. 弘光學報 56 期. 壹前言近年來皮膚美白產品一直為保養品研發的主軸之一, 而影響美白最主要的因素為黑色素 (Melanin) 的生成黑色素由皮膚的黑色素細胞 (Melanocyte) 負責製造, 而黑色素細胞位於皮膚表皮的基底層 (Basal layer) 通常皮膚受紫外線照射時, 會刺激

Size: px

Start display at page:

Download ". 弘光學報 56 期. 壹前言近年來皮膚美白產品一直為保養品研發的主軸之一, 而影響美白最主要的因素為黑色素 (Melanin) 的生成黑色素由皮膚的黑色素細胞 (Melanocyte) 負責製造, 而黑色素細胞位於皮膚表皮的基底層 (Basal layer) 通常皮膚受紫外線照射時, 會刺激"

悍榔巫
7 years ago
Views:

1 . 莨菪素抑制酪胺酸酶功效之研究. 莨菪素抑制酪胺酸酶功效之研究周玉青 1 黃蕙君 2 張聰民 1* 1 弘光科技大學化妝品科技研究所 2 中國醫藥大學醫學檢驗生物技術學系收到日期 : 修訂日期 : 接受日期 : 摘要莨菪素 (Scopoletin;6-methoxy-7-hydroxycoumarin) 廣泛存在於植物中, 可從芸香科白鮮屬芸香科九里香屬等植物中萃取, 為香豆素 (coumarin) 化合物之一根據過去研究, 莨菪素作用於家兔具有抗凝血的功效, 此外, 還具有抗菌抗氧化抗腫瘤等多項藥理活性本研究初步先測試不同濃度莨菪素是否能抑制蕈菇酪胺酸酶活性, 並將莨菪素與麴酸 (Kojic acid) 酪胺酸酶一起反應, 觀察酵素活性之變化情形接著使用老鼠 B16-F10 黑色素瘤細胞來探討莨菪素對細胞內黑色素含量以及酪胺酸酶活性的影響研究結果顯示, 高濃度莨菪素 (2 mm~10 mm) 可以抑制蕈菇酪胺酸酶的活性, 隨著濃度愈高, 抑制效果愈佳但與麴酸一起反應後的酵素抑制效果, 與單獨使用莨菪素或麴酸比較, 並沒有明顯的協同作用而使用低濃度莨菪素 (25 µm 50 µm 100 µm) 能抑制細胞中酪胺酸酶活性, 並且使 B16-F10 細胞內黑色素含量減少未來將進一步探討莨菪素可能的美白機轉, 並評估將莨菪素應用於美白保養品配方的可能性關鍵詞 : 莨菪素酪胺酸酶黑色素美白 170 * 通訊作者

