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1 108 doi: /j.issn KCNQ/M (Kv7) 钾通道参与骨癌痛大鼠中枢敏化的电生理学研究 * 1 蔡捷 2 崔彦军 1 邢国刚 ( 1 北京大学神经科学研究所, 基础医学院神经生物学系, 教育部和卫生部神经科学重点实验室, 北京 ; 2 北京大学医院内科, 北京 ) 摘要目的 : 研究骨癌痛大鼠脊髓背角广动力范围 (wide dynamic range, WDR) 神经元兴奋性的改变, 探讨 KCNQ/M (Kv7) 钾通道在骨癌痛中枢敏化中的作用 方法 : 在雌性 SD 大鼠, 采用胫骨骨髓腔内注射 MRMT-1 乳腺癌细胞 (4 10 4, 4 µl) 的方法建立骨癌痛大鼠模型, 术后 14 天用 von Frey 纤维丝测定大鼠同侧后爪的 50% 缩足阈值 (paw withdrawal threshold,pwt) 以检测造模是否成功 对照组注射等体积的磷酸盐缓冲液 (PBS 组 ) 造模后 14 天, 通过在体细胞外记录的电生理学方法, 观察造模前后脊髓背角 WDR 神经元的放电变化以及脊髓背表面给予 KCNQ 钾通道的激动剂瑞替加滨 (retigabine, RTG) 5 mm 对骨癌痛大鼠脊髓背角 WDR 神经元 C- 纤维诱发放电的影响 结果 : 建立模型后 14 天,(1) 与 PBS 组相比, 模型组 WDR 神经元的 C- 纤维诱发放电明显增多 (P < 0.001, n = 11);(2) 与 DMSO 组相比, 脊髓背表面给予瑞替加滨可以显著抑制骨癌痛大鼠 WDR 神经元的 C- 纤维诱发放电 (P < 0.001, n = 14) 结论: 骨癌大鼠脊髓背角 WDR 神经元的兴奋性显著升高 ( 即发生了中枢敏化 );KCNQ/M (Kv7) 钾通道的功能性下调可能与骨癌大鼠的中枢敏化和骨癌痛的发生有关 关键词骨癌痛 ; 脊髓背角 ;WDR 神经元 ;KCNQ/M (Kv7) 钾通道 ; 瑞替加滨 CONTIBUTION OF KCNQ/M (Kv7) POTASSIUM CHANNELS TO THE DEVELOPMENT OF CENTRAL SENSITIZATION IN RATS WITH BONE CANCER PAIN: AN ELECTROPHYSIO- LOGICAL VALIDATION CAI Jie 1, CUI Yan-Jun 2, XING Guo-Gang 1 ( 1 Neuroscience Research Institute and Department of Neurobiology, Peking University; Key Laboratory for Neuroscience of the Ministry of Education and the Ministry of Public Health, Beijing ; 2 Department of internal medicine, Peking University Hospital, Beijing ) Abstract Objective: To investigate the excitabilities of spinal wide dynamic range (WDR) neurons in a rat model of bone cancer pain, and to explore the role of KCNQ/M (Kv7) potassium channels in the development of central sensitization in bone cancer rats. Methods: (1) A rat model of bone cancer pain was established by intratibial injections of syngeneic MRMT-1 mammary gland carcinoma cells (4 10 4, 4 µl) in female Sprague- Dawley rats. The 50% paw withdrawal threshold (PWT) of rats were tested with von Frey filaments on 14 days after cancer cells inoculation to assess the mechanical allodynia, which indicated the success of bone cancer pain model. An equal volume of vehicle (phosphorylated buffer solution, PBS) was injected into the tibial bone cavity as controls. (2) The alterations of excitabilities of WDR neurons in bone cancer pain rats