2006 犞狅犾 26. 犛狌狆狆犾. 郄翠仙等 乳酸杆菌作为受体菌的研究及应用 23 转铁蛋白来使食品中增加铁的吸收性能? 3 乳杆菌与免疫疫苗载体 乳酸杆菌另一个在医学领域具有很大应用潜力的方向是将其作为某些免疫接种的疫苗载体? 乳酸杆菌作为疫苗载体具有较大的优越性 在呼吸系统? 消化系统? 泌

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1 中国生物工程杂志犆犺犻狀犪犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔 ~26 乳酸杆菌作为受体菌的研究及应用 郄翠仙 柴俊 2 张以芳 聂福平 云南农业大学动物科学技术学院昆明 云南农业大学食品科学技术学院昆明 摘要乳酸杆菌 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊 作为一种益生菌是大自然赋予人类的宝贵财富 它作为益生菌已有相当长的历史? 是一类广泛用于食品工业的革兰阳性杆菌 利用分子生物学技术可改造乳酸杆菌的性状 满足人类需要? 但相对于大肠杆菌 乳酸杆菌基因工程尚处于开发阶段? 最近 国内外学者开始把乳酸杆菌作为外源基因表达载体有目的? 有选择地研制新一代微生态制剂? 近 20 年中 研究者构建了多种乳酸杆菌载体 并表达了多种蛋白? 鉴于乳酸杆菌是人体的正常菌群 因此把乳酸杆菌作为载体来表达蛋白 将会是一个很具有诱惑力的研究方向? 就这方面的资料进行综述 介绍乳酸杆菌作为受体菌的研究新进展? 关键词乳酸杆菌载体受体菌中图分类号犙 89 乳酸杆菌质粒载体特点 乳酸杆菌是一类革兰阳性杆菌 微需氧或厌氧 发酵产生乳酸 最适生长狆犎值为 4~6? 目前已从哺乳动物粪便? 阴道分泌物? 奶酪? 酸菜等分离到 70 多种乳酸杆菌? 乳酸杆菌之所以能成为理想的表达载体主要是由于大部分乳酸杆菌都携带质粒 尤其是小质粒都是隐蔽性的 这些小型质粒多进行滚环复制 犚犆犚 其结构与革兰氏阳性菌的其它犚犆犚质粒结构相似 最小复制域在大小上也是类似的 这些质粒都有一个广泛的宿主范围的表型 可以在不同乳酸杆菌中复制 而且在不同的乳酸杆菌中拷贝数没有明显的变化 乳杆菌的质粒结构较稳定 在发酵过程中质粒能保持结构的完整 没有选择压力的情况 在不同的环境胁迫下可以进行不同的诱导表达 能够稳定地存在于宿主细胞内 这将有助于在乳杆菌中进行基因克隆 分离的稳定性等分子生物学.2 特点决定了乳酸杆菌能作为很多基因的载体? 除了以上的一些特点外 乳杆菌能成为理想的疫苗载体主要还要归功于乳酸杆菌与免疫应答之间的关系 犕犪狉狋犲犪狌犘. 犆等的许多实验证明用禽流感血凝素亚单位疫苗免疫动物前 反复给动物饲喂乳酸杆菌 结果免疫后动物体内的抗体滴度将会提高 5 倍 表明乳酸杆菌本身对免疫应答有重要的调节作用 这主要由于乳酸杆菌参与先天性免疫 体液免疫和细胞免疫的结果 乳杆菌参与先天性免疫能够较强地活化巨噬细胞 参与体液免疫产生犐犵犃? 犐犵犕和犐犵犌 犆狉狅狊狊犕犔等的实验表明犔犌犌对轮状病毒腹泻有很好的治疗作用 这主要还是因为它能刺激机体产生犐犵犃? 犐犵犕和犐犵犌 乳酸杆菌对免疫应答的调节还在于它参与细胞免疫产生的细胞收稿日期 修回日期 通讯作者 电子信箱 狔犪犺狅狅. 犮狅犿. 犮狀 因子 犕犪犪狊狊犲狀. 犆. 犅的实验表明鼠李糖杆菌 犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊 犎犖犗犗 能诱导产生犜犎 和犜犎 2 有 8 种乳酸杆菌已经证明对感染的动物体内细胞因子的产生具有重要的调节作用 罗伊氏乳杆菌 犔. 狉犲狌狋犲狉犻? 短乳杆菌 犔. 犫狉犲狏犻狊 还能诱导产生犜犖犉 α 和犐犔 2 有些乳杆菌还能强烈地诱导犐犔 6? 犐犔? 犐犔 2? 犜犖犉 α 干酪乳杆菌 犔. 