2 . 弘光學報 56 期. 壹前言近年來皮膚美白產品一直為保養品研發的主軸之一, 而影響美白最主要的因素為黑色素 (Melanin) 的生成黑色素由皮膚的黑色素細胞 (Melanocyte) 負責製造, 而黑色素細胞位於皮膚表皮的基底層 (Basal layer) 通常皮膚受紫外線照射時, 會刺激表皮角質細胞 (Keratinocytes) 釋放內皮細胞素 -1(Endothelin-1;ET-1), 進而與黑色素細胞之細胞膜上的接受體 (ET-1 receptors) 結合, 訊息傳遞至黑色素細胞內活化黑囊體 ( m e l a n o s o m e s ) 膜上的酪胺酸酶 (tyrosinase), 催化黑色素的產生, 接著黑色素會經由細胞代謝由基底層逐漸移至表皮層, 正常生理情況製造的黑色素會隨著皮膚的代謝而分解, 不會影響膚色 (Takayuki Hanamura, 2008;Valentina Robila, 2008) 但如果在短時間內曝曬紫外光, 過量的黑色素無法藉由皮膚代謝排出表層, 就會沈澱於表皮層內 ; 如果黑色素均勻沈澱, 膚色就單純變深褐色或黑色, 但如果為局部沈澱即會產生斑點, 例如雀斑黑斑 (Yoshinori Miyamura, 2006;S. H. Lim, 2008) 雀斑屬於單純性褐色或淡黑色的斑點, 主要分佈於臉部為主, 尤其是雙側臉頰與眼睛下方, 且呈現對稱性, 通常於雙側臉頰的中央部位較密集, 女性發生率較高, 因個人體質而異黑斑可分為存在於表皮層 ( 雀斑曬斑 ) 以及存在於真皮層 ( 顴骨斑痣 ), 減少黑斑的形成可藉由抑制酪胺酸酶達到減少黑色素合成的作用, 以及淡化黑色素或是直接破壞黑色素細胞然而另一方面, 黑色素的生成對肌膚而言是具有自我保護作用, 當皮膚受到紫外線 A 波 (Ultraviolet A;UVA; nm) 以及紫外線 B 波 (Ultraviolet B;UVB; nm) 刺激時, 皮膚就會產生黑色素來避免進一步的光照傷害, 其中 UVA 可穿透表皮刺激真皮層, 而 UVB 主要作用於表皮的基底層, 但過度曝曬於紫外線中可能會使細胞產生病變, 甚至導致黑色素腫瘤的發生除了紫外線的刺激會引起黑色素的產生, 像是內在因素 ( 先天性遺傳壓力飲食疾病藥物內分泌失調生活習慣 ) 以及其它外在因素 ( 使用不適當的化妝品 ) 皆可能會活化酪胺酸酶, 進而使黑色素在皮膚產生色素沈澱的現象因此在皮膚美白的過程中, 必須同時進行防曬的工作, 美白方面主要是將生成的黑色素慢慢淡化, 而防曬主要是協助皮膚避免新的黑色素產生此外, 改善飲食習慣適當的飲水以及多吃蔬果類食物, 對於保護美白皮膚都具有協助的作用在過去研究中已被證實且被允許可以應用於化妝品配方中的美白成份有維生素 C 磷酸鎂複合物 (Magnesium ascorbyl Phosphate) 麴酸(Kojic acid) 維生素 C 醣苷 (Ascorbyl glucoside) 及熊果素 (Arbutin) (Shou-Chieh Huang, 2004) 根據衛生署 89 年公告, 可使用於含藥化妝品之美白成份中維生素 C 磷酸鎂複合物的使用限量為 3%, 麴酸為 2%, 維生素 C 醣苷為 2% 以及熊果素 7% 其中維生素 C 磷酸鎂複合物與維生素 C 醣苷皆為維生素 C(Ascorbic acid) 的衍生物, 其美白原理為干擾酪胺酸 (tyrosine) 氧化反應麴酸存在於發酵的自然食物中, 為古代釀酒及製造醬油味噌的重要角色而麴酸則因多樣特性而變得愈來愈受眾人重視, 例如抗菌活性以及延緩黑化 (melanism) 的發生, 其美白作用機轉為螫合銅離子 (Cu 2+ ) 而抑制黑色素的生成, 達到淡化雀斑曬斑等作用 (Jieshu Liu, 2008) 熊果素萃取自名稱為熊果葉之樹葉, 可從水果 ( 西洋梨小山梨 ) 或是植物 ( 虎耳草 ) 中萃取出其作用原理為抑制酪胺酸酶活性, 減少黑色素的生成, 進而達到美白的功效 (Kazuhisa Sugimoto, 2004) 除了使用含有美白成份之試劑外, 也可藉 171

