二 DNA 双螺旋模型的诞生 :Watson & Crick 建立双螺旋模型主要是受到 4 个方面的影响 : (1)1938 年 W.T.Astbury & Bell 用 x 衍射技术研究 DNA 1947 年拍摄了第一张 DNA 的衍 射照片, 并推断 DNA 分子的结构是 : 1 柱状 ;2 多

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1 第二章 基因的结构和功能 一基因一酶学说 : 该学说具体体现了基因和酶之间的关系, 表明每个基因控制单个酶的合成 或激活其活性 转化 : 通过裸露的外源 DNA 传递遗传信息 转染 : 是转化的一种特殊形式 用于原核细胞 时, 其外源 DNA 特指离体的 phage DNA 来感染感受态的细菌, 并在其中表达 ; 用于真核细胞时对任何裸露 DNA 的吸收都成为转染 接合 : 通过细胞与细胞之间的直接接触 遗传信 息单向传递到受体的过程 转导 : 一个细胞的 DNA 或 RNA 通过病毒载体的感染转移到另 一个细胞中 自主发育 : 不受周围细胞的影响, 按照自身基因型发育的现象 非自主发育 : 受周围细胞的 影响, 不按自身基因型发育的现象 1902 [ 英 ] Garrod.A 首先研究了四种遗传病 : 黑酸尿病白化病胱氨酸尿病戊糖尿病 ;1952 年发现糖原贮积症 (Von Gierke 氏病 ) 病人缺乏葡萄糖 -6- 磷酸酶 第二节 人类酶缺陷的遗传基础 一 半乳糖血症二 白化病三 苯丙酮尿症四. 莱 - 尼二氏症 芽盘移植实验 第三节遗传咨询和产前诊断一 遗传咨询 (Genetic counseling): 询问先征者的完整病史, 家族史 ; 查阅 McKusick,V.A: MendlianInheritance in Man 是否为遗传病, 遗传类型, 发病风险? 通过产前诊断, 决定 是否终止妊娠 二 产前诊断 (prenatal diagnosis): 指征是 :(1) 亲体为携带者 ;(2) 母亲曾生育过先天性 异常的婴儿 ;(4)35-40 岁以上的高龄孕妇 ;(5) 曾有多次流产, 早产和死胎的孕妇 ;(6) 亲体曾多次接触过放射线或在妊娠早期服过一些胎儿致畸药物 采集标本的方法 : 羊膜穿刺 抽取羊水, 收集胎儿脱落细胞 ; 从宫颈粘液中获取绒毛膜细胞 ; 直接从子宫控中吸取绒毛膜细 胞 ; 超声波可用于产前诊断神经管缺陷, 如无脑儿, 脊椎裂和水脑儿 胎儿镜 (fetoscope) 又称羊膜镜或宫腔镜 产前诊断的方法 : 细胞学, 生物化学, 分子生物学 三 携带者的检出 : 方法 : (1) 染色体核型分析 (2) 酶活性的检测 (3) 分子生物的方法 实例 : 神经节苷酯贮积病 GM2-I 型 [Tay-Sachs 症, 家族性黑蒙性痴呆, 氨基已糖苷酶 A) 缺 乏症 四 分子病 (molecular diease): 分子病是指由于基因的突变引起了蛋白质分子结构的改变 而导致的疾病, 如镰形细胞贫血 (sickle cell anenia) 第四节基因的精细结构和顺反测验 ( 应为百度文库的原因, 此处删除了 ) 当顺式有功能, 而反式没有功能时, 突变位点在同一顺反子内 ; 当顺式有功能, 而反式也有 功能时, 突变位点在不同顺反子内 第三章遗传物质的分子结构和性质 第一节核酸是遗传物质遗传物质必须具备哪些特点?: 在体细胞中含量稳定 ; 在生殖细胞中含量减半 ; 能携带遗传 信息 ; 能精确地自我复制 ; 能发生变异 ; (DNA RNA 是遗传物质的证明 ) 一 遗传物质的发现 :1928 年 Frederick Griffith 实验 ;1944 年,Avery 在离体条件下完成转化 转化 1952 年,Hershey 和 Chase 噬菌体感染实验二 RNA 也是遗传物质 :1956 年 A.Gierer 和 G.Schraman 发现烟草花叶病毒 (tobacco mosaic virus,tmv), 其遗传物质是 RNA 1957 年 美国的 Heinz Fraenkel-Conrat 和 B.Singre 用重建实验证实了这一结论 第二节 DNA 和 RNA 的化学组成及双螺旋模型 一 DNA 和 RNA 的化学组成

2 二 DNA 双螺旋模型的诞生 :Watson & Crick 建立双螺旋模型主要是受到 4 个方面的影响 : (1)1938 年 W.T.Astbury & Bell 用 x 衍射技术研究 DNA 1947 年拍摄了第一张 DNA 的衍 射照片, 并推断 DNA 分子的结构是 : 1 柱状 ;2 多核苷酸是一叠扁平的核苷酸 ;3 核 酸残基取向和分子长轴垂直, 间距为 3.4 ( 2)1951 年 Pauling 和 Corey 运用化学的定律来推 理, 而不做具体的实验, 建立了蛋白质的 α- 螺旋模型 ;(3) 晶体学者 [ 美 ]J. Donoh & Chargaff 的指点 (4)R.Franklin & Wilkins 在 1952 年底拍得了 DNA 结晶 X 衍射照片 三 双螺旋模型 (double helix model) 双螺旋模型有以下特点 :(1) DNA 分子由两条反向平行的多核苷酸链组成, 形成右手双螺旋 (2) 双螺旋的直径为 2nm; 螺距为 3.4nm, 上下相邻碱基的垂直距离为 0.34nm, 交角为 36 (3) 两条链反向平行, 即两条链的方向相反 ;(4) 糖一磷酸键是在双螺旋的外侧, 碱基对与轴线垂直 (5) 糖与附着在糖上的碱基近于垂直 (6) 碱基配对时, 必须一个是嘌呤, 另一 个是嘧啶 (7) DNA 双螺旋有大沟 (major or wide groove) 和小沟 (minor or narrow groove) 的存在 第三节 DNA 的结构和性质 一 DNA 二级结构的稳定因素 (1) 碱基对之间的氢键 (2) 碱基的堆集力 它包括 :1 疏水作用 ;2 范德华力 ;3 磷酸基的负电荷斥力 模型中的碱基配对有何重要性? 1A-T,G-C 配对可形成很好的线性氢键 ;2A-T 对和 G-C 对的几何形状一样, 使双链距离相 近, 使双螺旋保持均一 ;3 碱基对处在同一平面内 不论核苷酸的顺序如何, 都不影响双螺 旋的结构 ;4 为 DNA 半保留复制奠定了基础 二 双螺旋结构的构象变异 DNA 的构象现已知有 A,B,C,D,E,T,Z 7 种 生理条件下 :B 三种主要构象 :B A Z 引起 DNA 双链构象改变有以下因素 :(1) 核苷酸顺序 ;(2) 碱基组成 ;(3) 盐的种类 ; (4) 相对湿度 立体异构 : 分子中原子互相连接的方式和次序相同 ( 构造相同 ), 但在空间的排列方式不同而出现的异构现象 平面偏振光和旋光性 光是一种电磁波, 它的电场或磁场振动的方向与光前进的方向垂直 在普通光线里, 光波 可以在垂直于前进方向平面上的任何方向振动 ( 一 ) 左旋 DNA Z-DNA 的结构特点 (1) 糖磷骨架呈 之 字形 (Zigzag) 走向 (2) 左旋 (3) G 的糖苷键呈 顺式 (Syn), 使 G 残基位于分子表面 (4) 分子外形呈波形 (5) 大沟消失, 小沟窄而深 (6) 每个螺旋有 12bp Z-DNA 存在的条件 (1) 高盐 :NaCl>2Mol/L, MgCl2>0.7 Mol/L(2) Pu,Py 相间排列 :(3) 在 活细胞中如果 m5c, 则无需嘌呤 - 嘧啶相间排列, 在生理盐水的浓度下可产生 Z 型 (4) 在体内多胺化合物, 如精胺和亚胺及亚精胺和阳离子一样, 可和磷酸基因结合, 使 B-DNA 转变 成 Z-DNA (5) 某些蛋白质如 Z-DNA 结合蛋白带有正电荷, 可使 DNA 周围形成局部的高 盐浓度和微环境 (6) 负超螺旋的存在 生物学意义 :(1) 可能提供某些调节蛋白的识别 啮齿类动物病毒的复制起始部位有 d(gc) 有交替顺序的存在 ;(2) 在 SV40 的增强子中有三段 8bp 的 Z-DNA 存在 (3) 原生动物纤毛虫, 它有大 小两个核, 大核有转录活性, 小核和繁殖有关 Z-DNA 抗体以萤光标记后, 显示 仅和大核 DNA 结合, 而不和小核的 DNA 结合, 说明大核 DNA 有 Z-DNA 的存在, 可能和 转录有关 ( 二 ) 右旋 DNA: 目前已知 DNA 双螺旋结构可分为 A B C D 及 Z 型等数种, 除 Z 型为