and the effects of retigabine on the C-fiber induced discharge of spinal wide dynamic range (WDR) neurons were examined through extracellular electrophysiological recording in vivo in bone cancer pain rats. Results: (1) The C-fiber responses of WDR neurons increased significantly in rats with bone cancer pain (P < 0.001, n = 11); (2) Spinal administration of retigabine (5 mm), a selective opener of KCNQ/M (Kv7) channels, showed significant inhibition on the C-fiber * 国家自然科学基金 ( , ), 科技部国家重点基础研究发展计划 973 资助项目 (2013CB531905), 卫生部行业专项基金 ( ) 和北京市自然科学基金 ( ) 资助 Δ 通讯作者崔彦军 (cyj@pku.edu.cn); 邢国刚 (ggxing@bjmu.edu.cn)

2 109 evoked discharges of dorsal horn WDR neurons (P < 0.001, n = 14). Conclusion: Hypersensitivity of dorsal horn WDR neurons occurs in rats with bone cancer pain, which is highly related to the central sensitization and the pathogenesis of bone cancer pain. KCNQ/M (Kv7) potassium channels may underlie the occurrence of central sensitization and the development of bone cancer pain in rats. Key words Bone cancer pain; Spinal dorsal horn; WDR neurons; KCNQ/M (Kv7) potassium channel; Retigabine 癌痛是临床恶性肿瘤患者最常见的症状之一, 使患者的生活质量大大降低 在癌症引起的疼痛中最为常见也是让患者最难以忍受的是骨癌痛 有资料显示, 超过 90% 的癌症患者通常都伴有骨癌痛的发生 [1] 骨癌痛的发生机制目前仍不清楚 我们实验室前期的研究证明,KCNQ/M (Kv7) 通道的功能性下调在骨癌大鼠背根神经节 (dorsal root ganglion, DRG) 神经元的过度兴奋 ( 即外周敏化 ) 和骨癌痛的发生中起关键作用 [2] KCNQ/M (Kv7) 通道是由 Kv7.1 至 Kv7.5 五个电压门控钾离子通道亚单位组成的一个钾通道家族 [3], 其中 KCNQ2 和 KCNQ3 广泛表达于神经系统 [4,5] 研究表明,KCNQ 通道对正常细胞的兴奋性起到一种 刹车闸 样的控制作用, 可以防止细胞的过度兴奋 在骨癌大鼠的 DRG, 由于 KCNQ 通道的功能性下调, 导致控制神经元兴奋性的 刹车闸失灵, 从而出现 DRG 神经元的兴奋失控和骨癌痛的发生 因此, 应用 KCNQ 通道的拮抗剂 XE-991 可以使 DRG 神经元的兴奋性增加, 而 KCNQ 通道的激动剂瑞替加滨 (retigabine, RTG) 能够抑制 DRG 神经元的敏化, 从而减轻骨癌痛大鼠的机械痛敏和热痛敏行为, 提示 KCNQ/M 钾通道参与了骨癌痛外周敏化的形成 [2] 本研究在骨癌痛模型大鼠, 应用在体细胞外记录的电生理学方法, 记录大鼠脊髓背角广动力范围 (wide dynamic range, WDR) 神经元的 C- 纤维诱发放电, 同时在脊髓背表面给予 KCNQ 通道的激动剂瑞替加滨 (retigabine, RTG) 观察其对骨癌痛大鼠脊髓背角 WDR 神经元 C- 纤维诱发放电的影响 旨在探讨骨癌痛发生的中枢敏化机制, 为骨癌痛的临床治疗寻找新的药物靶点 方 1. 骨癌痛大鼠模型的建立及痛行为测定 (1) 实验动物 : 健康成年雌性 Spragμe-Dawley (SD) 大鼠, 体重 200 ~ 220 g 由北京大学医学部实验动物科学部提供, 实验动物许可证号 :SYXK ( 京 ) (2) 骨癌痛大鼠模型的建立 : 参照 Medhurst SJ 法 等的方法 [6], 向胫骨骨髓腔内注射 MRMT-1 大鼠乳腺癌细胞 (4 10 4,4 µl, 细胞收集后用 PBS 缓冲液溶解悬浮 ), 建立骨癌痛大鼠模型, 术后 14 天用 von Frey 纤维丝测定大鼠同侧后爪的 50% 缩足阈值 (PWT) 以检测造模是否成功 对照组注射等体积的磷酸盐缓冲液 (PBS 组 ) 2. 