3 . 莨菪素抑制酪胺酸酶功效之研究. 由加速皮膚新陳代謝達到美白功效黑色素形成的原因之一為角質代謝過慢因此, 於美白產品中加入酸性物質, 例如維生素 A 酸 (Retinoic acid) 水楊酸(salicylic acid) 維生素 A 酸為人工合成結構類似維生素 A 的藥物, 能直接抑制酪胺酸酶活性, 並能促進表皮更新而抑制黑色素形成, 達到美白效果而水楊酸, 又稱鄰羥基苯甲酸, 可以溶解角質細胞, 使角質層產生脱落, 進而去除積聚過厚的角質層達到促進新陳代謝的功效, 同時也能代謝位於角質層的黑色素, 達到美白的效果莨菪素 ( S c o p o l e t i n ; 6 - m e t h o x y hydroxycoumarin) 為一種含酚香豆素化合物, 具有許多藥理活性 (Eun-Kyung Kim, 2005) 莨菪素的分子式為 C 10 H 8 O 4, 分子量為 , 為 Scopolin 的配質 (aglucone) 存在於東莨菪 (Scopolia japonica Maxim.) 歐莨菪(Scopolia carniolica Jacq.) 顛茄(Atropa belladonna L.) 樹番茄(Solanaceae) 的根部 (Maryadele J. O Neil, 2006) 以及白鮮屬植物表皮的部位 ( 李佳穎,2002) 溶於氯仿(chloroform) 或醋酸 (acetic acid) 時呈現針狀或棱柱狀, 熔點為 204 輕微溶於水(water) 或是冰乙醇 (cold alcohol) 溶於熱乙醇(hot alcohol) 或熱冰醋酸 (hot glacial acetic acid) 適度溶於氯仿 (chloroform) 幾乎不溶於苯(benzene) 溶於含酒精溶液時呈現藍色螢光反應 (Maryadele J. O Neil, 2006) 莨菪素在過去已被證實具有抗菌 (Claire Gachon, 2004) 抗氧化抗發炎和止痛的特性, 而且能夠刺激老鼠腹膜的巨噬細胞 (macrophages) 進而減少類二十碳酸 (eicosanoids) 的釋放 (Flavia Carla Meotti, 2006) 經由 Kim 等人研究證實莨菪素能夠減少前列腺素 E 2 (prostaglandin E 2 ;PGE 2 ) 腫瘤壞死因子 -α(tumour necrosis factor-α;tnf-α) 介白素 -1β(interleukin-1β;IL-1β) 介白素 -6(interleukin-6;IL-6) 的產生以及抑制環氧合酶 -2(cyclooxygenase-2;COX-2), 但不能抑制環氧合酶 -1(cyclooxygenase-1;COX-1) 的表現 (Kim, 2004) 有些特殊的重要研究指出, 莨菪素對於醋酸 (acetic acid) 導致內臟的疼痛具有良好的抑制能力 (Flavia Carla Meotti, 2006), 此外, 根據以往的研究, 莨菪素亦具有抑制家兔凝血的功效 ( 劉淑鈴,2001) 造成皮膚色素沈著最主要的因素是由於暴露於紫外光照射, 導致黑色素細胞內的黑色素合成, 其中酪胺酸酶 (tyrosinase) 是催化黑色素合成的主要關鍵酵素, 其催化途徑有 : 使酪胺酸 (tyrosine) 產生羥化反應 (hydroxylation) 轉變為多巴 (Dopa;3,4-dihydroxyphenylalan ine) 使 Dopa 產生氧化反應 (oxidation) 變為多巴 (dopaquinone) 以及使 5,6- 二羥基吲 (5,6-dihydroxy indole;dhi) 轉變為吲奎林 (indole-quinone)(vincent J. Hearing, 1991) 參與調節黑色素合成有兩個重要蛋白質, 包含酪胺酸酶相關蛋白質 -2(Tyrosinase-related protein-2;trp-2;dopa chrometautomerase), T R P - 2 最主要為催化 D o p a c h r o m e 轉變為 DHICA(5,6-dihydroxy indole carboxylic acid), 另一個為酪胺酸酶相關蛋白質 -1(Tyrosinase-related protein-1;trp-1;dhica oxidase), 主要催化 DHICA 的氧化反應 (Kazuomi. Sato, 2008) 本研究先針對不同濃度的莨菪素來測試是否對蕈菇酪胺酸酶有抑制效果, 並且試著加入過去已證實有美白作用的麴酸 (Kojic acid), 來探討莨菪素與麴酸是否有美白協同作用而後再選擇適當的莨菪素濃度處理老鼠 B16-F10 黑色素瘤細胞, 針對細胞中黑色素的含量以及酪胺酸酶的活性做深入探討 172