3 左手双螺旋外, 其余均为右手双螺旋 三 DNA 的三级结构 所谓 DNA 的三级结构, 是指在一二结构基础上的多聚核苷酸链上的卷曲 在一定意义上, 是指双螺旋基础上的卷曲 三级结构包括链的扭结和超螺旋或者是单链形成的环或是环状 DNA 中的连环体超螺旋 : (Supercoied) 松驰型 DNA (relax form) 超螺旋(Supercoied) DNA, 负超螺旋正 超螺旋 检测 DNA 三级结构的方法 : 密度梯度离心凝胶电泳电镜观察 原核生物 DNA 的三级结构 : 绝大多数原核生物的 DNA 都是共价封闭的环状双螺旋 如果 再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构 超螺旋的定量描叙 :White 方程 : L=T+W L(Linking nnmber): 链环数或称拓扑环绕数, 指 cccdna 中一条链绕另一条链的总次数 其特点是 (1) L 是整数 ;(2) 在 cccdna 中任何拓扑学状态中其值保持不变 ;(3) 右手螺旋对 L 取正值 W(Writhing number): 扭曲数, 即超数旋数 其特点是 :(1) 可以是非整数 ;(2) 是变量 ;(3) 右手螺旋时,W 取负值 T(Twisting number): 缠绕数, 即双螺旋的圈数 其特点是 :(1) 可以是非整数 ;(2) 是变 量 ;(3) 右手螺旋时 T 为正值 超螺旋的量度可以用超螺旋密度 λ 来表示 :λ=(l-t)/t 在天然 DNA 中, λ 约为 第四节 DNA 的变性与复性变性或解链 : 对 DNA 双链进行缓慢地加温, 使氢键断裂, 双链解开, 产生单链的 DNA 分 子的过程 成核作用 : 复性过程中互补的两条链首先是中心部分互补碱基对之间形成氢键, 接着像拉拉 链一样, 其余部分随之形成双链 又称为拉拉链作用 复性或退火 : 核酸分子在变性后分开的互补链缓慢冷却, 重新形成互补双链的过程 DNA 的复性对片段有两个要求 :(1) 互补顺序的碰撞和排列 ;(2) 碱基的正确配对和氢键的形成 一 DNA 变性 物理性质发生变化 :(1) 流体力学的性质发生改变 : 粘度下降, 而沉降速度增加 ;(2) 提高 了对紫外线的吸收能力, 此称为增色效应 (hyperchromic effect) 双链 DNA 的 A260=1.00 ( 浓度为 50μg/ml 时, 对波长 260nm 紫外线的吸收能力 ); 单链 DNA 的 A260=1.37; 游离碱基或核苷酸的 A260=1.60 解链温度 (melting temperature, Tm) 或熔点,Tm 是 A260 的升高达到极大值一半时的温度 即是变性温度范围的中点 影响变性的因素 : 高温 酸 碱 尿素 甲酰胺 影响 Tm 值的因素 : 外部条件 : 如温度和正离子的浓度 : 浓度低于 0.4mol/L, 单价阳离子增高 10 倍,Tm 增加 16.6 内部条件 :GC 含量及分子类型当 GC 的含量上升 1%, 则 Tm 上升 0.4 马默多蒂 (Marmur-Doty) 关系式 :Tm = (G +C)%, 或 GC%=(Tm-69.3) 2.44 二 DNA 复性 复性动力学公式 根据复性动力学公式我们可以知到些什么?(1) 单链浓度随着时间的增大而减小 ;(2) 反应速率取决于初始的单链浓度 Co;(3) 以反应浓度和 COt1/2 为座标可绘复性曲线 ;(4) 通过 C0t1/2 值可测原核生物基因组的大小 ; 已知大肠杆菌的基因组为 4.2x106bp, COt1/2 = 9M.Sec COt1/2 ( 大肠杆菌基因组 DNA)/9M.sec = 任何基因组大小 /4.2X106bp(5) 原核生物基因组 大小不同, 复性曲线不同 ;(6) 可用以区分真核生物和原核生物基因组 单一顺序和重复顺

4 序复性动力学曲线的区别真核生物 DNA 有重复顺序, 原核物多为单一顺序 (1) 单一顺序 的复性曲线常只有一个拐点, 而重复顺序常有多个拐点 (2) COt 比值变化范围不同 : 原核 生物的 COt 比值小于 100, 真核生物的 COt 比值大于 100 影响复性反应的因素 (1) DNA 片段 的大小 ;(2) DNA 的浓度 ;(3) DNA 复杂性 ;(4) 温度 最佳复性温度一般比 Tm 低 25C (5) 盐的浓度 : 复性时要求盐的浓度达到足够高, 为什么? 复性反应中如何知道单链已结合成双链? 可以通过哪些法来检测? (1) 减色效应 : 测定光密度, 即 OD 值,DNA 从单链变成双链,OD260 减少 30%(2) 羟基磷 灰石柱层析羟基磷灰石对双链 DNA 吸附较牢, 不易吸附单链 (2) 羟基磷灰石柱层析 第五节 核酸分子杂交技术 分子杂交 : 具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下, 按碱基配对原则形成双链的过程 杂交的共同特点 (1) 都是应用复性动力学原理 ;(2) 都必须有探针 (probe) 的存在 探针就是 用同位素或非同位素如荧光染料, 生物素等标记的短片段特异 DNA 或 RNA 顺序 一 核酸分子杂交的基本原理 DNA 变性方法热变性 : 酸碱变性 : 常采用碱变性化学试剂变性 : 尿素 甲酰 胺 甲醛等特点 : 粘度增加 密度增加 增色效应 溶解温度 (melting temperature,tm) DNA 复性或杂交 (hybridization)dna/dna,dna/rna,rna/rna 等 影响杂交的因素 : 核酸分子的浓度和长度浓度大, 复性快 ; 分子量大, 复性慢温度离子 强度杂交液中的甲酰胺核酸分子的复杂性非特异性杂交反应 预杂交 : 鲑鱼精子 DNA 封闭非特异性杂交位点 分子杂交的基本方法 :Southern 印迹法 Northern 印迹法斑点印迹杂交原位杂交 Western 印迹法液相杂交 Southern 杂交 :DNA/DNA 杂交, 即将 DNA 电泳 转印到固相支持物上, 用探针进行检测 的方法 Southern 杂交的主要步骤 : 待测 DNA 样品的制备 酶切待测 DNA 样品的电泳分离 : 琼 脂糖凝胶电泳凝胶中 DNA 的变性 : 碱变性 Southern 转膜 : 硝酸纤维素 (NC) 膜 尼龙膜毛细管虹吸印迹法 电转印法 真空转移法探针的制备 Southern 杂交杂交结果的检测 : 基因 组 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测 酶切后 DNA 片段琼脂糖凝胶电泳检测 Northern 印迹杂交 : 检测 RNA( 主要是 mrna) 的方法与 Southern 杂交的不同 : 靶核酸 : RNA RNA 电泳 转膜 : 不需变性 斑点印迹杂交 : 将 RNA 或 DNA 变性后直接点样于 NC 膜或尼龙膜上 优点 : 简单 快速 可同时检测多个样品 原位杂交 : 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交, 称为原位杂交 在成分复杂 的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸, 对含量极低的靶序列灵敏度 高 准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 核酸原位杂交的基本步骤 : 玻片原位杂交 : 细胞或组织的固定载玻片 ; 组织细胞杂交前的预处理 ; 去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白 ; 膜上分子杂交 ; 探针的选择和标记 ; 杂交结果检 测 探针的标记探针的种类 :cdna 探针 基因组 DNA 探针 寡核苷酸探针 RNA 探 针 标记物 : 核素标记物 ( 同位素标记 ):32P 35S 3H 等 ; 非核素标记物 ( 非同位素标 记 ): 生物素 地高辛 荧光素等 Western 杂交印迹法 (Western bloting) 检测蛋白质, 即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上, 用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 主要步骤 : 蛋白质样品的制备 ; SDS- 聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE) 电泳 ; 蛋白质的电转移 :NC 膜 ; 靶蛋白的免疫学检测 : 靶蛋白 于第一抗体 ( 一抗 ) 反应 ; 与标记的第二抗体 ( 酶标二抗 ) 反应 ; 显色反应 : 酶促反应 第四章 基因组和染色体