犮犪狊犲犻 的产生 从而对免疫应答起到重要的调节作用 鉴于以上乳酸杆菌的特点 从 3.4 而使它成为一种理想的 应用前景比较广阔的受体菌? 2 乳酸杆菌作为食品级载体 乳酸杆菌发酵食品具有很悠久的历史 当今世界发展的潮流是营养保健食品 即不仅具有一般食品所具有的营养和色? 香? 味 而且还具有调节人体生理功能的食品? 从乳酸杆菌发酵食品的特点中可以看出 乳酸杆菌发酵食品属于营养保健品 发展乳酸杆菌作为食品的受体菌符合时代要求 因此 它具有强大的生命力和广阔的前景? 食品工业将是一次全新的革命 质粒狆犅犌 0 瑞士乳杆菌 携带有 狆犃犕犅 的犲狉狔基因启动子及编码犔. 犫狌犾犵犪狉犻 犮狌狊犅 半乳糖苷酶基因 将犅犪犮犻犾狌狊犻犮犺犲狀犻犳狅狉犿犻狊的 α 淀粉酶结构基因 536 犫狆 插入狆犅犌犐犗的红霉素抗性基因启动子区下游 即可在犔. 犺犲犾狏犲狋犻犮狌狊犛犅犜 295 中获得成功表达 它对于牛奶中以乳糖作为唯一能源的转化子的筛选将极有帮助? 质粒 狆犔犘 3537 狓狔犾携带有来自犔. 狆犲狀狋狅狊狌狊与木糖代谢有关的基因 经转化乳杆菌 可使其获得分解利用作为唯一能源的木糖的能力? 犗犽犪犳狅狉等将编码 8 赖氨酸的合成赖氨酸基因克隆至载体狆犅犔狌犲狊犮狉犻狆狋 以 犪犮为启动子 该合成的赖氨酸基因可成功地转化几种乳杆菌? 经转化后 8 赖氨酸分泌 5 量可提高 2.5~6 倍? 其次纤维素酶? 木聚糖酶? 葡聚糖 6 酶? 胆固醇氧化酶等也在乳酸杆菌中得到表达? 也可以用乳酸杆菌来研制儿童用增铁营养品 铁离子必须与转铁蛋白结合后才能为人体吸收 因此可在乳酸菌中分泌表达

2 2006 犞狅犾 26. 犛狌狆狆犾. 郄翠仙等 乳酸杆菌作为受体菌的研究及应用 23 转铁蛋白来使食品中增加铁的吸收性能? 3 乳杆菌与免疫疫苗载体 乳酸杆菌另一个在医学领域具有很大应用潜力的方向是将其作为某些免疫接种的疫苗载体? 乳酸杆菌作为疫苗载体具有较大的优越性 在呼吸系统? 消化系统? 泌尿系统定植 对维持微生态平衡很重要 2 在发酵食物中应用了几个世纪 被认为是犌犚犃犛 犵犲狀犲狉犪犾狔狉犲犮狅犵狀犻狕犲犱犪狊狊犪犳犲 微生物 3 同肠胃外免疫途径相比 通过黏膜免疫 可以诱发犐犵犃产生 4 免疫方便? 便宜? 安全 不需要注射 5 具有免疫佐剂作用 6 同其它活载体 如减毒大肠杆菌? 沙门氏菌? 病毒 相比 乳酸杆菌作载体无免疫原性 所以无病原性? 食物级或共生? 共栖性的乳酸杆菌作为疫苗载体受到广 7 泛关注? 对这一方面的探索在国外也开展了较多? 3 犺犆犌 β 避孕疫苗载体人绒毛膜促性腺激素 犺狌犿犪狀犮犺狅狉犻狅狀犻犮犵狅狀犪犱狅狋狉狅狆犻狀 犎犆犌 犎犆犌是由胎盘绒毛组织的合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素 其作用是维持并刺激妊娠黄体产生孕酮 促进蜕膜细胞发育成熟? 因此 犺犆犌可作为避孕疫苗的抗原靶? 由于犺犆犌犪亚单位与犺犔犎 犺犉犛犎 犺犜犛犎完全同源 现有的抗犺犆犌避孕疫苗均采用其 β 亚单位或更具特异性的犺犆犌 β 犆犜犘 羧基端 09~45 间的 37 肽 作为免 8 疫原? 王红梅等用犘犆犚从短小乳酸杆菌染色体中扩增得到 犛 层蛋白的信号肽序列 将其与犺犆犌 β 基因连接后克隆到乳酸杆菌整合型表达载体狆犐犾犪犮的犾犪犮启动子下游 得到质粒狆犐犾犪犮犺犆犌 β 电穿孔转化犔. 犮犪狊犲犻犆犈犆犜 5276? 在含红霉素培养基中培养 挑选转化后的耐药菌落 抽提其染色体 犇犖犃 犘犆犚及测序鉴定证实犺犆犌 β 基因整合到犔. 犮犪狊犲犻的基因组中 细菌产生的目的蛋白约有 3 4 分泌进入培养上清 而加入诱导剂乳糖 2 犺后 上清中的蛋白浓度达到峰值 为 440 犿犐犝 犿犾? 重组菌在无选择压力条件下培养 50 代后仍可分泌犺犆犌 β? 在获得稳定? 分泌性表达的犺犆犌 β 菌株后 接种于 8 周龄犅犃犔犅 犆雌性小鼠的阴道粘膜? 