4 . 弘光學報 56 期. 貳材料與方法一實驗材料與細胞株本研究所使用之藥品大多購自 Sigma 公司, 詳列如下 : 莨菪素 (6-methoxy-7-hydroxycoumarin; Scopoletin) 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine(L- D o p a ) M o n o p h e n o l m o n o o x y g e n a s e (Tyrosinase) 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide(mtt) Dimethyl sulfoxide(dmso) Trypan blue Kojic acid α-msh Triton X-100 其它藥品購買公司, 詳列如下 : D u l b e c c o s m o d i f i e d E a g l e ' s medium(dmem)( 岑祥股份有限公司 ) S o d i u m B i c a r b o n a t e ( N a H C O 3 ) ( R i e d e l - dehën) NaOH(Riedel-deHën) Penicillin- Streptomycin Solution(P/S)(HyClone ) Fetal bovine serum(fbs)(hyclone ) Trypsin 0.25%(1X)(HyClone ) Phenylmethylsulfonyl fluoride(pmsf)(amresco ) 細胞株來源, 說明如下 : 購自食品工業研究所菌種中心 / 國家衛生研究院細胞庫購買, 老鼠黑色素細胞瘤細胞株, 名稱為 B16-F10(BCRC:60031), 屬於貼附型細胞 (Adherent-type cell) 培養於 37 5% CO 2 的細胞培養箱本實驗使用儀器如下 : 多功能微量盤偵測儀 (ELISA reader; TECAN sunrise; 太暘貿易股份有限公司 ) 離心機 (Microfuge 18 Centrifuge; 伯昂興業有限公司 ) 二細胞外酪胺酸酶活性測試 (Yeon Hee Kong et al, 2008) 以 67 mm phosphate buffer(ph6.8) 配製 5 mm L-Dopa, 取 120 µl 加入 96 well 平盤孔洞中, 加入 40 µl 不同濃度試劑, 每孔洞加入 40 µl tyrosinase(2 units), 放置於 37 反應 30 分鐘, 使用多功能微量盤偵測儀 (ELISA reader) 測波長 490 nm 吸光值, 其酪胺酸酶活性抑制率 (%) 計算公式為 (A-B)/A 100%;A= 控制組試劑 (Control sample);b= 測試組試劑 (Test sample) 三配製細胞培養基先將 DMEM 粉末 13.4 g 加入 800 ml 去離子水, 攪拌均勻, 接著加入 1.5 g NaHCO 3 後, 測量 ph 值, 再加入去離子水至 890 ml, 使用孔徑 0.22 µm 過濾瓶過濾, 最後加入 10 ml P/S 及 100 ml FBS, 總共 1 L, 搖晃均勻後, 放入 4 冰箱貯存四細胞存活率測試 (E u n-k y u n g K i m, 2005) 將 B16-F10 細胞 ( / 孔洞 ) 植入 96 well 平盤之孔洞中, 放置 37 5% CO 2 培養箱 24 小時後, 加入含試劑的 DMEM, 再放置培養箱 24 小時後, 使用 phosphate buffered saline(pbs) 沖洗細胞兩次每個孔洞加入 100 µl MTT(100 µg/0.1 ml PBS) 溶液後, 放入 37 反應 1 小時, 接著加入 100 µl DMSO 溶解結晶體後, 使用多功能微量盤偵測儀 (ELISA reader) 測波長 570 nm 吸光值五細胞中黑色素含量測試 ( T a k a k o Yokonawa, 2007;Kazuomi Sato, 2008) 將 B16-F10 細胞以 1x10 5 / 孔洞的密度植入 12 孔洞之平盤中, 每一個孔洞中加入 100 nm 之 α- 黑色素刺激激素 (α-melanocyte stimulating hormone;α-msh), 放置於 CO 2 培養箱 24 小時後, 加入含試劑的 D M E M, 再放置培養箱 24 小時後, 使用 PBS 沖洗細胞兩次, 加入 Trypsin-EDTA 使細胞脫離平盤後, 使用離心機 (Microfuge 18 Centrifuge), 設定離心條件 173