5 基因组 : 是指一个单倍体的染色体数目 ( 遗传物质的总量 ) 原核基因组含有大量单一顺序, 仅有少量的重复顺序 真核基因组含少量单一顺序和大量重 复顺序 原核生物的细胞中除了主染色体以外, 还含有各种质粒和转座因子 真核生物除了 核染色体以外, 还存在细胞器 DNA 第一节原核生物基因组的结构特点一 类核的结构 E.coli Da,42000 Kb(1300 微米 ), 闭合环状, 约编码 2000 个基因 类核 (nucleoid): 原核生物的 DNA 位于细胞中央 支架 (scafford): 100 个 DNA 环组成, 每个环长 40Kb,13 微米 每 200bp 就有一个负超螺旋 (=-0.05), 即基因组中含 5% 的负超螺旋 超螺旋以两种状态存在 :(1) 自由状态的超螺旋, 可在环内传递张力 (2) 蛋白结合超螺旋受到束缚, 不能传递张力 二 重叠基因 (overlapping gene) 三 质粒 (plasmid) 特点 : 双链环状 DNA 分子 ; 带有一些特殊基因 ( 抗生素抗性基因 ); 具有复 制起始区 ; 可经整合到宿主的染色体中, 和细菌染色体同步复制 ; 质粒类型 1. 抗性质粒 : 带有抗性基因, 可使宿主细菌对某些抗生素产生抗性 2. 致育因子 : 可 以通过接合在供体和受体之间传递遗传物质, 其基因组具有转移区, 重组区和复制区 3.Col 质粒 : 含编码大肠杆菌素基因 4. 降解质粒 : 这种质粒编码一种特殊蛋白, 可使宿主菌代谢特 殊的分子, 如甲苯或水杨酸 5. 侵入性质粒 如根癌农杆菌中的 Ti 质粒 第二节 真核基因组的复杂性 分子量约为 道尔顿 长度为 2 106Kb, 形态为线状, 约编码 100 万个以上的基因 人类细胞在二倍体的核中 DNA 长约 30 亿个碱基对估计编码 3 万个基因, 每条染色体含碱基 8 千万至 3 亿不等 现已有 5 千个基因被编目,1900 个基因已进行了染色体定位,600 个已被克隆分离出来 若将一个细胞中每条染色体的 DNA 首尾彼此相接, 全长约 200c m 染色质 (chromatin): 从细胞中获取的 DNA 和蛋白质的复合物. 常染色质 异染色质 在染色质中和 DNA 结合的有两类蛋白 : 组蛋白非组蛋白 H3 2 -H4 2 八聚体 2 H2A-H2B 染色质小体 (~166bp) 146bp 核小体 DNA 166bp (~200bp) H1 20bp DNA 连接区 ( 常为 32~34bp) 核心颗粒 核小体的组成 三 染色体的高级结构 10nm 的核丝 ;30nm 螺旋管 ; 放射环模型 ; 螺旋环模 ; 放射 螺旋环共存模型 ; 袢环模型 ; 螺旋折叠 U.K.1988) 等模型 ; 侧环模型 第三节着丝粒和端粒一. 着丝粒 : 由三个功能区组成 ; 中部的元件 (II) 由 80~90bp 组成,A+T 含量高,>90%; 左 侧的元件 (I) 含有 PuTCACPuTG 顺序 (Pu 是嘌呤 ); 右侧的元件 (III) 是由 26bp 组成的保守区, 此区也是 A-T 丰富区 ; 所有真核生物的着丝粒功能都相同, 但其 DNA 却具有种的特异性 二 : 端粒 : 共同特点 : 每一个端粒都含有一系列的短的正向重复顺序 Cn(A/T)m, 其中 n>1,

6 而 m=1~4 在端粒区域中有一种特殊的不连续排列, 产生单链断裂的形式, 这种结构并不 能被连接酶将缺口封闭起来, 而在正常情况下连接酶是可以作用 DNA 链上的缺刻 (nick) 提纯的天然的端粒区可直接用 E.Coli DNA 多聚酶 I 进行缺口平移 (nick translation) 在端粒 区的最末端可能带有 3`-OH 的单链末端回折成了发夹 (hairpin) 结构 端粒的双链部分中含有 T2G4 的顺序在 3` 末端, 排列方向是朝向染色体的中心部位 细胞中, 端粒是和一些非组蛋白相结合, 形成复合体, 常表现为异染色质或构成染色体的末端结节 端粒的功能 : 保持 染色体的稳定 ; 使线形 DNA 顺利复制 ; 影响染色体的行为 ; 可能控制细胞的寿命 ; 和核骨 架的组成有关 第四节 染色体的核型和分带 1 核型 (Karyotype) : 在一个细胞中全套的中期染色体称为核型 2 染色体带型 G 带 :Giemsa 染色 ; 最常用先用加热或蛋白水解酶进行预处理, 然后用 g iemsa 染料染色, 结果呈现清晰特异的 G 带 反映了染色体 DNA 上 AT 的丰富区 用 电镜扫描可在带区见到收缩的痕迹, 但不可长期保存 C 带 ;Q 带 : 芥子奎吖因 (guinacrine mustard) 染色 ; 直接将未染色的中期染色体染色, 在与 G 带相同的区域产生另外的荧光带 在荧光显微镜下清晰可见 其 whhat?? 感性较强 T 带 ;N 带 ;R 带 :Reverse; 是和 G 带相反的带, 即 G 带的深染区正是 R 带的浅染区 反之亦然 用常规颜料染色 第五节 单一顺序和重复顺序 一 单一顺序 (Unique sequence ) 在基因组中有一个或几个拷贝 不编码真核基因 (40~70%) 原核基因 ( 大多 ) 编码 二 短片段重复顺序 (1) 正向重复又叫顺向重复 ;(2) 反向重复 ;(3) 回文顺序 : 是一种旋转对称 特点是正读反读意思都一样 存在于各种蛋白质的结合位点 三 长片段重复顺序 轻度重复顺序 : 在基因组中含有 2-10 拷贝, 酵母 trna 基因 人和小鼠的珠蛋白基因等 中度重复顺序 : 长约 300bp 基因组中约有 10- 几千个拷贝的顺序 如 rrna 和 trna 基因 trna 基因一般都分布于基因组中, 而 rrna 常集中分布于核仁形成区 基因家族 (gene family): 在真核生物基因组中, 来源相同 结构相似 功能相关的基因 基因簇 (gene family): 相同或相关的基因排列在一起 分散的基因家族其成员不在同一基因簇 (gene cluster) 内, 串联基因家族的成员都集中串联在一起 有的基因家族成员不仅结构和功能不同, 表达的时 间也不同 孤散子 (orphons): 由串联重复顺序中派生出的单个基因, 远离其家族, 表达会发生改变 假基因 : 基因家族中因突变而失去功能的基因不能产生具有生物活性的蛋白质 加工假基因 (processed pseudogenes) 有以下的特点 :⑴ 缺少正常的内含子 ;⑵3 末端有多聚腺苷酸 ; ⑶5 端的结构和 mrna 的 5 端十分相似 ; ⑷ 两侧有顺向重复顺序的存在 对以上特点作 何推论? 因此人们推测它似乎和 mrna 一样经过了转录后加工, 因此也称其为加工假基因 ; 四 Alu 家族 : 长约 300bp;Alu 顺序也称为短的分散因子 ; 由 RNA 多聚酶 III 转录的 在基因组中 30 万个拷贝 ; 在 170bp 处有一 AluI 的酶切位点 ; 由两个 130bp 的串联重复 顺序组成 ; 在二聚体的右半部有 31bp 插入序列, 此插入顺序来自 7SL RNA Alu 顺序有 何应用价值? 短的分散因子 (short interspersed elements, SINEs): 由 RNA 多聚酶 Ⅲ 转录的. 长的分散因子 (long interspersed elements, LINEs): 在哺乳动物中, 由 RNA 多聚酶 Ⅱ 转录的. L1 家族 : 长 6500bp 左右称为长的分散因子 ; 在基因组中约 6 万个拷贝 ; 由 RNA 多聚酶 II 转录的 属于一种转座因子 五. 高度重复顺序 : 卫星 DNA (satellite DNA): 卫星 DNA(satellite DNA) 是一类高度重复序 列 DNA 在介质氯化铯中作密度梯度离心, 离心速度可以高达每分钟几万转 ; 此时 DNA 分