于免疫后 2 周取阴道洗液 放免法检测犺犆犌 β 水平 间接犈犔犐犛犃检测抗犺犆犌 β 犐犵犃抗体水平? 阴道洗液中的抗犺犆犌 β 犐犵犃抗体 犗犇值为 明显高于阴性对照组 犘 <0.0 而与 犇犖犃免疫组无显著性差异 犘 >0.05? 结论表明犺犆犌 β 在 犔. 犮犪狊犲犻犆犈犆犜 5276 中得到了稳定的分泌性表达? 重组犺犆犌 β 乳酸杆菌可在阴道粘膜局部定居 并通过粘膜免疫在局部刺激产生抗犺犆犌 β 犐犵犃抗体? 犺犆犌 β 疫苗是第一个进入临床试验的避孕疫苗? 其中印度犜犪犾狑犪狉构建的犺犆犌 β 犎犛犇疫苗已进入 Ⅱ 期临床试验? 然而 即使是 犺犆犌 β 犎犛犇疫苗 仅能使约 80 名受试妇女抗体水平达到避孕阈值? 因此 还需寻找更好的免疫方法及免疫途径来 8.9 提高? 3 2 病原菌的表达载体大部分乳酸杆菌都有很强的免疫刺激能力 目前很多的病原菌已在乳酸杆菌中获得了成功表达 也许在不久的 将来 儿童接种预防某些疾病的疫苗不是通过打针而是通过喝酸奶? 已获得表达的病原菌主要有 炭疽杆菌抗原破伤风毒素片段犆抗原 犜犜犉犆 在嗜酸乳杆菌中的表达 其重组菌通过鼻内途径免疫小鼠后均显示一定的免疫原性 能够诱导保护性的免疫应答产生系统免疫球蛋白 犐犵犌? 犐犵犌 犫? 犐犵犌 2 犪? 犐犵犃及检测到特异性犜细胞应答 犘犺犻犾犻狆狆犲 等用副干酪乳杆菌在细胞内已成功地表达了霍乱毒素犅亚单位 犆犜犅 化脓链球菌犕 6 犵狆 4 犈蛋白 犘犪狊犮犪犾犎狅犾狊 还有人在乳杆菌中成功表达了提取抗原狆狉狋犅 犜狋犿犻犿 蛋白酶破伤风毒素 此融合蛋白作为一个细胞表面蛋白既可诱 0. 发系统性免疫应答又可诱发局部黏膜免疫应答 美国科学家们将幽门螺杆菌 犎犘 尿素酶基因在乳酸杆菌中表达 已经申请了专利 他将尿素酶整合到乳酸杆菌中 把表达尿素酶用作抗原免疫动物 取得了理想的免疫效果 犗狊犮犪狉犌等将犎犘尿素酶犃和犅整合到减毒乳酸杆菌中 也已申请了专利 2? 抗布鲁士菌抗体 巴西米纳斯州联邦大学和法国全国农学研究所的科学家已经成功地将布鲁士病菌的一个基因植入乳酸杆菌的基因组? 初步实验显示 白鼠服用这种布鲁士病菌疫苗后 体内产生了大量抗体 四川用嗜酸乳酸菌 犣 97 株为载体 构建了可以经口接种的乙肝核酸疫苗 给正常小鼠经口接种 2 周后 该种核酸疫苗均出现抗 犎犅狊 至免疫后 2 周时 各组累积阳转率为 66 7% ~80% 3 抗 犎犆犞 犎犅犞的乳酸杆菌的重组活疫苗 将人工合成的具有良好犎犆犞免疫特异性的多表位抗原基因犘犆犡与犎犅犞狆狉犲 犛 基因连接成犛 犘犆犡基因 克隆于乳酸菌表达载体 狆犜犚犓犔 2 中 在乳酸杆菌犃犜犆犆 52 中获得表达 构建的重组嗜酸乳杆菌犃犜犆犆 52 狆犜犚犓犔 2 犛 犘犆犡 口服免疫小鼠后 于第 2 周可检测到低水平的抗 犌犣 犛 2 犐犵犌和抗 犌犣 犘犆犡犐犵犌 小鼠外周血犆犇 犜细胞出现增殖反应 传染性胃肠炎冠状病毒纤突糖蛋白 犜犌犈犞 的克隆 糖蛋白犛是犜犌犈犞的代表性抗原 目前犛糖蛋白已经在犔. 犮犪狊犲犻中成功克隆表达 主要是扩增编码犛糖蛋白的长为 2 3 犽犫狆的基因片段后 克隆到质粒狆犔犘 500 中 然后把重组质粒 狆犔犘 500 狉犜犌犈犞 犛经过电穿孔的方法导入犔犮犛 经犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋检测后 表明犛糖蛋白在犔. 犮犪狊犲犻中得到了表达 然后用重组的犔犮犛免疫犅犃犔犅 犮小鼠后就会诱导机体产生抵抗 犜犌犈犞的黏膜和系统的免疫反应 免疫 32 天后就会产生抗体犐犵犌? 犐犵犃 其抗体滴度分别为 狀犵 犿犾 血清 狀犵 犿犾 肠液 5? 3 3 人干扰素 α 2 犫基因表达的载体干扰素是细胞分泌的一类具有抗病毒 抗肿瘤及免疫调节功能的蛋白质家族 将人干扰素 α 2 犫基因克隆到乳酸杆菌表达载体狆犛犆 犃犈质粒 将其转化德氏乳酸杆菌 犇犕 8909 获得了分泌表达犺犐犉犖 α 2 犫的菌株 期望基因工程改造后的犇犕 8909 益生菌制剂不仅保持对细菌性阴道炎 滴虫炎的治疗作用 而且能预防和治疗阴道及外阴的病毒 6 感染? 3 4 降钙素基因的克隆降钙素 犆犪犾犮犻狋狅狀 5 狀 犆犜 是由 32 个氨基酸组成的多