5 . 莨菪素抑制酪胺酸酶功效之研究. 為 r.p.m 10 分鐘後, 清除上層液體, 加入 100 µl 1M NaOH 並於 60 中反應 1 小時, 接著放置室溫冷卻, 使用多功能微量盤偵測儀 (ELISA reader) 測波長 405 nm 吸光值此實驗正向控制組為 100 µm 麴酸 (Kojic acid) 六細胞中酪胺酸酶活性測試 (T a k a k o Yokozawa, 2007) 將 B16-F10 細胞 (1x10 5 / 孔洞 ) 植入 12 孔洞平盤中, 每一個孔洞中加入 100 nm α-msh, 放置 37 5% CO 2 培養箱 24 小時後, 加入含試劑的 DMEM, 再放置於培養箱 24 小時後, 使用 PBS 沖洗細胞兩次, 加入 Trypsin- EDTA 使細胞脫離平盤後, 以轉速 r.p.m 離心 10 分鐘後, 清除上層液體後, 加入含 1% Triton X-100 和 100 µl 0.1 mm PMSF(phenylm ethylsulfonyl fluoride)/50 mm PBS(pH 6.8) 置於 -80 冷凍 30 分鐘後, 再放置室溫 30 分鐘, 重複兩次此動作後, 在 4 以 r.p.m 離心 30 分鐘, 取 80 µl 上清液和 20 µl L-Dopa(2 mg/ml) 加入 96 well 平盤孔洞中, 反應 1 小時後, 使用多功能微量盤偵測儀 (ELISA reader) 測波長 492 nm 吸光值此實驗正向控制組為 100 µm 麴酸 (Kojic acid) 參結果與討論一細胞外酪胺酸酶活性分析酪胺酸酶是黑色素合成的重要酵素 ( 例如 : 頭髮的顏色皮膚的顏色 ), 酪胺酸酶催化酪胺酸轉變為左 - 多巴 (L-Dopa), 接著產生多巴 (dopaquinone), 進而形成生物色素的表現 (Rodriquez, M. O, 1992) 為釐清莨菪素是否具有美白活性的首要工作, 便是於試管試驗測試其對蕈菇酪胺酸酶活性之影響因此, 配製不同濃度 (1 mm 2 mm 4 mm 8 mm 10 mm) 的莨菪素與蕈菇類酪胺酸酶一起反應, 本實驗使用 L-Dopa 作為酪胺酸酶之受質結果如表 1 圖 1 顯示,1 mm 的莨菪素對酪胺酸酶活性抑制率 (%) 為負值, 而 2 mm 莨菪素對酪胺酸酶活性抑制率 (%) 為正值, 而且隨著莨菪素的濃度愈高, 酪胺酸酶活性的抑制率也愈高另外, 我們試著將 0.2 mm 的麴酸分別混合 2 mm 4 mm 的莨菪素, 探討二者對酪胺酸酶酵素活性之抑制是否具有協同作用, 但結果顯示並無明顯協同效果 ( 如表 2 圖 2) 二細胞存活率分析 MTT 可以被粒線體內的脫氫酶還原產生結晶狀的深紫色產物, 因此當深紫色產物愈多時, 表示細胞存活率愈佳 (Eun-Kyung Kim, 2005) 初步先使用 2 mm 4 mm 莨菪素測其對 B16-F10 細胞存活率的影響, 如圖 3 所示, B16-F10 細胞明顯的減少, 高濃度的莨菪素可能造成 B16-F10 細胞的死亡現象因此我們調降莨菪素濃度為 25 µm 50 µm 100 µm, 加入 B16-F10 細胞中進行 MTT 測試, 最後加入 DMSO 溶解結晶物由表 3 圖 4 圖 5 可知, 莨菪素濃度至 100 µm 時,B16-F10 細胞存活率依然高達 90 % 以上, 因此後續的 B16-F10 細胞實驗皆以 25 µm 50 µm 100 µm 的莨菪素來做測試三細胞中黑色素含量分析將 B16-F10 細胞以 1x10 5 個細胞 / 孔洞的密度植入 12 孔洞平盤中, 並且加入 100 nm α-msh 後, 放入細胞培養箱待細胞貼附 24 小時, 再加入不同濃度的莨菪素 (25 µm 50 µm 100 µm) 作用時間 24 小時後, 與未加試劑 ( 只加入培養基之空白組 ) 的 B16-F10 細胞相比, 測其黑色素含量的變化由表 4 圖 6 顯示, 在 25 µm 50 µm 100 µm 的莨菪素作用下, 黑色素含量與空白組 B16-F10 細胞相比明顯的較低, 而且隨著莨菪素濃度愈高, 細胞中的黑色素含量愈低 174