7 子将按其大小分布在离心管内不同密度的氯化铯介质中, 小的分子处于上层, 大的分子处于 下层 ; 从离心管外看, 不同层面的 DNA 形成了不同的条带 根据荧光强度的分析, 可以看 到在一条主带以外还有一个或多个小的卫星带 这些在卫星带中的 DNA 即被称为卫星 DNA, 这种 DNA 的 GC 含量一般少于主带中的 DNA, 浮力密度也低 隐蔽卫星 DNA(cryptic satellite) 自私 DNA ( selfish DNA ) 伊甸园 DNA (Garden of Eden DNA; 小卫星 (minisatellite ) 重复序列可变数 DNA 指纹 (DNA fingerprints) 第六节 C- 值矛盾 C 值矛盾 (C-value paradox) :C 值和生物结构或组成的复杂性不一致的的现象 可能产生的 原因是什麽? 断裂基因间隔顺序 (spacer): 基因间不编码的部分 ( 有转录间隔区和不转录间隔区 ) 间插顺序 (intervening sequence) : 基因内部不编码的区域, 即内含子 (intron) 可编码的内含子 : 成熟酶, 内切酶 一 内含子的发现 二 内含子的结构特点 ( 一 ) 内含子和外显子的分布 ( 二 ) 内含子的相对性三 内含子的生物学意义 :1 有利于储存较多的遗传信息 ;2 有的内含子可编码内切酶 3 成熟酶归巢 4 调控 5 提高进化速率 第五章 第一节 DNA 的复制 半保留复制的验证 半保留模型 (semioconservetive model) 全保留复制模型 (conservetive model) 分散模型 (Dispersive model) 验证半保留复制的实验一 Meselson-Stahl 实验二 Taylar 实验三 姐妹染色单体差别染 色方法 (sister- chromatid differential staining)5 溴脱氧尿嘧啶 (5-Bromodeoxy uridine, 简 称 BUdR) 斑色染色体 (Harlequin chromosome) 四 Cairns 复制模型 θ 型复制第二节参与 DNA 复制的酶和蛋白 一 快停突变与慢停突变 快停突变 : 把细菌培养温度提高 (42 ~ 45 ) 复制迅速停止 快停突变所涉及的产物和链 的延伸有关 慢停突变 : 将细菌培养温度提高,DNA 合成并不立即停下来, 延续一段时间后合成才会停止 慢停突变表明突变的基因和复制起始有关 筛选出与 DNA 合成 延伸有关的蛋白和酶 二 原核生物复制的酶系统 ( 一 )DNA 聚合酶 1.DNA 聚合酶的共同特点 (1) 需要提供合成模板 ;(2) 不能起始新的 DNA 链, 必须要有引物提供 3'-OH;( 3) 合成的方向都是 5 3 ( 4) 除聚合 DNA 外还有其它功能 复制的特异性 ( 复制的忠实性 ):(1) 合成前错误控制 : 能够通过匹配的化学特点加以识别, 检查进入的碱基是否和模板互补, 这是一种合成前的预防措施 (2) 校正控制 : 在新的碱基 加到链上以后, 来检查碱基是否配对 发生错配时, 会把刚加上去的错误碱基切除 2.DNA 聚合酶的结构和功能 DNA 聚合酶有 6 个结合位点 :(1) 模板结合位点 ;(2) 引物结合位点 ;(3) 引物 3 -OH 结合位点 ;(4) 底物 dntp 结合位点 ;(5) 5 3 外切酶结合位点 ;(6) 3' 5' 校正位点 ( 二 )DNA 聚合酶 Ⅰ 的功能特点 : 主要用于 DNA 的修复和后随链中 RNA 引物的置换 使用的模板范围较宽 (1) 有引物的 ssdna( 线状或环状 ) (2) 有缺口的 dsdna( 无论大

8 小 );(3) 有切口 (nick) 的双链 DNA 聚合功能 外切活性 外切活性 (1) 切口平移 (nick translation);(2) 链的置换 ;(3) 模板转换 (template-switching) 4. 内切酶活性 ( 三 )DNA 多聚酶 Ⅲ 的结构 全酶在 DNA 上的装配分为三个阶段 :(1) 一个 β 二聚体加上一个 γ 复合体识别引物模板形成一种前起始复合物 (2)DNA 在于 β,γ 复合体结合的位点构象发生改变, 而对核心酶产 生了高亲和 使核心酶能与 DNA 结合 (3)τ 二聚体结合核心聚合酶, 使其二聚化 ( 四 ) DNA 连接酶 其作用机制是分三步进行 :1 E+ATP E-AMP+ppi 在 E.coli 中, E+NAD E-AMP +NMN( 烟酰胺单核苷酸 )2 E-AMP 上的 AMP 转移到 DNA 的 5 -PO4 上使其活化 3 活化的 5 -PO4 与相邻的 3 -OH 作用形成 3-5 磷酸二酯键, 并释放出 AMP 单链结合蛋白又称为双螺旋去稳定蛋白 ; 由 177 个 aa 组成 ; 在 E.coli 中以四聚存在 ; 分子 量为 74KDa, 每个分子可以覆盖 32nt; 在原核中 SSB 与 DNA 结合表现出协同效应 (1) SSB 之间的相互作用 ;(2) 第一个 SSB 和 DNA 的结合改变了 DNA 的结构 ( 六 ) 解旋酶 (helicase) 第三节复制的起点 方向和终点 一. 研究方法 :1. 用同位素标记电镜观察及变性法 2. 用噬菌体插入标记法同步培养不同 步培养 3. 变性定性法 (denaturation mapping)4. 双向电泳法 不同生物复制起点和方向 : E.coli 定点 双向对称复制 T7 在近一端的 17% 处开始, 向两 端延伸 枯草杆菌有固定的起始点, 双向不对称复制 质粒 R6K 早期为单向复制, 复制了约 1/5 时基因组进行双向复制 质粒 Col E1 有固定起始点, 但却为单向复制 mt DNA 进 行 D(displaced loop) 环复制 真核有多个复制起点 (i), 双向等速复制 ( 一 ) 环状 DNA 复制 复制起始区的结构特点是 :(1) 富含 A-T, 这可能和双链易于解开起始复制有关 ;(2) 含 有多个回文结构 (9-14 个 GATC)8 个 GATC 较保守,CATC 中的 A 已甲基化 ;(3) 具有 4 个反向重复顺序, 作为蛋白结合位点 ;(4) 此顺序的右侧毗邻区域有两个起动子, 其可能的 作用是 :1 转录产生引物 ;2 产生复制必要的蛋白 ;3 产生调节功能的 RNA;4 起转录激 活作用 哪些 DNA 进行滚环复制? 真核 rdna 的扩增,F 因子 DNA 的转移,λ 裂解途经的复制, φ X174,M13.G4 等单链环状 DNA 噬菌体第二阶段复制都是进行滚环复制的. ( 二 ) 线状 DNA 复制 DNA 中间起始复制 DNA 末端起始复制 线性双链 DNA 的复制有的是从一端开始的 : 腺病毒 (Adenovirus)φ29 DNAs 脊髓灰质病毒 (poliovirus); 腺病毒 DNA 全长 bp, 线性双链, 两端各有反向重复顺序 103~162 bp, 两末端各有 50 bp 为复制起点 其复制是以单链置换 (strand displacement) 形成一个大的茎 环或叫平锅形结构来进行的 ( 三 ) 复制的终止 1.E.coli 的复制终止 ( 环状 DNA 复制终止 ) 现已发现有两个终止区域 (tere,d,a 和 ter C,B), 位于相遇点的另一侧 100Kb 处 每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的 ter 顺序有一个 23bp 的区域, 在体外可导致复制的终止, 但其功能显示了一定的方向性 终止 需要 tus 基因的产物 Tus, Tus 能识别 ter 保守顺序, 并阻止复制叉继续前进 ter-tus 复合 物可能通过抑制螺旋酶来实行终止 2. 线性 DNA 的复制终止两个 5 有空缺的分子通过 3 端凸出的重复序列互补配对 DNA