3 24 中国生物工程杂志犆犺犻狀犪犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔犞狅犾 26. 犛狌狆狆犾.2006 肽 有调节钙磷代谢的作用 在临床上已被用于治疗各种类型的骨质疏松症? 在所有天然降钙素中 鲑? 鲤和鸡的生物学活性最高 而人降钙素和猪降钙素的活性最低 且在体内易于降解 因此 目前临床上以鲑降钙素的应用最为广泛? 首先将该基因连接到以犜犺狔犃基因为选择压力的非抗性表达载体狆犠 425 狋中 转化犜狔犃基因缺陷的大肠杆菌狓 5 犾? 用犛犪犮犐和犓狆狀犐双酶切法和犘犆犚法筛选出阳性重组质粒 然后采用电穿孔法将阳性重组质粒狆犠犆犜转化到犜犺狔犃 基因缺陷的乳酸杆菌中? 用犘犆犚法筛选阳性重组质粒 并进行序列测定? 结果表明 目的基因所编码的氨基酸序列与天然鲑降钙素的氨基酸序列完全一致? 从而得到了含降 7 钙素基因的重组乳酸杆菌? 3 5 犎犐犞疫苗载体美国研究人员最近提出可利用经基因工程技术改造过的乳杆菌研制阴道栓剂 这种栓剂可以成为杀灭或抑制 犎犐犞的? 化学避孕套? 从而协助妇女预防犎犐犞感染? 最近 美国研究人员对妇女阴道粘膜内的天然生物学屏障乳杆菌进行基因工程改造后移入阴道中 以抵抗犎犐犞的入侵? 犘犲狋犲狉犔犲犲认为在所有的女性容易发生犎犐犞感染的位置??? 阴道内都有一种能够抗击犎犐犞入侵的乳杆菌存在 它们能够分泌出具有抗菌? 抗病毒作用的化学物质乳酸和过氧化氢? 为查明是否可以将这种具有杀灭病毒作用的乳杆菌应用于临床 加州犗狊犲犾公司的分子生物学家犑狅犺狀犔犲狑犻犮犽犻与犔犲犲等选取女性阴道粘膜中天然存在的詹氏乳杆菌 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊犼犲狀狊犲狀犻 将编码犆犇 4 蛋白的基因插入到该菌中? 其机制主要是犆犇 4 是人体免疫细胞的一种膜蛋白 犎犐犞在感染人体细胞之前需要先附着到犆犇 4 上? 而经基因工程技术改造过的乳杆菌能分泌出犆犇 4 蛋白 从而抑制犎犐犞与体内的自身的犆犇 4 结合而感染人体细胞? 这一方法既避免了药物在杀灭病毒时对阴道粘膜的损害 又可使细菌更有效地发挥抗犎犐犞作用 在帮助妇女减少犎犐犞 感染方面颇具前景? 这项技术在体外实验中获得了成功 当与人类细胞培养物混合时 改造过的乳杆菌可将一种由实验室培养的犎犐犞 病毒株的感染力降低 95%? 犔犲狑犻犮犽犻 和犔犲犲目前正在尝试通过基因工程技术 使犆犇 4 可以在乳杆菌表面表达 从而提高这一技术的有效性? 他们表示 这样改造后的乳杆菌能结合犎犐犞 用其分泌的乳酸和过氧化氢杀死病毒? 研究小组希望最终能将改造过的乳杆菌浓缩 8 于阴道栓剂中 应用于临床? 3 6 鸡球虫病疫苗鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道上皮细胞引起的一种原虫病? 它广泛分布于世界各地 是目前危害养鸡业的重要疾病之一? 目前 鸡球虫病的防治方法主要还是通过化学药物和免疫预防 但这两种方法都存在缺陷性 抗球虫药物的广泛使用 使耐药性虫株相继出现 研制新药费用又很昂贵 免疫预防容易引起免疫鸡体重下降和免疫不整齐现象? 所以这给球虫病的防治带来了很大困难 人们迫切期望找到更好的防治球虫病的手段? 