6 . 弘光學報 56 期. 四細胞中酪胺酸酶活性分析於 12 孔洞平盤中植入 B16-F10 細胞, 平均每個孔洞加入 1x10 5 個細胞的密度, 隨後加入 100 nm α-msh, 置於細胞培養箱待細胞貼附 24 小時後, 加入不同濃度的莨菪素 (25 µm 50 µm 100 µm), 經過 24 小時後, 以單純含培養基的 B16-F10 細胞為對照組, 隨後利用冷凍結凍的方式使細胞膜破裂, 釋放細胞中的酪胺酸酶, 進而加入受質左 - 多巴 (L-Dopa) 進行氧化反應, 在波長 492 nm 測其吸光值的變化由表 5 圖 7 中的結果發現, 與未加入試劑的 B16-F10 細胞對照相比, 加入 25 µm 50 µm 100 µm 的莨菪素後, 酪胺酸酶活性明顯下降, 而且呈現劑量依賴性的關係, 推斷莨菪素對 B16-F10 細胞中之酪胺酸酶活性具有抑制作用肆結論本實驗結果顯示, 高濃度的莨菪素 ( 2 mm 4 mm 8 mm 10 mm) 對試管中蕈菇酪胺酸酶活性有明顯抑制作用, 當濃度愈高, 酪胺酸酶活性愈低, 具有劑量依賴的情況然而 2 mm 4 mm 之莨菪素混合 0.2 mm 的麴酸 (Kojic acid) 對酪胺酸酶活性的抑制並無明顯協同作用另一方面, 低濃度之莨菪素 (25 µm 50 µm 100 µm) 確實有減少 B16-F10 細胞中黑色素含量以及抑制酪胺酸酶活性的特性, 而且濃度愈高效果愈佳, 具有劑量依賴的情況根據目前的實驗結果, 未來將進一步將莨菪素處理 B16-F10 細胞, 測試莨菪素對細胞內酪胺酸酶在蛋白質基因層次的影響, 以釐清莨菪素可能的美白作用機轉並期望設計美白的保養品時, 可適量添加莨菪素來達到美白的功效, 結果將深具產業應用的價值伍誌謝本研究之遂行, 感謝行政院衛生署中醫藥委員會之經費贊助, 研究計劃編號 :CCMP95- TP-046, 特此誌謝陸參考文獻 1. Takayuki Hanamura, Eriko Uchida, Hitoshi Aoki. (2008). Skin-lightening effect of a polyphenol extract from Acerola(Malpighia emarginata DC.) fruit on UV-induced pigmentation. Biosci. Biotechnol. Biochem, 72 (12), Valentina Robila, Marina Ostankovitch, Michelle L. Altrich-VanLith, Alexander C. Theos, Sheila Drover, Michael S. Marks, Nicholas Restifo, Victor H. Engelhard. (2008). MHC class II presentation of gp100 epitopes in melanoma cells requires the function of conventional endosomes and is influenced by melanosomes. The Journal of Immunology, 181, Yoshinori Miyamura, Sergio G. Coelho, Rainer Wolber, Sharon A. Miller, Kazumasa Wakamatsu, Barbara Z. Zmudzka, Shosuke Ito, Christoph Smuda, Thierry Passeron, Wonseon Choi, Jan Batzer, Yuji Yamaguchi, Janusz Z. Beer and Vincent J. Hearing. (2006). Regulation of human skin pigmentation and responses to ultraviolet radiation. Pigment Cell Res, 20, S. H. Lim, S. M. Kim, Y. W. Lee, K. J. Ahn and Y. B. Choe. (2008). Change of biophysical properties of the skin caused by ultraviolet radiation-induced photodamage in Koreans. 175