9 多聚酶 Ⅰ 从 3 端延伸填补起这个空缺, 留下最后的裂隙由连接酶封闭, 产生了一个大分子 串联体 由限制酶在连接处交错切割, 产生 3 凹端, 由 DNA 多聚酶 Ⅰ 在 3 -OH 上延伸 填满新的空缺, 产生两条完整的双链 第四节复制的过程 一 半不连续复制 1 冈崎片段 : 任何一种 DNA 聚合酶合成方向都是从 5' 向 3' 方向延伸, 而 DNA 模板链是 反向平行的双链, 这样在一条链上,DNA 合成方向和复制移动方向相同 ( 前导链 ), 而在另 一条模板上却是相反的 ( 后滞链 ) 那么在复制叉中新链是如何合成的呢?Reiji Okazaki 在 DNA 合成实验中添加放射性的脱氧核苷酸前体观察到前导链连续合成, 滞后链分段合成 这些分段合成的新生 DNA 片段称冈崎片段 细菌冈崎片段长度 核苷酸, 真核生物冈崎片段长度 核苷酸 (1) 脉冲标记实验 : 以 E.coli 为材料, 在培养时, 培养基中加入同位素 [3H] 标记的 dttp, 经 30 秒后,DNA 刚开始复制, 分离 DNA, 然后在碱中沉淀, 变性, 让新合成的单链和模 板链分开, 再用 CsCl 密度梯度离心, 以沉降的快慢来确定片段的大小, 再检测放射标记, 结果表明被 3H 标记的片段, 也就是新合成的片段, 沉淀系数为 20S 左右, 即都是长 1000~2000Nt 的 DNA 片段, 而亲本链要比它大 20~50 倍 (2) 脉冲追逐实验 : 早期合成的 DNA 片段以后的命运又是如何的? 是依然如旧的短片段, 还是连接成了长片段 这个实验是先进行标记培养 30 秒, 以后除去同位素继续培养几分钟, 再分离 DNA 在碱中沉淀, 检测结果 先合成的 ( 带标记 ) 的 DNA 不再是短片段, 而和总 DNA 的情况相似, 沉淀系数为 70S~120S 较长的片段, 这意味着刚开始合成的片段都是短片段, 以后再连接成长片段, 人们就把最初合成的短片段称为冈崎片段 (Okazaki fragment) 形成前导链小片段的原因 : 细胞内都存在有 dttp 和 dutp, 而 DNApolⅢ 却并不能区分它 们, 因此也会将 dutp 加入到 DNA 中, 形成 A U 对 那么在 DNA 中为什么没有 U 的存 在呢? 这是因为 E.coli 细胞里有双重 保险, 防止了 U 的 混入 第一道关是细胞里的 dutpase, 它能使 dutp 变成 dump,dump 是不能作为 DNA 合成的底物, 这样它就不再能加入 DNA 中 第二道关是尿嘧啶 N- 糖苷酶 (uracil N-glycosylase), 它可以切断混合尿苷 的糖苷键, 形成无 Pu 和 Py 位点 (apurinic or apyrimidinic,ap), 再由 AP 内切酶在 AP 位 点切出一个缺口, 进一步进行切除修复 在细胞内尿嘧啶 N- 糖苷酶作用较快, 而 AP 酶作 用较慢, 在新链合成之初约 1200bp 就有可能掺进一个 U, 但很快就被尿嘧啶 N- 糖苷酶切断 糖苷键, 在 AP 酶未作用前在脉冲标记实验中就提取了, 用 NaOH 沉淀时,AP 位点十分易断裂, 所以前导链也成了小片段 复制体和回环模型 : 双螺旋复制是同时复制的 :1 每一个复制叉含有特别大的多聚体 Ⅲ 复合 体, 它是一个不对称的二聚体, 可能同时催化两条链 2 在电镜下观察到双螺旋 DNA 聚合 酶 α 也同样具有两个活性部位 ; 复制体 (replisome): 是由解旋酶 引发酶和 DNA Pol Ⅲ 全 酶组成的复合体 回环模型 : DNA 合成时, 沿着复制叉的方向移动 后随链模板形成了一个回环, 使环中 RNA 引物和冈崎片段的合成方向与前导链一致, 以适应双链在同一复制体 上进行复制 特点 :1 聚合酶和引发体联系在一起可以协调它们的作用 ;2 复制体中的 DNA Pol Ⅲ 是二聚体 ;3 后随链是形成回环复制的 二 真核生物的 DNA 复制 1 真核生物 DNA 聚合酶和有关蛋白 2 真核生物复制特点 :1 基因组中有多个复制起点 ; 2 一般要等第一轮复制结束后第二轮 才开始 3 真核的复制起点到两边的复制终点称为一个复制子或一个复制单位 DNA 开始 合成的位置, 一个初始起点 ( 或者双向复制起点 - 大多数起点是双向的 ), 两侧有一些二级起点 初始起点经常是 0.5-2kbp 长, 而二级起点可跨越 50kbp, 因此称为起始地带 4 真核和原核复

10 制子的大小是非常相似的, 但复制的速率真核要比原核慢得多 ;5 真核的复制起始点的数目 和复制单位的大小是随着细胞的特点变化而改变的, 如不同的生长速率的细胞和不同组织的 细胞 6 并非所有的复制子都同时进行 DNA 复制 而是有一定的起始时间顺序 不同类型 的细胞复制起始的顺序也不同 3 真核生物 DNA 复制起始区结构 (1)T 蛋白具有解链酶活性, 通过水解 ATP 解开双链, RF-A 立即和单链结合, 使之稳定 ;(2) 复制叉移动一段距离,polα- 引发酶复合物结合到复 制区, 合成第一段 RNA 引物 ;(3)RF-C 结合到引物上, 使 polα 合成第一条冈崎片段 ;(4) 到前导链和后滞链的分界区,polα 从单链上解下来, 再结合到新的复制叉处合成后滞链 (5)polδ,RF-C 和 PCNA 结合到前导链的第一条冈崎片段 3 端开始合成前导链 (6) SV40 的复制可能也形成复制体, 后滞链形成回环酵母的自主复制区 :1ARS 2 发挥复制起点的功能, 但是过量的 3 酵母染色体 Ⅳ 的着丝粒 附近为 ARS1 序列 ;4ARS1 分为 A,B,C 三个功能区, A,B 起主要作用,C 起次要作用 5A 区 为 15bp, 其中 11 个保守, 称 ACS 有复制起始子的功能 ;6B 区约为 80bp, 含 B1,B2,B3 三 个功能区 7B3 是 ABF1 结合区 ORC: 由 6 个亚基组成相当于 Dna A 和 λ 的 O 蛋白, 与 A/B1 结合, 结合于游离的 DNA Cdc6: 相当于 DnaC, 及 λ 的 P 蛋白, 使 Mcm 蛋白结合到复合体上 此对在 Origin 上起始复制是必须的 Mcm: DnaB 螺旋酶 即 licensing factor ABF1( 转录因子 ) 结合于 B3 三 原核和真核生物复制体系比较 四 DNA 与组蛋白的组装 五 真核 DNA 复制终止 :(1) 首先是端粒酶与端粒 DNA 结合, 端粒酶中的 RNA 与凸出的 3 引物配对 ;(2) 以 RNA 为模板, 在 DNA3 端上从头合成 DNA;( 3) 延伸六个 Nt; (4) 合成一个重复单位后, 端粒酶向 DNA 模板新合成的 3 移动, 引物再和模板配对, 就 这样循环往复, 周而复始 最后延伸的 3 端再回折, 以 G G 配对的方式形成发夹结构, 产 生端粒 六复制的调控第六章转录 1957 年 Crick 提出了中心法测 1970 Crick 又作了部分修改 第一节 信使的发现 转录 : 基因表达时以 DNA 的一条链为模板合成 RNA 的过程 RNA 聚合酶 : 催化合成 RNA 的聚合酶 Jacob 和 Monod 预言 :(1) 这种 信使 应是一个多核苷酸 ;(2) 其分子平均不小于 5105bp, 足以携带一个基因的遗传信息 ;(3) 它们至少是暂时连在核糖体上 ;(4) 其碱基组成反映了 DNA 的序列 ;(5) 它们能高速更新 Jacob 和 Monod 将它定名为 : 信使 RNA 或 mrna 第二节 RNA 的酶促合成 一. RNA 合成的特点是 :(1) 以核糖核苷三磷酸 (rntr) 为底物 ;(2) 以 DNA 为模板 ;(3) 按 5-3 方向合成 ;(4) 无需引物的存在能单独起始链的合成 ;(5) 第一个引入的 rntp 是以三磷酸形式存在 ;(6) 在体内 DNA 双链中仅一条链作为模板 ;(7)RNA 的序列和模板 是互补的 (8)RNA 无校正能力 RNA 合成和 DNA 复制的区别 (1) 转录时只有一条 DNA 链为模板, 而复制时两条链都可 作为模板 ;(2)DNA-RNA 杂合双链不稳定,RNA 合成后释放, 而 DNA 复制叉形成后一直打开, 不断向两侧延伸, 新合成的链和母链形成子链 ;(3)RNA 合成不需引物, 而 DNA 复 制需引物 ;(4) 转录的底物是 rntp, 复制的底物是 dntp;( 5) 聚合酶系不同 第三节 细菌基因的转录 一. 细菌的 RNA 聚合酶