电生理实验 [7] 采用我室以往的方法进行动物的手术与固定, 用钨丝微电极记录大鼠脊髓背角 WDR 神经元的单位放电 ( 电极阻抗为 4 MΩ) PBS 组和模型组给予实验性电刺激 ( 每 5 min 施加 1 个串刺激, 每串 10 个方波, 强度为 2 倍 C- 纤维兴奋的阈强度 ) 记录 1 h 以观察模型组脊髓背角 WDR 神经元兴奋性的变化 在记录瑞替加滨对骨癌痛大鼠脊髓背角 WDR 神经元的作用过程中, 首先给予 6 串实验性电刺激 ( 每 5 min 施加 1 个串刺激, 每串 10 个方波, 强度为 2 倍 C 纤维兴奋的阈强度 ), 诱发并记录 WDR (wide dynamic range) 神经元的放电, 取其平均值作为基础对照值 (100%), 然后在脊髓背表面给予瑞替加滨 ( 以 DMSO 为溶媒配成 0.5 M 的 stock 液, 用生理盐水配成 5 mm [8] 的工作液 ) 或 DMSO ( 用生理盐水配成相同浓度的工作液 ), 5 min 后再给予同样的实验性电刺激, 记录给药后 60 min 内 WDR 神经元 C- 纤维诱发放电的变化 记录到的单位放电经微电极放大器输入记忆示波器, 同时输入 Spike 2 生物电信号采集与分析系统 ( 英国 CED 公司 ) 叠加 10 次的放电绘制出刺激后序列密度直方图, 进行数据统计和分析处理 3. 数据处理及统计学分析采用 Prism 5 版软件进行数据的统计分析和处理 实验数据以均数 ± 标准误 (mean ± SEM) 表示 两组间数据的差异应用 t 检验 重复设计 ( 各时间点两组数据 ) 分析采用双因素方差分析 (twoway ANOVA) 并继之以 Bonferroni post-hoc 检验, 以 P < 0.05 为差异有统计学意义 结 果 1. 骨癌痛大鼠脊髓背角 WDR 神经元 C- 纤维

3 110 诱发放电的变化与 PBS 对照组相比, 骨癌痛大鼠脊髓背角 WDR 神经元 C- 纤维诱发放电明显增多,( 见图 1A, 1B) 在 0 ~ 60 min 内骨癌痛大鼠中每个串刺激诱发的 10 次放电的个数总和与 PBS 对照组相比均有显著性差异 (P < 0.001, two-way ANOVA, n = 9 或 n = 11) 相应地, 以 0 ~ 60 min C- 纤维诱发放电变化的曲线下面积 (area under curve, AUC) 反应骨癌痛大鼠脊髓背角 WDR 神经元 C- 纤维诱发放电增多的效应, 与 PBS 对照组 (4062 ± 339.8, n = 9) 相比, 骨癌痛大鼠组的 AUC (11700 ± 590.7, n = 11) 显著增多 (P < 0.001, n = 9 或 n = 11, 见图 1C) 以上结果表明, 骨癌痛大鼠脊髓背角 WDR 神经元的兴奋性显著增加, 这种增强的 WDR 神经元兴奋性提示骨癌大鼠中枢敏化的发生 2. 脊髓背表面应用瑞替加滨对脊髓背角 WDR 神经元 C- 纤维诱发放电的影响与 DMSO 组相比, 脊髓表面应用瑞替加滨 (5 mm) 能显著抑制 WDR 神经元的 C- 纤维诱发放电 ( 见图 2A, 2B), 应用瑞替加滨 10 min 即出现明显的抑制作用,C- 纤维诱发放电降至给药前的 (83.82 ± 4.52)% (P < 0.01,n = 14), 而 DMSO 组仍然维持在 ( ± 2.82)%(P > 0.05,n = 9) 应用瑞替加滨对放电产生的最大抑制效应出现在给药后 30 ~ 60 min, 在给药后的 60 min, C- 纤维诱发放电最低降至给药前的 (66.23±3.17)% (P < 0.001); 而 DMSO 组维持在 (103.41±4.82)%(P > 0.05) 相应地, 以 -25 ~ 60 min C- 纤维诱发放电变化的曲线下面积 (area under curve,auc) 反应脊髓表面应用瑞替加滨对 C- 纤维诱发放电的总体抑制效应, 与 DMSO 对照组 (8648 ± 151.6) 相比, 瑞替加滨组的 AUC (6978 ± 148.5) 显著减少 (P < 0.001, n = 9 或 n = 14, 见图 2C) 以上结果表明, 脊髓背表面应用瑞替加滨对骨癌大鼠脊髓背角 WDR 神经元的 C- 纤维诱发放电具有显著的抑制作用 讨论 本研究首先参照 Medhurst SJ 等的方法 [6] 建立 大鼠骨癌痛模型 术后 14 天发现 MRMT-1 乳腺癌细胞接种大鼠的 50% PWT 明显降低, 表明大鼠产 C 图 1 骨癌大鼠脊髓背角 WDR 神经元 C- 纤维诱发放电的变化 A:WDR 神经元 C- 纤维诱发反应的原始放电图 ;B:WDR 神经元 C- 纤维诱发反应的统计图 ;C:0~60 min 内两组 WDR 神经元 C- 纤维诱发放电的曲线下面积 (AUC) 比较 ***P < 0.001, 与 PBS 组相比,two-way ANOVA 与 two-tailed unpaired t-test, n = 9-11/ 组 Fig. 1 Alterations of