研究根据乳酸菌的生理功能和球虫的生物学特性 王 春风等利用乳酸菌非抗生素抗性载体表达系统狆犠 425 狋 将球虫犛 07 鸡球虫子孢子顶复合器折光体保护性抗原基因 表达大小为 22 4 犽犇犪的保护性蛋白 基因在从健康鸡肠道中筛选的犜犺狔犃 胸腺嘧啶核苷酸合成酶 基因缺陷型的嗜酸乳杆菌犔犪犛犾 07 中进行了表达 并将这种转球虫犛 07 基因的功能乳酸杆菌给刚出壳的雏鸡伺喂 再人工攻击球虫 来模拟球虫的? 带虫免疫? 状态? 通过对试验雏鸡的体重指标的检测 转球虫肋犛 07 基因工程乳酸菌能模拟球虫的? 带虫 9 免疫? 状态 达到无虫的带虫免疫目的? 4 其它方面的研究及应用 孙艺平等人进行了热芽孢杆菌犛犗犇基因的克隆 犛犗犇基因可在乳酸杆菌中表达 应用电穿孔将犛犗犇基因转入乳酸杆菌 获得犛犗犇基因的嗜酸乳杆菌 这样的乳酸杆菌具有抗氧化的作用 可应用于食品 化妆品等方面 广州医学院呼吸病研究所呼吸内科采用基因重组和生物工程技术 构建以乳酸杆菌为载体的新一代脱敏用尘螨疫苗 此外还可用于研制抗疟原虫? 吸血虫? 弓形虫等寄生虫疾病的疫苗 哮喘免疫治疗 研究开发重组犅犆犌生物制剂用于支气 20 管哮喘的治疗 犔狅狉犲狀狕狅等将山梨醇 6 磷酸钠犘 32 脱氢酶基因克隆到犔. 犮犪狊犲犻中在乳糖操纵子作用下表达 人工合成山梨醇 从而可以合成一些泌尿系统药物 如利尿药? 脱水药等 2 瑞典卡罗林斯卡 犓犪狉狅犾犻狀狊犽犪 研究所证明基因改造的乳酸杆菌可产生抗变形链球菌抗体 从而杀灭某些致龋菌 有助于预防龋齿 通过实验 研究人员给小鼠补充经过基因改造的乳酸杆菌 使其产生抗变形链球菌抗体 而正是人类口腔中的变形链球菌将糖类转化成为对牙釉质有腐蚀作用的乳酸 从而导致龋齿发生? 经过这种治疗的小鼠口腔中变形链球菌数量大幅度下降 其龋齿发生明显减少? 这种经过基因改造的乳酸杆菌可以在小鼠的口腔中持续存在 是一种可靠的预防和治疗龋齿的好方法? 此外咯德乳酸杆菌可作为疫苗携带者 咯德乳酸杆菌可从动物的肠道分离得到 它可分泌一种抗菌物质 咯德因 犆犺狌狀犵. 犈狋. 犃犾.989 本菌涂在肉品上 可抑制腐败菌的生长及降低挥发性氮的蓄积 而得以延长肉品的有效期 直接施用于肉制品 可有效抑制大肠杆菌及单核球增生性李斯特杆菌等病原菌 除此之外 本菌可治疗小孩病毒性肠胃炎 小孩急性下痢等 因此 若能开发咯德乳酸杆菌疫苗携带者 使其携带病原菌之部分缺损肠毒素基因或表面构造基因 由这些基因产物刺激肠道免疫防治 而达到保护动物免受该病原菌伤害的免疫效果? 犘狅狌狑犲犾狊等 996 成功地将含有感冒病毒抗原决定位 犪狀狋犻犵犲狀犻犮犱犲狋犲狉犿犻狀犪狀狋狊 的核酸片段转移到咯德乳酸杆菌 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊犮犪狊犲犻 内 并顺利观察 7 到被刺激的口黏膜免疫反应及保护作用? 5 存在的问题和发展前景 近年来 乳酸杆菌基因工程研究进展很快 而且取得了显著的经济效益和社会效益 但是要更好地开发乳酸杆菌

4 2006 犞狅犾 26. 犛狌狆狆犾. 郄翠仙等 乳酸杆菌作为受体菌的研究及应用 25 基因工程还存在一定的难度 这主要表现在 乳杆菌中大部分质粒尤其是小质粒均属隐蔽型的 对这种质粒的功能知之甚少 因此对开发乳酸杆菌质粒载体造成了一定困难 作为革兰氏阳性菌 乳酸杆菌基因工程的难点在于其胞膜难以裂解 一般情况下 裂解大肠杆菌只需 犛犇犛即可 葡萄球菌? 链球菌等革兰氏阳性菌则需用 5~0 犿犵 犿犾溶菌酶预处理 犺 而在一般培养条件下生长的乳酸杆菌需用犾 0 犿犵 犿犾溶菌酶处理更长时间才可引起细胞膜的破裂 这主要是由于它的细胞壁成分肽聚糖分子中有 75% 的亚单位纵横交错连接 而革兰氏阴性菌只有 30% 因此形成了紧密编织 质地坚硬和机械性很大的多层三维空间结构 很多实验说明了乳酸杆菌疫苗能够诱导全面的免疫应答 尤其是黏膜免疫 但是目前乳酸杆菌只能表达少数的抗原 而对于其它大多数抗原的表达还需要研究 目的基因在乳酸杆菌中的表达效率还有待提高 这可能由于乳酸杆菌在正常情况下以乳酸为其重要产物 外源蛋白的表达将与乳酸的产生形成多方面的竞争 故在常用的乳酸杆菌中 外源蛋白的表达受乳酸形成的影响 不能获得高表达 因此为提高目的基因的表达效率 选择合适的启动子及犛犇序列以提高转录水平 解决密码子的偏爱性 增强目的蛋白对胞内? 