11 RNA pol 和 DNA pol 也有 2 点不同 :(1)RNA pol 没有任何校对功能 ;(2) 能起始新的 RNA 链 RNA pol 执行多种功能 (1) 识别 DNA 双链上的启动子 ;(2) 使 DNA 变性在启动子处解旋成 单链 ;(3) 通过阅读启动子序列,RNA pol 确定它自己的转录方向和模板链 (4) 最后当它达 到终止子时, 通过识别停止转录 二. 原核生物转录的起始延伸 ( 一 ) 启动子 (promoter) 的结构和转录起始 : 转录基序与启动子结合, 启动转录的起始 一 般将 DNA 上的转录位点定为 +1 来排序, 其下游为正值, 其上游为负值 原核生物不同基 因启动子有共同特点 :(1) 结构典型, 都含识别 (R), 结合 (B) 和起始 (I) 位点 ;(2) 序列保守 ; (3) 位置和距离都比较恒定 ;(4) 直接和多聚酶相结合 ; (5) 决定转录的启动和方向 (6) 位于基因的 5 端 ; 序列 :-10 序列是由 Pribnow 和 Schaller(1975) 发现, 故也称为 Pribnow 框盒 (Pribnow box) 保守序列为 T80A95T45A60A50T96 位于 -10bp 左右,A.T 较丰富, 易于解链 其功能是 :(1) 与 RNA pol 紧密结合 ;(2) 形成 开放启动复合体 ;(3) 使 RNA pol 定向转录 -10 序列对转录的效率影响 :TATAAT AATAAT, 转录效率下降, 称为下降突变 (down mutation) TATGAT TATAAT, 转录效率上升, 为上升突变 (up mutation) 以上突变为何 会影响转录效率? 前者可能由于的堆集能要小于的堆积能, 后者可能是由于堆集能 降低和氢键的减少 序列 :-35 序列又称为 Sextama 盒, 其保守序列为 (T82T84G78A65C54A45) 其功能是 :(1) 为 RNA pol 的识别位点 σ 亚基识别 -35 序列, 为转录选择模板 (2)-35 和 -10 序列的距 离是稳定的, 此与 RNA pol 的结构有关 3. 转录起始位点 (I) : 转录开始时模板上的第一个碱基 ; 在原核中常为 A 或 G; 而且位置 固定 ; ( 二 ) 转录的起始 :1. 全酶与模板的 DNA 接触, 生成非专一的, 不稳定的复合物在模板上移动 ;2. 起始识别 : 全酶与 -35 序列结合, 产生封闭的酶 - 启动子二元复合物 ;3. 全酶紧密地 结合在 -10 序列处, 模板 DNA 局部变性, 形成开放的启动子二元复合体 ;4. 酶移动到 I, 第 一个 rntp 转录开始,σ 因子释放, 形成酶 - 启动子 -rntp 三元复合体 (ternary complex) RNA 核心酶和全酶在 DNA 上的分布 :(1) σ 和 1/3 的 RNA pol 结合成全酶, 或在非特异位点的松 散复合体中, 或在启动子中的二元复合体中 ; (2) 其中半数的核心酶从事转录 ;(3) 余下的核心酶大量存在于闭合松散复合体中 ;(4) 估计数量很少的全酶是游离的 三 原核生物转录的终止 终止子 (terminator,t): 强终止子 - 内部终止子, 无需其他因子的帮助, 就能终止核心酶的 转录 弱终止子 - 需要 ρ 因子 ( 又称为 ρ 依赖性终止子 ) 才能终止核心酶的转录 强终 止子的结构特点 :(1) 有回文结构存在 ;(2) 茎的区域内富含 G-C;(3) 强终止子 3 端上有 6 个 U; 以上结构特点在终止中起何作用?1 由它转录成的 RNA 形成颈环结构阻止 RNA 聚合酶的前进 2 使茎环不易解开 3 由于其模板形成连续 UA 配对, 较易打开从而便于释放 RNA 四 RNA 聚合酶和噬菌体转录策略 : 小的噬菌体利用宿主的 RNA pol 进行转录 大的噬菌体 自己编码 RNA Pol 宿主 RNA 转录 T7 的部分染色体, 包括基因 1 T7 的基因 1 编码 RNA 聚合酶 其它基因的产物可抑制宿主 RNA 聚合酶 T4 噬菌体编码一种蛋白和 E.coli 的 RNA pol 酶相互作用, 使宿主的聚合酶只转录噬菌体的基因, 而不能转录细菌的基因 第四节真核生物的转录 真核生物的转录和原核生物转录的不同点 :(1) 原核只有一种 RNA 聚合酶, 而真核细胞有

12 三种聚合酶 ;(2) 启动子的结构特点不同, 真核有三种不同的启动子和有关的元件 ;(3) 真 核的转录有很多蛋白质因子的介入 一. 真核的 RNA 聚合酶 二. 真核生物的启动子 启动子 Ⅱ 最为复杂, 它和原核启动子有很多不同 :(1) 有多种元件 :TATA 框,GC 框,CATT 框,OCT 等 ;(2) 结构不恒定 ;(3) 它们的位置 序列 距离和方向都不完全相同 ;(4) 有的有远距离的调控元件存在, 如增强子 ;(5) 这些元件常常起到控制转录效率和选择起始 位点的作用 (6) 不直接和 RNA pol 结合 ;(7) 需多种转录因子介入 Ⅱ 类基因的启动子和调控区 : 核心元件 :1TATA 框合又称 Hogness 框,Goldberg-Hogness 框, 俚语称为金砖其一致序列是 :T85A97T93A85A63A83A50 常在 -25 左右, 相当于原核的 -10 序列 其作用是 :(1) 选择正确的转录起始位点, 保证精确起始, 故也称为选择子 (2) 影响转录的速率 2 起始子 : 起始点一般没有同源序列 ;mrna 的第一个碱基倾向 A, 另一侧翼由 Py 组成称为起始子 (initiator,inr).( 在原核 CAT 起始序列也有这种情况 ) 一般 由 PY2CAPY5 构成 ; 位于 -3~+5; 提供 RNA pol Ⅱ 识别 无论 TATA 是否存在,Inr 对启动 子的强度和起始位点的选择都是重要的 现已纯化了 Inr 结合蛋白 上游元件略远端调控区 : ㈠增强子 : 又称远上游序列其特点是 :1 具有远距离效应 2 无 方向性 3 顺式调节 4 无物种和基因的特异性 5 具有组织的特异性 6 有相位性 其作用和 DNA 的构象有关 7 有的增强子可以对外部信号产生反应 增强子为什么具有 远距离作用呢?(1) 拓朴效应 ; 拓朴效应说认为增强子的作用是诱导染色质结构变化, 使 核小体产生 DNaseI 敏感区 (2) 滑动模型 ;(3) 成环模型 ㈡衰减子 : 负调节上下游远端 ㈢沉默子 : 阻遏基因的转录 第七章遗传密码和遗传信息的翻译系统 第一节 遗传密码的破译 一. 遗传密码的试拼 二 三联密码的证实 :1961 年 Crick 和 Brenner.S 等证实了三联密码的真实性 他们用 T4 染色体上的一个基因 (rⅡ 位点 ) 通过用原黄素 (proflavin) 处理, 可以使 DNA 脱落或插入 单个碱基, 插入叫 加字 突变, 脱落叫 减字 突变. 无论加字和减字都可以引起移码 突变 Crick 小组用这种方法获得一系列的 T4 加字 和 减字 突变, 再进行杂交来获得 加入或减少一个, 二个, 三个的不同碱基数的系列突变 1 它们只能在 B 菌株上生长形成噬 菌斑 ;2 开始用原黄素诱导的突变称 FCO,3 他们再用原黄素诱导产生回复突变, 在 E.coli K (λ) 菌株中出现了噬菌斑 4 用遗传学的方法和野生型杂交发现它们并不是真正的野生型 校正突变 (A suppressor mutation) 抵消或抑制了前一次突变的效应, 校正突变的特点如下 : (1) 校正突变是在第一次突变不同位点将它抵消的 因此原来的突变可以通过野生型和回复 突变型之间的杂交又恢复为突变型 ;(2) 校正突变可能发生相同的基因中, 抑制原来的突变 ( 如刚举的例子 ), 称基因内抑制, 或发生在不同的基因中称基因外抑制 (3) 不同的抑制可能作用的方式不同 如有的抑制是在转录和翻译水平, 有的可能是通过细胞生理功能来实 现 mrna 上的 3 个碱基作为一个密码子 (codon), 头 3 个就读成第一个字 当原黄素诱 导使 DNA 上的增加或减少了单个碱基将会使阅读框移动, 导致 错误, 这样的移框突变 可能导致遗传信息变成 无义 的 若第二次诱变相应地插入或缺失一个碱基可以恢复正确 的阅读框 通过这样的方法发现加入或减少一个和二个碱基都会引起移码突变, 而加入或减少 3 个碱基时反而可以恢复正确的读框, 表明每个密码的确是由 3 个碱基组成的 Crick 对 遗传密码提出了 4 个特点 :13 个碱基一组, 编码一个氨基酸 2 密码是不重迭的 ( 实验证据 来自 Wittmann 等的实验及 Tsugita A.,Fraenkel-Conrat H 用亚硝酸诱发烟草花叶病毒 TMV 产生的突变体的研究中得到的 );3 碱基的顺序是从固定起点解读的, 即 mrna 具有固定的