the C-fiber responses of dorsal horn WDR neurons in bone cancer rats. (A): The original recording on the C-fiber evoked discharges of a WDR neuron in bone cancer rat and sham rat, respectively. (B): The total spikes count of the electrically evoked C-fiber responses in 10 stimuli. ***P < 0.001, compared with sham control, two-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test, n = 9-11/ group. (C): the AUC (0 60 min) of C-fiber response. ***P < 0.001, bones cancer pain vs. sham, two-tailed unpaired t-test, n = 9-11/group.

4 111 C 图 2 脊髓背表面应用瑞替加滨 (5 mm) 对骨癌大鼠脊髓背角 WDR 神经元 C- 纤维诱发放电的影响 A: 给药前后 WDR 神经元 C- 纤维诱发反应的原始放电图 ;a1: 给 DMSO 前 (baseline);a2: 给 DMSO 后 30 min;b1: 给 RTG 前 (baseline);b2: 给 RTG 后 30 min;b:rtg 抑制 C- 纤维诱发放电的统计图 ;C:-25 ~60 min 内 WDR 神经元 C- 纤维诱发放电的曲线下面积 (AUC) 比较 **P < 0.01,***P < 0.001, 与 DMSO 组相比,two-way ANOVA 与 two-tailed unpaired t-test, n = 9-14/ 组 Fig. 2 Effects of spinal administration of RTG (5 mm) on C-fiber responses of dorsal horn WDR neurons. A: The original recording on the C-fiber evoked discharges of a WDR neuron before and after drug administration; a1:before DMSO administration (baseline); a2: 30 min after DMSO administration; b1: before RTG administration (baseline); b2: 30 min after RTG administration; B: Effects of RTG on the C-fiber evoked discharges; C: Comparison of the AUC (-25 ~ 60 min of the analysis time) of the C-fiber responses after application of RTG with DMSO. **P < 0.01, ***P < 0.001,compared with DMSO solution control, two-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test, or twotailed unpaired t-test, n = 9-14/group. 生了机械痛敏, 骨癌痛模型建立成功 对造模成功 的骨癌痛大鼠进行在体细胞外记录脊髓背角 WDR 神经元 C- 纤维诱发放电, 发现与 PBS 对照组相比, 骨癌痛大鼠脊髓背角 WDR 神经元 C- 纤维诱发放电 显著增多, 兴奋性明显增加, 这种增强的 WDR 神 经元兴奋性提示骨癌大鼠中枢敏化的发生 我们实 验室前期的研究发现, 在癌症痛大鼠, 小直径 DRG 神经元的兴奋性显著升高, 形成外周敏化 [9] 结合 本实验的研究结果, 我们推测, 这种外周敏化可以 引起脊髓背角伤害性感觉神经元的兴奋性增加, 导 致中枢敏化, 最终形成骨癌痛 [10,11] 我们前期的研究已经证明,KCNQ/M (Kv7) 通 道的功能性下调在骨癌大鼠 DRG 神经元的过度兴 奋 ( 及外周敏化 ) 和骨癌痛的发生中起关键作用 [2] KCNQ 通道对正常细胞的兴奋性起到一种 刹车闸 样的控制作用, 可以防止细胞的过度兴奋 在骨癌大鼠的 DRG, 由于 KCNQ 通道的功能性下调, 导致控制神经元兴奋性的 刹车闸失灵, 从而出现 DRG 神经元的兴奋失控和骨癌痛的发生 为了进一步证明 KCNQ 通道的功能性下调是否也可以导致骨癌大鼠中枢敏化的发生, 我们在脊髓背表面给予 KCNQ 通道的激动剂瑞替加滨 (retigabine, RTG), 观察增强 KCNQ 通道对骨癌大鼠脊髓背角 WDR 神经元 C- 纤维诱发放电的作用 我们的实验结果发现, 与对照组相比, 脊髓表面应用瑞替加滨能够显著抑制骨癌大鼠 WDR 神经元 C- 纤维反应的过度兴奋, 提示 KCNQ 通道的功能性下调的确可以导致骨癌大鼠中枢敏化的发生