胞外蛋白酶的耐受性 防止胞内? 外蛋白酶对目的蛋白的降解 选择外泌蛋白酶较少的菌种 并使目的蛋白分泌出细胞 增加表达体系的稳定性 优化培养条件等都有待于解决 乳杆菌诱发免疫反应的机制还不清楚 乳杆菌作为载体制成的活疫苗侵染性不强 只能诱导机体产生极低水平的抗体 因此 在以后乳酸杆菌基因工程的研究中还有许多值 2 得改进的地方? 与其它细菌 如大肠杆菌 的基因工程相比 乳杆菌的基因工程还不成熟? 不完善尚处于开发阶段 还有很多问题有待解决 但是乳酸杆菌作为受体菌生产氨基酸? 酶? 抗体? 生理活性因子等 大大推动了畜牧业的发展 给人类展示了美好的发展前景 乳杆菌基因工程的发展还是具有深远意义的? 乳酸杆菌的菌株具有不同的佐剂特征 对免疫系统有不同的影响 能够把免疫佐剂和目的抗原传给犃犘犆狊的作用有效联合起来对免疫系统进行调节 许多研究表明 犔. 犮犪狊犲犻? 犔. 狆犾犪狀狋犪狉狌犿? 犔. 狉犲狌狋犲狉犻? 犔. 犼狅犺狀狊狅狀犻等菌株在此方面有可观的发展前景? 此外乳杆菌能从长期的抗原刺激和高抗原荷载两方面激活宿主黏膜表面的淋巴细胞 在宿主内定居 能够较好地刺激犜犎 和犜犎 2 反应 最主要的是它安全? 无毒 与其它外源蛋白的载体相比 大多数乳酸杆菌的表层都含有单一的? 晶状的蛋白结构覆盖在整个细胞的表面 这些结构可分泌蛋白 因此可作为分泌型表达载体 弥补了其它表达载体的缺点 基于乳杆菌自身的一些优点 决定了它将成为一种很具有吸引力的微生物工具 成为 3 新型的? 安全的? 发展前景广阔的疫苗? 参考文献 杨洁彬 郭兴华 凌代文. 乳酸菌生物学基础及应用. 第 4 版. 北京 中国轻工业出版社 ~36 2 易庆 王关林 方宏筠. 乳酸杆菌基因转化质粒载体系统及其基因工程研究进展 中国微生态学杂志 ~59 3 犑狅狊犉. 犕. 犔 犛犲犲犵犲狉狊. 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犻犪狊犾犻狏犲狏犪犮犮犻狀犲犱犲犾犻狏犲狉狔狏犲犮 狋狅狉狊 狆狉狅犵狉犲狊狊犪狀犱狆狉狅狊狆犲犮狋狊 犜犚犈犖犇犛犻狀犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔 ~54 4 犆狉狅狊狊. 犕. 犔犲狋犪犾. 犇犻犲狋狉狔犻狀狋犪犽犲狅犳犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊犺犪狀犿狅狊狌狊犎犖 00 犲狀犺犪狀犮犲狊狆狉狅犱狌犮狋犻狅狀狅犳犫狅狋犺犜犺 2 犮狔狋狅犽犻狀犲狊犻狀犪狀狋犻犵犲狀 狆狉犻犿犲犱犿犻犮犲. 犕犲犱犕犻犮狉狅犫犻狅犾犐犿犿狌狀狅犾 ~53 5 毕英佐 马现永 曹永长. 益生菌作为基因工程受体菌的研究. 科技视野? 饲料广角? ~0 6 犑 犚狌犲犻 犅犻犢狌犲狋犪犾. 犇犻狉犲犮狋犮犾狅狀犻狀犵狅犳犪狓狔犾犪狀犪狊犲犵犲狀犲犳狉狅犿狋犺犲犿犻狓犲犱犵犲狀狅犿犻犮犇犖犃狅犳狉狌犿犲狀犳狌狀犵犻犪狀犱犻狋狊犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀犻狀狋犲狊 狋犻狀犪犾犾犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊狉犲狌狋犲狉犻. 犉犈犕犛犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵狔犔犲狋犲狉狊 ~24 7 犕犲犱犻狀犪犈 犌狌狕犿犪狀犆犃. 犝狊犲狅犳犾犻狏犲犫犪犮狋犲狉犻犪犾狏犪犮犮犻狀犲狏犲犮狋狅狉狊犳狅狉犪狀狋犻犵犲狀犱犲犾犻狏犲狉狔 犘狅狋犲狀狋犻犪犾犪狀犱犾犻犿犻狋犪狋犻狅狀狊. 