13 阅读框 ;4 密码子是简并 (degeneracy) 的, 即某个特定的氨基酸可以由几个密码子来编码 三. 利用突变来解读密码 四. 无细胞系统的建立方法是 :(1) 去模板 : 用 DNAase 处理 E.coli 抽提物, 使 DNA 降解, 除 去原有的细菌模板 (2) 加入 pol U: 合成了多聚苯丙氨酸, 这一结果不仅证实了无细胞系 统的成功, 同时还表明 UUU 是苯丙氨酸的密码子 分别加入 polya,polyc 和 polyg 结果相应地获得了多聚赖氨酸, 多聚脯氨酸和多聚甘氨酸 (3) 按比例加入 2 种核苷混合的多聚 物 由于当时还未分离 RNA pol 酶, 无法按设计的模板来合成 RNA,Nirenberg 又想出了一 种新的方法, 就是按一定的碱基比例来合成 RNA 比如在底物中加 5 份的 UDP 和 1 份的 GDP, 碱基比为 U:G=5:1, 它们能组成 8 种三联体 :UUU,UUG,UGU,GUU,GGG, GGU,GUG,UGG U 和 G 将随机地加入到三联体中, 这样按比例各个位点上进入 U 和 G 的概率不同 如 UUU:UGG=(555):(511)=25:1 同理 UUU:UUG =5:1, 根据检 测结果推测 : 苯丙氨酸 (UUU): 半胱氨酸 (UGU)=5:1 苯丙氨酸 (UUU): 缬氨酸 (GUU) =5:5 苯丙氨酸 (UUU): 甘氨酸 (GGU)=24: 1 终止密码子 :UAA UGA UAG 起始密码子 :AUG GUG 五. 三联体结合实验 1964 年 Nirenberg 又采用三联体结合实验 (1) trna 和氨基酸及三联体的结合是特异的 ;(2) 上述结合的复合体大分子是不能通过硝酸纤维滤膜的微孔, 而 trna- 氨 基酸的复合体是可以通过的 六. 利用重复共聚物破译密码 Khorara 采用了有机合成一条短的单链 DNA 重复顺序, 然后 用 DNA pol 1 合成其互补链, 再用 RNA pol 及不同的底物合成两条重复的 RNA 共聚物 ( 图 14-3), 作为翻译的 mrna, 加入到体外表达系统中第二节遗传密码的证实和特点 一. 遗传密码的证实 :1966 年 Sterisinger 等用噬菌体 T4 证实了遗传密码是完全正确的 他们 采用的方法跟 Crick 的原黄素诱发移码突变的方法相同, 使 T4 溶菌酶产生了移码突变, 根 据突变后的蛋白质一级结构和野生型溶菌酶氨基酸顺序进行了比较, 二. 遗传密码在纤毛虫和线粒体中的改变一. 遗传密码的特点 :(1) 遗传密码是三联体密码 (2) 遗传密码无逗号 (3) 遗传密码是不重迭 的 (4) 遗传密码具有通用性 (5) 遗传密码具有简并性 (6) 密码子有起始密码子和终止密码 子 (7) 反密码子中的 摆动 (wobble) 摆动假说 (wobble hypothesis) 是由 Crick.F(1966 年 ) 提出的 即当 trna 的反密码子与 mrna 的密码子配对时前两对严格遵守碱基互补配对法则, 但第三对碱基有一定的自由度可以 摆动 摆动假说也称为三中读二 (2 out of 3 reading) 第三节 trna 的结构和功能 一. trna 的结构 ( 一 ) 三叶草型的二维结构 :(1) 各种 trna 均含有 70~80 个碱基, 其中 22 个碱基是恒定的 2) 5 端和 3 端配对 ( 常为 7bp) 形成茎区, 称为受体臂 (acceptor arm) 或称氨基酸臂 在 3 端永远是 4 个碱基 (XCCA) 的单链区, 在其末端有 2 -OH 或 3 -OH, 是被氨基酰化位点 此臂负责携带特异的氨基酸 (3)TψC 常由 5bp 的茎和 7Nt 和环组成 此臂负责和核糖体 上的 rrna 识别结合 ;(4) 反密码子臂 (anticodon arm) 常由 5bp 的茎区和 7Nt 的环区组成, 它 负责对密码子的识别与配对 (5)D 环 (D arm) 的茎区长度常为 4bp, 也称双氢尿嘧啶环 负 责和氨基酰 trna 聚合酶结合 ;(6) 额外环 (extra arm) 可变性大, 从 4 Nt 到 21 Nt 不等, 其功能是在 trna 的 L 型三维结构中负责连接两个区域 (D 环 - 反密码子环和 TψC- 受体臂 ) L 型结构 :(1) 氨基酸受体臂位于 L 型的一侧, 距反密码子环约 70 Å (2)D 环和 TψC 环形成 了 L 的转角 (3) 在一些保守和半保守的碱基之间形成很多的三级氢键, 使分子形成 L 形, 并使结构稳定 (4) 使得三维结构得以形成的这些碱基配对涉及到与磷酸核糖主链相互

14 作用的三级结构的磷酸二酯键分布在核糖的 2 -OH 上 (5) 几乎所有的碱基平面之间产生堆 积的作用 (6) 在反密码子茎中仅有很少的三级氢键 二. 校正 trna 抑制基因 (suppressor) 或称校正基因 ( 一 ) 无义抑制 (nonsense suppressor)1. trna 反密 码子的突变 2. trna 其它结构的改变第四节核糖体的结构和功能 第八章蛋白质的合成转运和加工 第一节氨基酰 -trna 的形成及核糖体的作用位点 一. 氨基酰 trna 分子的形成 活化 :aa + ATP + E* 氨基酰 -AMP-E + PPi 转移 : 氨基酰 -AMP-E + trna aa - trna+amp +E 二. 氨酰 trna 合成酶的鉴别功能 : 动力学校对 三 化学校对 核糖体的作用位点 :⑴A 位点大部分在小亚基中 ( 或称 acceptor site) 可以进入氨基酰 -trna(aminoacyl-trna) ⑵ P 位点 ( 或称供位,donor site) 是被肽基酰 -trna(peptidyl-trna) 所占据 大部分在大亚基中 (3)E 位点 (Exit site) 脱酰 RNA (deacylated- trna) 短暂地占据 空出位点 第二节肽链的合成 一. 在细菌中翻译的起始 :⑴IF-3 是 30S 亚基与 mrna 起始位点的特异结合所必须的 ⑵IF-2 是特异地和起始 trna 结合并把它带到起始复合体中 ⑶IF-1 仅作为完整的起始复合物的一 部分, 可能和起始复合物的稳定性有关, 而不是提供任何识别特异成份 起始复合物的形成 :(1) IF-3 和核糖体 30S rrna 结合使 16S RNA 和 mrna 的 S-D 顺序结合 a. 使 30S 保持游离 b. 形成起始复合体 I(2) IF-2 + GTP + 氨酰甲硫氨酸中间复合体 (3) IF-1 置换出 IF-3, 50S 亚基可和 30S 亚基结合 (4) 50S+30S 复合体 III, 释放 IF-1,IF-2 起始 trna 的特点 : 翻译时第一个密码子是怎样被识别的呢?( 一 ) 小亚基 16SrRNA3 端的 6 核苷酸 (3 -UCCUCC-5 ) 和 Shine-Dalgarno 顺序 (5 -AAACAGGAGG-3 ) 互补, 相互结合, 使下游 AUG 起始密码子定位在 P 位上 ( 二 ) 核糖体结合位点也含有一个信号起始密 码子 (initiation codon)-aug ( 三 ) AUG 是相对于 Met 的密码子, 而两种类型的 trna 都 能携带 Met, 但一个用于起始, 另一个用于延伸.( 四 ) 起始 trna 首先负载上氨基酸产生了 一个 Met- trna, 然后通过甲酰化反应封闭了自由的 NH2 基, 使氨基不可能参与链的延 伸, 但羧基可以延伸肽链. 起始和延伸 Met-tRNAs 的区别 :⑴ 两种 trna 本身有差别 ⑵ 氨基酸的状态不同 fmet-trna 与 Met-tRNA 不同表现为 :⑴ Met-tRNAmMet 在受体臂末端的一对碱基是 GC, 在 fmet-trnafmet 是 CA,C 可以和延伸因子 IF-2 结合 ⑵tRNAfMet 在反密码子环的茎上 有 3 对 G-C, 若发生突变将会阻止其进入 P 位点 ⑶tRNAfMet 的反密码子环上的是 A, trnammet 是烷基化腺嘌呤 trnafmet TψC 环端是 A,tRNAmMet 的相应位置是 G, 作用不清 二. 真核生物蛋白质合成的起始 : 真核与细菌的蛋白质合成的起始机制是相同的, 其主要的 区别在于 :1 各种成分装配的次序不同 ;2 真核起始因子数目较多, 名称和原核的相似, 但 在前面加上 e, 表示是真核生物的起始因子 3 真核翻译的起始和延伸都使用相同的甲硫 氨酸 只在使用的 trna 自身的结构上有区别 1. 前起始复合物与 mrna 结合, 需要几种起始因子.2 帽结合蛋白质 (cap bindingprotein,cbp)(eif-4f),eif-3,eif-4a,eif-4b 帽 结合蛋白促进 40S 亚基的起始结合 eif-4a 与 4B 共同作用去除 5 非翻译区域 (UTR) 的二 级结构.3 帽结合蛋白质和 eif-3 帮助 40S 亚基结合以形成起始复合物 4.eIF-5 介导大亚基 与另一个起始因子 eif-6 相缔合.5.eIF-2 和 eif-3 从前起始复合物上解离及 eif-6 从大亚基