5 112 迄今为止, 已有大量研究证实,KCNQ/M (Kv7) 钾通道在疼痛传导通路的各级组织都有表达, 包括 DRG 和背角神经元 [8,12~14], 发挥着调节伤害性感觉传导的作用 [8,15~17] 因此,KCNQ/M (Kv7) 钾通道的激动剂瑞替加滨在神经病理痛 [15,17~19] [8,12,20] 炎症痛和 [21~23] 内脏痛中都能起到明显的镇痛作用 有报道表明, 瑞替加滨可以有效抑制脊神经结扎 (spinal nerve ligation, SNL) 大鼠脊髓背角神经元 C- 纤维和 Aδ- 纤维的诱发放电 [8] 根据本实验室前期的研究发现, 瑞替加滨能够抑制 DRG 神经元的 M 通道电流以及 DRG 神经元的自发放电频率, 从而抑制骨癌痛大鼠的外周敏化 [2], 我们从本实验的研究结果推测 : KCNQ 通道的功能性下调可以导致骨癌大鼠外周敏化和中枢敏化的发生 所以, 应用 KCNQ 通道的激动剂 ( 瑞替加滨 ) 增强该通道的功能可以抑制骨癌大鼠的外周敏化和中枢敏化, 进而抑制骨癌痛的发生 结论 : 骨癌大鼠脊髓背角 WDR 神经元的兴奋性显著升高 ( 即发生了中枢敏化 );KCNQ/M (Kv7) 钾通道的功能性下调可能与骨癌大鼠的中枢敏化和骨癌痛的发生有关 参考文献 [1] Meuser T, Pietruck C, Radbruch L, et al. Symptoms during cancer pain treatment following WHO-guidelines: a longitudinal follow-up study of symptom prevalence, severity and etiology. Pain 2001; 93: 247 ~ 257. [2] Zheng Q, Fang D, Liu M, et al. Suppression of KCNQ/M (Kv7) potassium channels in dorsal root ganglion neurons contributes to the devel-opment of bone cancer pain in a rat model. Pain 2013; 154: 434 ~ 448. [3] Wulff H, Castle NA, Pardo LA. Voltage-gated potassium channels as therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov 2009; 8: 982 ~ [4] Biervert C, Schroeder BC, Kubisch C, et al. A potassium channel mutation in neonatal human epilepsy. Science 1998; 279: 403 ~ 406. [5] Klinger F, Gould G, Boehm S, et al. Distribution of M- channel subunits KCNQ2 and KCNQ3 in rat hip-pocampus. Neuroimage 2011; 58: 761 ~ 769. [6] Medhurst SJ, Walker K, Bowes M, et al. A rat model of bone cancer pain. Pain 2002; 96: 129 ~ 140. [7] Qu XX, Cai J, Li MJ, et al. Role of the spinal cord NR2Bcontai-ning NMDA receptors in the development of neuropathic pain. Exp Neurol 2009; 215: 298 ~ 307. [8] Passmore GM, Selyanko AA, Mistry M, et al. KCNQ/ M currents in sensory neurons: significance for pain therapy. J Neurosci 2003; 23: 7227 ~ [9] Zheng Q, Fang D, Cai J, et al. Enh-anced excitability of small dorsal root ganglion neurons in rats with bone cancer pain. Mol Pain 2012; 8:24. doi: / : 24 ~ 28. [10] Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, et al. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods 1994; 53: 55 ~ 63. [11] Crozier RA, Ajit SK, Kaftan EJ, et al. MrgD act-ivation inhibits KCNQ/M-currents and contributes to en-hanced neuronal excitability. J Neurosci 2007; 27: 4492 ~ [12] Brown DA, Passmore GM. Neural KCNQ (Kv7) channels. Br J Pharmacol 2009; 156: 1185 ~ [13] Devaux JJ, Kleopa KA, Cooper EC, et al. KCNQ2 is a nodal K+ channel. J Neurosci 2004; 24: 1236 ~ [14] Saganich MJ, Machado E, Rudy B. Differential expression of genes encoding subthreshold-operating voltagegated K + channels in brain. J Neurosci 2001; 21: 4609 ~ [15] Blackburn-Munro G, Jensen BS. The anticonvulsant retigabine attenuates nociceptive behaviours in rat models of persistent and neuropathic pain. Eur J Pharmacol 2003; 460: 109 ~ 116. [16] Fritch PC, McNaughton-Smith G, Amato GS, et al. Novel KCNQ2/Q3 agonists as potential therap-eutics for epilepsy and neuropathic pain. J Med Chem 2010; 53: 887 ~ 896. [17] Munro G, Dalby-Brown W. Kv7 (KCNQ) channel modulators and neuropathic pain. J Med Chem 2007; 50: 2576 ~ [18] Dost R, Rostock A, Rundfeldt C. The anti-hyperalgesic activity of retigabine is mediated by KCNQ potassium channel activation. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2004; 369: 382 ~ 390. [19] Wickenden AD, McNaughton-Smith G, Wladyka CL, et al. Kv7 channels as targets for the treatment of pain KCNQ/M-currents contribute to the resting membrane potential in rat visceral sensory neurons. J Physiol 2006; 575: 175 ~ 189. [20] Linley JE, Rose K, Patil M, et al. Inhibition of M current in sensory neurons by exogenous proteases: a signaling pathway mediating inflammatory nociception. J Neurosci 2008; 28: ~ [21] Bi Y, Chen H, Su J, et al. Visceral hyperalgesia induced by forebrain-specific suppression of native Kv7/KCNQ/ M- current in mice. Mol Pain 2011; 7:84. doi: / : 84 ~ 87. [22] Hirano K, Kuratani K, Fujiyoshi M, et al. Kv voltage-gated potassium cha-nnel (KCNQ2-5) opener, retigabine, reduces capsaicin-induced visceral pain in mice. Neurosci Lett 2007; 413: 159 ~ 162. [23] Wladyka CL, Kunze DL. KCNQ/M-currents contribute to the resting membrane potential in rat visceral sensory neurons. J Physiol 2006; 575: 175 ~ 189.

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