7 . 莨菪素抑制酪胺酸酶功效之研究. Skin Research and Technology, 14, Shou-Chieh Huang, Cheng-Chin Lin, Ming- Chuan Huang, Kuo-Ching Wen. (2004). Simultaneous determination of magnesium ascorbyl phosphate, ascorbyl glucoside, kojic acid, arbutin and hydroquinone in skin whitening cosmetics by HPLC. Journal of Food and Drug Analysis, 12 (1), Jieshu Liu, Dazhai Zhou, Xiaopeng Liu, K a n g b i n g Wu, C h i d a n Wa n. ( ). Determination of kojic acid based on the interface enhancement effects of carbon nanotube/alizarin red S modified electrode. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 10, Kazuhisa Sugimoto, Takahisa Nishimura, Koji Nomura, Kenji Sugmoto, Takashi Kuriki. (2004). Inhibitory effects of α-arbutin on melanin synthesis in cultured human melanoma cells and a three-dimensional human skin model. Biol. Pharm. Bul, 27(4), Eun-Kyung Kim, Kang-Beom Kwon, Byung- Cheul Shin,Eun-A Seo, Young-Rae Lee, Jong- Suk Kim, Jin-Woo Park,Byung-Hyun Park, Do-Gon Ryu.(2005). Scopoletin induces apoptosis in human promyeloleukemic cells, accompanied by activations of nuclear factor κb and caspase-3. Life Sciences, 77, Maryadele J. O'Neil, Patricia E. Heckelman, Cherie B. Koch, Kristin J. Roman. (2006) THE MERCK INDEX Merck 10. Claire Gachon, Rachel Baltz and Patrick Saindrenan.(2004).Over-expression of a scopoletin glucosyltransferase in Nicotiana tabacum leads to precocious lesion formation during the hypersensitive response to tobacco mosaic virus but does not affect virus resistance. Plant Molecular Biology, 54, Flavia Carla Meotti, Juliana V. Ardenghi, Juliana B. Pretto,Márcia M. Souza, Janaína d Ávila Moura, Anildo Cunha Junior,Cristian Soldi, Moacir Geraldo Pizzolatti and Adair R. S. Santos(2006). Antinociceptive properties of coumarins, steroid and dihydrostyryl-2-pyrones from Polygala sabulosa (Polygalaceae) in mice. Journal of pharmacy and pharmacology, 58, Kim, H., Jang, S. I., Kim. Y., Chung, H., Yun, Y., Kang, T., Jeong,O., Kim, Y. (2004) Scopoletin suppresses pro-inflammatory cytokines and PGE2 from LPS-stimulated cell line, RAW cells. Fitoterapia, 75, Yukimitsu Masamoto, Yoshiyuki Murata, Kimiye Baba Yasuaki Shimoishi, Mikiro Tada, and Kyoya Takahata. (2003). Inhibitory effects of esculetin on melanin biosynthesis. Biol. Pharm. Bul, 27(3), Vincent J. Hearing, Katsuhiko Tsukamoto. (1991). Enzymatic control of pigmentation in mammals. The FASEB Journal, 5(14), Kazuomi. Sato, Masaru. Toriyama.(2008). Effect of pyrroloquinoline quinone (PQQ) on melanogenic protein expression in murine B16 melanoma. Journal of Dermatological Science, 53, Yeon Hee Kong, Youn Ock Jo, Chang- Won Cho, Dongwook Son, Soojin Park, Jeonghae Rho, and Sang Yoon Choi. (2008). 176

8 . 弘光學報 56 期. Inhibitory effects of cinnamic acid on melanin biosynthesis in skin. Biol. Pharm. Bull, 31(5), Takako Yokozawa, You Jung Kim. (2007). Piceatannol inhibits melanogenesis by its antioxidative actions. Biol. Pharm. Bull, 30 (11), Kazuomi Sato, Hideki Takahashi, Remina Iraha,and Masaru Toriyama. (2008). Downregulation of tyrosinase expression by acetylsalicylic acid in murine B16 melanoma. Biol. Pharm. Bull, 31(1), Rodriquez, M. O. Flurkey, W. H. (1992). A biochemistry project to study mushroom tyrosinase. Journal of chemical education, 69 (9), 李佳穎 (2002,7 月 ) 番紅花與狹葉白鮮皮之成份活性研究及 Phenanthraquinones 之合成成功大學化學研究所, 劉淑鈴 (2001,7 月 ) 枸杞子與其成份東莨菪素對家兔之藥動學與藥效學研究中國醫藥大學中國藥學研究所,

