板扩增出的片段大小一致, 而从野生型 OKB105 菌株基因组中不能扩增出该片段, 说明 TnYLB-1 的转座插入成功进一步的 Southern 杂交结果 ( 图 4) 显示,15 个突变体的杂交信号带都是单一的且位置几乎各不相同, 这说明 TnYLB-1 已成功以单拷贝随机插入到枯草芽孢杆菌 OKB105 基因组中图 3 摇枯草芽孢杆菌 OKB105 突变体基因组中 TnYLB-1 转座子的 PCR 验证 Fig. 3 摇 PCR amplification of TnYLB 鄄 1 transposon of genomes extracted from 15 mutants randomly selected from the mutant library of B. subtilis OKB105 摇摇 1 ~ 15. 分别对应随机挑选的 15 个突变体 15 mutants randomly selected from the mutant library of B. subtilis OKB105;16. pmara; 17. OKB105 菌株 B. subtilis OKB105;M. DNA maker(dl2000) 图 4 摇枯草芽孢杆菌 OKB105 突变体基因组中 TnYLB-1 的 Southern blot 检测 Fig. 4 摇 Southern blot hybridization analysis of TnYLB 鄄 1 insertion position and copies in transposon mutants of B. subtilis OKB105 摇摇 1 ~ 15. 分别对应随机挑选的 15 个突变体 15 mutants randomly selected from the mutant library of B. subtilis OKB105;16. B. subtilis OKB105;M. DNA marker ( 姿 -Hind 芋 digest) 3 摇讨论本研究以 B. subtilis OKB105 为出发菌株, 制备其感受态细胞, 并成功转化了 pmara 质粒研究发现, OKB105 菌株对 pmara 质粒的转化效率极低, 仅为伊 10-8, 这可能是由于 pmara 质粒过大 ( 约 bp), 增加了转化的难度 ; 此外, 枯草芽孢杆菌的感受态是在对数生长后期开始形成的, 只有当细胞分泌到培养基中的感受态信息素浓度达到一定临界值时才能诱导感受态的形成, 感受态的形成受到一种二元信号转导系统的调节 [13], 对数生长后期细胞的数量也是影响感受态形成的因素之一虽然本试验得到的转化子较少, 但相对大量很难进行遗传转化的野生型芽孢杆菌,OKB105 菌株的遗传转化能力成为转座子随机诱变构建菌株突变体文库的重要前提本试验采用 50 益高温诱导 TnYLB-1 转座插入的方法, 得到了大量的 OKB105 菌株突变体 Southern 杂交结果显示,TnYLB-1 在 15 个随机挑选的突变体基因组中均为单插入, 并且插入位置各不相同, 说明转座子随机单拷贝插入的 OKB105 菌株突变体文库构建非常成功 Himar1 转座元件是在细菌诱变中应用最广泛的 Mariner 家族转座子 [14] 与 Tn917 和 Tn10 相比,Mariner 家族转座元件除了 TA 之外没有特定

5 摇第 6 期马欣, 等 : 利用转座子 TnYLB-1 构建枯草芽孢杆菌的突变体文库 81 的靶标序列, 其转座插入位点更具有随机性 [15] 另外,Mariner 家族转座元件的寄主范围广泛不依赖寄主特异性因子的特性, 可使其在不同种类生物中发生水平转移 [16] 基于 Himar1 转座元件所构建的穿梭载体 pmara 及其所携带的 TnYLB 转座子是芽孢杆菌转座诱变及基因功能研究的新型有效工具, 已被成功地应用于 B. subtilis 的新陈代谢生理生化过程, 如氨基酸的生物合成菌体的运动等相关调控基因的研究中 [17-18] 目前, 对于枯草芽孢杆菌定殖和促进植物生长的相关活性物质及其编码基因的研究极少, 今后, 可通过以本研究构建的 OKB105 菌株突变体文库为基础试验材料筛选定殖和促进植物生长缺陷型突变体的方法, 鉴定和克隆相关基因, 从基因组水平进一步研究枯草芽孢杆菌定殖和促进植物生长的机制参考文献 : [1] 摇 McInroy J A,Kloepper J W. Survey of indigenous bacterial endophytes from cotton and sweet corn[j]. Plant Soil,1995,173: [2] 黄海婵, 裘娟萍. 枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究进展 [J]. 浙江农业科学,2005(3): [3] Broadbent P, Baker K F, Franks N, et al. Effect of Bacillus spp. on increased growth of seedlings in steamed and nontreated soil [ J]. Phytopathology,1977,67: [4] Wang S,Wu H J,Qiao J Q,et al. Molecular mechanism of plant growth promotion and induced systemic resistance to tobacco mosaic virus by Bacillus spp. [ J]. J Microbiol Biotechnol,2009,19(10): [5] 张卉, 王小珂, 马世俊. 转座元件 mariner[j]. 遗传,2004,26(5): [6] Rubin E J,Akerley B J,Novik V N,et al. In vivo transposition of mariner 鄄 based elements in enteric bacteria and mycobacteria[ J]. Proc Natl Acad Sci USA,1999,96: [7] Le Breton Y,Mohapatra N P,Haldenwang W G. In vivo random mutagenesis of Bacillus subtilis by use of TnYLB 鄄 1,a mariner 鄄 based transposon [ J]. Appl Environ Microbiol,2006,72: [8] 龙菊英, 张桂英, 王金生. 水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因的敲除 [J]. 南京农业大学学报,2006,29(2):50-56 [9] Nakano M M,Marahiel M A,Zuber P. Identification of a genetic locus required for biosynthesis of the lipopeptide antibiotic surfactin in Bacillus subtilis[ J]. J Bacteriol,1988,170: [10] Spizizen J. Transformation of biochemically deficient strains of Bacillus subtilis by deoxyribonucleate[ J]. Proc Natl Acad Sci USA,1958,44: [11] 刘俊. 解淀粉芽孢杆菌 C06 防治桃褐腐病菌的机制及其产生的酌 - 多聚谷氨酸在定殖中的作用 [D]. 南京 : 南京农业大学,2010: [12] Liu J,He D,Li X Z. 酌鄄 Polyglutamic acid( 酌鄄 PGA)produced by Bacillus amyloliquefaciens C06 promoting its colonization on fruit surface[j]. Int J Food Microbiol,2010,142: [13] Maamar H,Raj A,Dubnau D. Noise in gene expression determines cell fate in Bacillus subtilis[ J]. Science,2007,317: [14] Lampe D J,Akerley B J,Rubin E J,et al. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon[ J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1999,96: [15] Picardeau M. Transposition of fly mariner elements into bacteria as a genetic tool for mutagenesis[ J]. Genetica,2010,138: [16] Lampe D J,Churchill M E A,Robertson H M. A purified mariner transposase is sufficient to mediate transposition in vitro[ J]. EMBO J,1996,15 (19): [17] Patrick J E,Kearns D B. MinJ(YvjD)is a topological determinant of cell division in Bacillus subtilis[j]. Mol Microbiol,2008,70(5): 玉 [18] Schirner K,Errington J. The cell wall regulator 啄 specifically suppresses the lethal phenotype of mbl mutants in Bacillus subtilis[ J]. J Bacteriol, 2009,191(5): 责任编辑 : 夏爱红

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