犞犪犮犮犻狀犲 ~580 8 王红梅 李大金 姜红 等. 犺犆犌 β 在乳酸杆菌中的分泌性表达. 生殖与避孕 ~35 9 犘狅狌狑犲犾犘犎 犲狋犪犾. 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犻犪狊狏犲犺犻犮犾犲狊犳狅狉狋犪狉犵犲狋犻狀犵犪狀狋犻 犵犲狀狊狋狅犿狌犮狅狊犪犾狋犻狊狊狌犲狊犫狔狊狌狉犳犪犮犲犲狓狆狅狊犻狋犻狅狀狅犳犳狅狉犲犻犵狀犪狀狋犻 犵犲狀狊. 犕犲狋犺狅犱狊犈狀狕狔犿狅犾 ~389 0 犌狉犪狀犵犲狋犲. 犆. 犲狋犪犾. 犕狌犮狅狊犪犾犻犿犿狌狀犲狉犲狊狆狅狀狊犲狊犪狀犱狆狉狅狋犲犮狋犻狅狀犪犵犪犻狀狊狋狋犲狋犪狀狌狊狋狅狓犻狀犪犳狋犲狉犻狀狋狉犪狀犪狊犪犾犻犿犿狌狀犻狕犪狋犻狅狀狑犻狋犺狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊狆犾犪狀狋犪狉狌犿 犐狀犳犲犮狋犐犿犿狌狀犲 ~553 犗犾犻狏犲犻狉犪. 犕. 犔. 犛. 犕狅狀犲犱犲狉狅. 犞 犕犻狔犪犼犻. 犈. 犖犲狋犪犾. 犈狓狆狉犲狊 狊犻狅 狀狅犳犛狋狉犲狆狋狅犮狅犮犮狌狊狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲犪狀狋犻犵犲狀狊犫狔犾犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊犮犪狊犲犻 犉犈犕犃犕犻犮狉狅犫犻狅犾犔犲狋 ~3 2 犔犲犲犕犎 犲狋犪犾. 犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犎犲犾犻犮狅犫犪犮狋犲狉狆狔犾狅狉犻狌狉犲犪狊犲狊狌犫 狌狀犻狋犃犪狀犱犅犵犲狀犲犻狀犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊犾犪犮狋犻狊犕犌 363 犪狀犱犻狋狊狌狊犲犪狊犪狏犪犮犮犻狀犲犱犲犾犻狏犲狉狔狊狔狊狋犲犿犪犵犪犻狀狊狋犎. 狆狔犾狅狉犻狀犳犲犮狋犻狅狀犻狀犿犻犮犲 ~ 犚犻犫犲犻狉狅犔犃 犲狋犪犾. 犘狉狅犱狌犮狋犻狅狀犪狀犱狋犪狉犵犲狋犻狀犵狅犳狋犺犲犅狉狌犮犲犾犪犪犫狅狉狌狊犪狀狋犻犵犲狀犔 7 犔 2 犻狀犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊犾犪犮狋犻狊. 犃犳犻狉狊狋狊狋犲狆狋狅狑犪狉犱狊犳狅狅犱 犵狉犪犱犲犾犻狏犲狏犪犮犮犻狀犲狊犪犵犪犻狀狊狋犫狉狌犮犲犾狅狊犻狊. 犃狆狆犾犈狀狏犻狉狅狀犕犻犮狉狅犫犻狅犾 ~96 4 许谆. 犎犆犞 犎犅犞复合抗原基因的克隆? 表达及免疫原性研究. 复旦大学硕士学位论文 犎狅犘犛 犓狑犪狀犵犑. 犔犲犲犢犓. 犐狀狋狉犪犵犪狊狋狉犻犮犪犱犿犻狀犻狊狋狉犪狋犻狅狀狅犳犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊犮犪狊犲犻犲狓狆狉犲狊狊犻狀犵狋狉犪狀狊犿犻狊狊犻犫犾犲犵犪狊狋狉狅犲狀狋狉犻狋犻狊犮狅狉狅狀犪狏犻狉狌狊狊狆犻犽犲犵犾狔犮狅狆狉狅狋犲犻狀犻狀犱狌犮犲犱狊狆犲犮犻犳犻犮犪狀狋犻犫狅犱狔狆狉狅 犱狌犮狋犻狅狀. 犞犪犮犮犻狀犲 ~342 6 陈辉 贾润清 康白 等. 人干扰素 α 2 犫基因在德氏乳酸杆菌的表达与鉴定. 中国微生态学杂志 ~22 7 何召庆 秦泽荣 徐摈蕊 等. 降钙素基因在乳酸杆菌中的克隆. 中国兽药杂志 ~22 8 犘犲狋犲狉犔犲犲. 预防犎犐犞感染? 活避孕套? 大有可为 国联医药 犺狋狆 狑狑狑. 犵犾犮犺狆犺犪狉犿犪犮狔. 犮狅犿 李秉鸿. 抗鸡球虫病疫苗研究的新进展. 广西畜牧兽医 ~54 20 钟南山. 广东省医学重点专科建设方案 犔狅狉犲狀狕狅犖犻狊狊犲狀 犌犪狊狆犪狉狆犲狉犲狕 犕犪狉狋犻狀犲狕 犕犪狉犻犪犑犢犲犫狉犪.