9 . 莨菪素抑制酪胺酸酶功效之研究. 樣品數值平均吸光值 (OD) 抑制率 (%) 莨菪素 1 mm 0.35± ±5.89 莨菪素 2 mm 0.27± ±2.38 莨菪素 4 mm 0.23± ±3.65 莨菪素 8 mm 0.20± ±3.89 莨菪素 10 mm 0.15± ±1.46 表 1. 細胞外酪胺酸酶活性抑制率樣品數值平均吸光值 (OD) 抑制率 (%) 莨菪素 2 mm 0.26± ±0.83 莨菪素 4 mm 0.23± ±1.75 莨菪素 2 mm+ 麴酸 200 µm 0.23± ±2.47 莨菪素 4 mm+ 麴酸 200 µm 0.22± ±0.75 麴酸 200 µm 0.24± ±0.43 表 2. 莨菪素混合麴酸之細胞外酪胺酸酶活性抑制率樣品數值平均吸光值 (OD) 存活率 (%) 莨菪素 0 µm( 培養基 ) 0.57± ±7.43 莨菪素 25 µm 0.54± ±7.54 莨菪素 50 µm 0.54± ±3.57 莨菪素 100 µm 0.53± ±5.63 麴酸 100 µm 0.50± ±4.49 表 3. 菪莨素對 B16-F10 細胞存活率之影響樣品數值平均吸光值 (OD) 黑色素含量 (%) 莨菪素 0 µm( 培養基 ) 0.25± ±2.38 莨菪素 25 µm 0.21± ±2.59 莨菪素 50 µm 0.18± ±2.09 莨菪素 100 µm 0.16± ±1.81 麴酸 100 µm 0.19± ±2.94 表 4. 菪莨素對 B16-F10 細胞內黑色素含量之分析 178

10 . 弘光學報 56 期. 樣品數值平均吸光值 (OD) 酪胺酸酶活性 (%) 莨菪素 0 µm( 培養基 ) 0.28± ±4.08 莨菪素 25 µm 0.24± ±3.52 莨菪素 50 µm 0.20± ±1.73 莨菪素 100 µm 0.19± ±2.15 麴酸 100 µm 0.2± ±0.70 表 5. 菪莨素對 B16-F10 細胞內酪胺酸酶活性之分析 179

11 180. 莨菪素抑制酪胺酸酶功效之研究.

12 . 弘光學報 56 期. 181

13 . 莨菪素抑制酪胺酸酶功效之研究. Study on the Tyrosinase-Inhibiting Effects of Scopoletin Yu-Ching Chou 1 Huey-Chun Huang 2 Tsong-Min Chang 1* 1 Graduate Institute of Cosmetic Science, Hungkuang Univrsity 2 Department of Medical Laboratory Science and Biotechnology, China Mdical Univrsity Received 13 February 2009 ; accepted 1 April 2009 Abstract Scopoletin (6-methoxy-7-hydroxycoumarin)is one of coumarin compound that have been widely existed in the plant, such as Rutaceae Dictamnus Rutaceae Murrayapaniculata. It was shown that scopoletin show the anti-hemoglutination effect on the domestic rabbit. In addition, scopoltin present many pharmacological activities, such as anti-bacterial, anti-oxidative and anti-tumor functions. The effects of scopoletin on mushroom tyrosinase activity, intracellular tyrosinase activity and melanin content of murine B16-F10 melanoma cells were evaluated. Kojic acid was used as a positive standard in the above experiments. The study showed that high concentration of scopoletin(2 mm~10 mm)may suppress mushrrom tyrosinase activity, in a dose-dependent pattern. However, when scopoletin combined with kojic acid, there is no obvious synergistic effect on the inhibition of tyrosinase activity. Interestingly, intracellular tyrosinase activity of B16-F10 cells was suppressed by low concentration of scopoletin(25 μm, 50 μm, 100μM). Besides, the melanin content in B16-F10 cells was also decreased by scopoletin in a dose-dependent pattern. The further work will elucidate the whitening mechanism of scopoltin, and we will also evaluate the possibility of scopoletin applied in the whitening cosmetic formulations. Key words: scopoletin, tyrosinase, melanin, white 182 *Corresponding author

4期

中国农学通报 2013,29(04):39-43 Chinese Agricultural Science Bulletin 中药荆芥最新研究进展 1,2 1,2 赵立子, 魏建和 ( 1 北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193; 2 中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室, 北京