15 上解离 起始因子 eif-2 和 eif-6 都是抗缔合因子 (antiassociation), 它们防止核糖体亚基在胞 浆中相互作用 当大亚基结合时其他的起始因子从核糖体上解离 起始复合体 (ternary complex) 形成 : 首先 GTP 和 eif-2 结合, 与 Met-tRNA 结合 三元复合 体再与 40S 亚基结合 核糖体结合位点由起始密码子所决定, 在某些起始密码子上游邻接 序列十分重要, 称为 Kozak 序列 (ACCAUGG), 相当于原核 S-D 序列 前起始复合物结合 5 7meG 帽结构并沿着 mrna 扫描, 借助 Kozak 序列搜寻第一个起始密码子 三. 起始时 mrna 和 rrna 的碱基配对 ( 一 ) 原核 30S 小亚基和 S-D 顺序的结合在细菌中被核糖体保护的 DNA 区域长 碱基长 有 2 个共同的特点 :⑴ 含有起始密码子 AUG;⑵ 有一个顺序和 16SrRNA 近 3 端的顺序互补 ( 二 ) 真核合成起始时小亚基和起始位点的结合 : 真核细胞质中的核糖体并不在编码区开始处直接和起始位点相结合 首先识别 5 端甲基化的帽子结构 内部核糖体进入位点 (internal ribosome entry site, IERS)A 最适合的邻接顺序是 GCC 第三节肽链合成的延伸和终止 一 肽链合成的延伸 CCAUGGG 称为 Kozak 顺序 肽链的延伸可分为三个阶段 :⑴ 进位反应 : 主要是密码子 - 反密码子的识别 ;⑵ 转位反应 : 涉及肽链的形成 ;⑶ 移位反应 :trna 和 mrna 相对核糖体的移动 ( 一 ) 进位反应 原核生物蛋白质合成的延伸因子 : 延伸因子 (elongation factor)(1) 当 GTP 存在时,EF-Tu 呈活性状态 (2) 当 GTP 水解成 GDP 时,EF-Tu 便失活 (3) GDP 被 GTP 取代后, 它又 恢复活性 二. 肽链合成的终止 终止密码 UAA,UGA,UAG; 在 E.coli 中释放因子 (release factors(rf)) ;RF1 识别 UAA; RF2 识别 UGA 和 UAG 这两种因子作用于 A 位点, 且需要 P 位点的肽酰 -trna 存在 终止 反应是释放因子识别终止位点并与之结合, 激活肽基转移酶, 水解了 P 位点上多肽与 trna 之间的键, 然后释放了多肽和 trna 在真核系统中只有一种释放因子 eef 可识别 3 种终止密码子 第四节 一 翻译后的加工 N - 端 f-met 或 Met 的切除 : 原核生物的肽链, 其 N- 端不保留 fmet, 大约半数蛋白由脱 甲酰酶 (deformylase) 除去甲酰基, 留下 Met 作为第一个氨基酸 ; 在真核细胞中 fmet 或者 Met 一般都要被除去, 此是由氨肽酶 (amino peptidase) 水解来完成的 第二氨基酸是 Arg, Asn,Asp,Glu,Ile 或 Lys 以脱甲酰基为主, 如邻接的氨基酸是 Ala, Gly, Pro,Thr 或 Val 则 常除去 fmet 二 二硫键的形成 : 两个半胱氨酸中相距较远硫氢基可以氧化成二硫键, 产生 mrna 中没有 相应密码子的胱氨酸 很多细胞外蛋白质中二硫键的形成, 例如胰岛素, 免疫球蛋白 三化学修饰 : 磷酸化 : 核糖体蛋白的 Ser,Tyr 和 Trp 残基 ; 糖基化 : 各种糖蛋白 ; 甲基化 : 组蛋白, 肌蛋白 ; 乙酰化 : 组蛋白 ; 羟基化 : 胶原蛋白 ; 四 剪切 : 反转录病毒中有 3 个基因 gag,pol 和 env, 其中 pol 基因长约 2900NT, 其产物经 剪切后产生反转录酶, 内切酶和蛋白酶三种蛋白 其他两个基因的产物也要经过加工才能产 生核心蛋白和外壳蛋白 胰岛素是一种分泌收白, 具有信号肽 新合成的前胰岛素原 (preproinsulin), 切除信号肽变成了胰岛素原 (proinsulin), 它是单链的多肽, 由 3 个二硫键将主键连在一起, 弯曲成复杂的环形结构 由 A 链 (21aa)B 链 (31aa) 和 C 链 (33aa) 三个连续的片段构成 当转运到胰岛细胞的囊胞中,C 链被切除, 成为由 A,B 两条分开的 链由 3 个二硫键连结成成熟的胰岛素 第二节蛋白质的越膜运输

16 一. 蛋白质的定位装置 : 蛋白分检 (Protin sortin:g) 蛋白质的运输 (trafficking) 二. 导肽 ((Leader sequence)) 核糖体可分为游离的和膜结合的两类 ; 翻译后转运 ; 共翻译转运 ; 信号肽 ; 整合膜蛋白 三. 导肽的结构和功能 : 导肽通常是疏水的,~20aa; 由非电负性氨基酸构成, 中间夹有碱性 氨基酸, 而没有酸性氨基酸, 羟基氨基酸含量高 ; 易形成双亲螺旋轮 (amphiphilic helix); 不同的前导顺序缺乏同源性, 意味什么? 这意味着和识别有关的信号不是一极结构的序列, 而 是氨基酸的性质 四. 导肽在线粒体叶绿体中决定蛋白位 ( 一 ) 线粒体的蛋白转运 : 基质导向信号 ( matrix-targeting signal ) 膜导向信号 (membrane-targeting sigmal) ( 二 ) 叶绿体蛋白的转运 : 基质 (stroma) 类囊膜 (thylakoid membrane) 腔 (lumen) ( 三 ) 核蛋白的转运 : 输入和输出 五. 信号肽的结构和功能 ( 一 ) 信号假设的建立 :1972 年 Milstein 等发现 IgG 轻链前体比成熟的 Ig N- 端多 20 aa; 美国 Bloble 完成三项实验支持了以上推测 :(1) 将 IgG 的 mrna 在无细胞系统中, 以游离核糖体在体外合成的是 IgG 前体 ; 若在无细胞系统中加入狗胰细胞的 RER, 就能产生 IgG 成熟 蛋白 成熟的 IgG 轻链蛋白和前体蛋白相差疏水性 20aa, 说明什么?(2) 加入蛋白水解酶 不能使正在合成的 IgG 水解, 而同时加入去垢剂就可以使其水解 此表明什么?(3) 用去垢 处理骨髓瘤后所获得的多核糖体与膜分离, 然后在离体的条件下继续进行新生肽的合成 经 短时温育得到的是成熟的 IgG, 而长时温育得到的是前体 IgG, 此表明什么? 核蛋白的转运 : 入境 : 出境 : mrna NLS 的特点 :1. 无保守序列 ;2. 有一段短的碱性氨基酸序列 ;3. 常存在 Pro, 可抑制碱性氨基 酸的上游形成螺旋 ;4. 有的 NLS 有两个分开的短的簇 5. 所有的 NLS 序列都可被 入境 系统 所识别