5 26 中国生物工程杂志犆犺犻狀犪犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔犞狅犾 26. 犛狌狆狆犾.2006 犛狅狉犫犻狋狅犾狊狔狀狋犺犲狊犻狊犫狔犪狀犲狀犵犻狀犲犲狉犲犱犔犫. 犮犪狊犲犻狊狋狉犪犻狀犲狓狆狉犲狊狊犻狀犵犪狊狅狉犫犻狋狅犾 6 狆犺狅狊狆犺犪狋犲犱犲犺狔犱狉狅犵犲狀犪狊犲犵犲狀犲狑犻狋犺犻狀狋犺犲犾犪犮狋狅狊犲 狅狆犲狉狅狀. 犉犈犕犛犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵狔 ~22 犜犺犲犚犲狊犲犪狉犮犺犪狀犱犃狆狆犾犻犮犪狋犻狅狀狅犳犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊犞犲犮狋狅狉 犙犐犈犆狌犻 狓犻犪狀 2 犆犎犃犐犼狌狀 犣犎犃犖犌犢犻 犳犪狀犵 犖犐犈犉狌 狆犻狀犵 犉犪犮狌犾狋狔狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔犢狌狀狀犪狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔 犓狌狀犿犻狀犵 犆犺犻狀犪 2 犉犪犮狌犾狋狔狅犳犉狅狅犱犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔犢狌狀狀犪狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔 犓狌狀犿犻狀犵 犆犺犻狀犪 犃犫狊狋狉犪犮狋犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊 犪狀犪狋狌狉犪犾狋狉犲犪狊狌狉犲 犺犪狊犫犲犲狀狌狊犲犱犪狊犪犽犻狀犱狅犳狆狉狅犫犻狅狋犻犮狊犳狅狉犪犾狅狀犵狋犻犿犲. 犕狅犾犲犮狌犾犪狉狋犲犮犺狀犻狇狌犲狊犪狉犲犫犲犻狀犵犲犿狆犾狅狔犲犱狋狅犿狅犱犻犳狔狋犺犻狊犌狉犪犿 狆狅狊犻狋犻狏犲犫犪犮狋犲狉犻狌犿犪狊狋狅犫犲狋犲狉狊犲狉狏犲犳狅狅犱犻狀犱狌狊狋狉狔 犫狌狋犮狅犿狆犪狉犲狑犻狋犺犈. 犮狅犻犾 狋犺犻狊狑狅狉犽犻狊犼狌狊狋犻狀犻狋犻犪犾. 犚犲犮犲狀狋犾狔 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊犺犪狊犫犲犲狀犱犲狏犲犾狅狆犲犱犪狊犪狏犲犮狋狅狉犳狅狉犲狓狅犵犲狀狅狌狊犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狋狅狆狉犲狆犪狉犲狀犲狑狆狉狅犫犻狅狋犻犮狊. 犚犲犮犲狀狋 20 狔犲犪狉狊 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊狏犲犮狋狅狉狊犺犪狏犲犫犲犲狀犮狅狀狊狋狉狌犮狋犲犱犪狀犱狊狌犮犮犲狊狊犳狌犾狔犻狀犱狌犮犲犱狋狅犲狓狆狉犲狊狊狆狉狅狋犲犻狀狊. 犃狊犪狀犻犿狆狅狉狋犪狀狋犮狅犿狆狅狀犲狀狋犻狀狀狅狉犿犪犾犿犻犮狉狅犫犻犪犾犳犾狅狉犪犻狀犺狌犿犪狀犫狅犱狔 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊狏犲犮狋狅狉狊犪狉犲狏犲狉狔狆狉狅犿犻狊犻狀犵. 犎犲狉犲 狀犲狑犪犱狏犪狀犮犲狊犻狀狋犺犻狊犪狊狆犲犮狋犪狉犲狆狉狅狏犻犱犲犱. 犓犲狔狑狅狉犱狊犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊犞犲犮狋狅狉犚犲犮犲狆狋狅狉

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156 控制算法 ( 即模糊逻辑或神经网络 ) 这两种方式来研 [1] 究泊车. 犑犪犿犻犾设计出一种泊车辅助器 可帮助驾驶员方便安全地泊车 但在实现泊车的全自动方面有待改进. 文献 [2-3] 分别基于模糊逻辑控制进行泊车系统研究 逻辑控制依赖于人的操作知识 因此 [4] 需要大量的泊车实验. 刘 上海理工大学学报 第 37 卷 第 2 期 犑. 犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犛犺犪狀犵犺犪犻犳狅狉犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔 犞狅犾.37 犖狅.2 2015 文章编号 :1007-6735(2015)02-0155-04 犇犗犐 :10.13255/ 犼. 犮狀犽犻. 犼狌狊狊狋.2015.02.011 基于模糊算法垂直泊车转向控制策略的研究 王友楠 方祖华 孙鍴 王康 徐宏兵 ( 上海师范大学信息与机电工程学院

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