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消鲍
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1 2016 年 5 月 Vol.34 No.5 May 2016 Chinese Journal of Chromatography 538 ~ 542 技术与应用 DOI: / SP.J 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法快速筛查血液中 10 种常见毒物石银涛, 王绘军, 郭璟琦, 丁静, 王俊伟 ( 重庆市公安局物证鉴定中心, 重庆 ) 摘要 : 建立了超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱 (UPLC Q TOF / MS) 快速筛查血液中 10 种毒物的检测方法用乙酸乙酯提取血液样品, 浓缩至近干后, 用甲醇溶解定容, 过 0 22 μm 滤膜后, 直接测定目标物经 ACQU ITY UPLC@ BEH C18 色谱柱 (100 mm 2 1 mm, 1 7 μm) 分离, 以甲醇和 0 1% (v / v) 甲酸水溶液为流动相, 梯度洗脱, 四极杆飞行时间串联质谱电喷雾正离子模式检测, 外标法定量结果表明 : 目标物在 10 0 ~ μg / L 范围内线性关系良好, 相关系数为 ~ , 检出限和定量限分别为 1 0 ~ 2 0 μg / L 和 4 0 ~ 8 0 μg / L 在和 μg / L 3 个添加水平下的平均回收率为 56 7% ~ 83 0%, 相对标准偏差为 3 6% ~8 9% 利用 Agi lent Mass Hunter PCDL Manager 软件建立常见毒物的数据库, 并应用于加标样品的筛查分析该方法能快速筛查出添加的 10 种常见毒物, 检出率达 100%, 且保留时间偏差均小于 0 1 min, 质量偏差均小于 1 mda, 同位素丰度匹配得分同位素间距得分和 MS 匹配得分均大于 90, MS / MS 图谱匹配得分均大于 70 该方法可用于法庭与临床毒物分析关键词 : 超高效液相色谱 ; 四极杆飞行时间质谱 ; 快速筛查 ; 毒物 ; 血液中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2016) Rapid screening of 10 drugs in blood using ultra performance liquid chromatography with high resolution quadrupole time of flight mass spectrometry SHI Yintao, WANG Huijun, GUO Jingqi, DING Jing, WANG Junwei (Institute of Forensic Science, Public Security Department of Chongqing, Chongqing , China) Abstract: A high throughput method was developed for rapid screening of 10 drugs in blood by ultra performance liquid chromatography with high resolution quadrupole time of flight mass spectrometry ( UPLC Q TOF / MS). The sample was extracted by ethyl acetate, the extraction solution was concentrated to near dryness, and dissolved with methanol. Then the sample was passed through a 0 22 μm membrane. The separation of the 10 target compounds was per formed on a Waters ACQUITY UPLC@ BEH C18 column (100 mm 2 1 mm, 1 7 μm) with gra dient elution using methanol and 0 1% (v / v) formic acid aqueous solution as mobile phases, and analyzed by UPLC Q TOF / MS under electrospray ionization ( ESI) mode with scanning range of m / z Rapid screening can be achieved using MS matching scores, deviation of retention time, measured mass, isotopic abundance matching scores, isotope spacing match scores and MS / MS matching scores. Good linearities were observed in the range of μg / L with the correlation coefficients from to The limits of detection and the limits of quantification were μg / L and μg / L, respectively. The spiked recov eries were 56 7% % with the relative standard deviations of 3 6% - 8 9%. The result screening database was built using Agilent Mass Hunter PCDL Manager software and then used 收稿日期 : 通讯联系人.Tel:(023 ) ,E mail:wjwry@ tom.com. 基金项目 : 重庆市公安局科技攻关计划项目 (G ). Foundation item: Key Science and Technology Program of Chongqing City Public Security Bureau ( No. G ).

2 第 5 期石银涛, 等 : 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法快速筛查血液中 10 种常见毒物 539 for the analysis of spiked samples. MS matching scores, isotopic abundance matching scores, isotope spacing matching scores (all > 90 points) and MS / MS matching scores ( > 70 points) were applied to identify the drugs. The results showed that all the spiked drugs could be cor rectly identified with low deviations of retention time ( < 0 1 min) and mass ( < 1 mda). The developed method is suitable for the screening and confirmation of the drugs in forensic and clinical analytical toxicology. Key words: ultra performance liquid chromatography ( UPLC); quadrupole time of flight mass spectrometry ( Q TOF / MS); rapid screening; drugs; blood 在法庭科学毒物分析领域中, 由于毒物的种类繁多性质特殊分析目的不明确分析方法多变, 很难做到针对性地对毒物进行检验, 因此开展常见毒物的快速筛查具有重要意义根据本鉴定中心对重庆地区近年来毒物检验结果的数据统计, 检测到的常见毒物有氧化乐果乐果敌敌畏呋喃丹安定舒乐安定阿普唑仑三唑仑氯丙嗪和异丙嗪等其中氧化乐果乐果敌敌畏呋喃丹属于农药类毒物, 具有不溶或难溶于水易溶或可溶于二氯甲烷乙酸乙酯等有机溶剂的性质, 毒性较大, 给人畜的生命安全带来隐患 ; 安定舒乐安定阿普唑仑三唑仑氯丙嗪和异丙嗪属于安眠镇静类毒物, 具有极性小呈碱性不溶于水可溶于二氯甲烷乙酸乙酯等有机溶剂的性质, 有催眠镇静作用, 起效快口服量安全范围大 [1,2], 常被不法分子用于投毒麻醉抢劫及迷奸等违法犯罪行为植物性动物性和保健性食品中农药残留和镇静药物的检测方法有很多 [3-9], 生物检材中常见毒 [10-21] 物的检测方法也有不少, 但均是对某一种或某一类毒物的定性定量分析血液中常见毒物的结构和化学性质差异较大, 根据每类毒物的化学性质选择不同的前处理和仪器分析方法进行检验, 需要耗费大量的检材 ( 具有一次性和有限性的特点 ) 时间人力和物力, 给日常检验带来不小困难以四极杆飞行时间质谱 ( Q TOF / MS) 为代表的高分辨质谱技术具有质量范围广分辨率高分析速度快和数据库检索方便等特点, 在复杂基质的目标物检测方面具有良好的应用前景 [22-25] 本文将液液提取技术和 UPLC Q TOF / MS 相结合, 通过 Q TOF / MS 母离子的精确质量数保留时间同位素丰度同位素间距二级碎片离子的精 [23] 确质量数等对血液中氧化乐果乐果敌敌畏呋喃丹安定舒乐安定阿普唑仑三唑仑氯丙嗪和异丙嗪 10 种常见毒物进行快速筛查和确认该筛查方法不仅保证了结果的准确性和稳定性, 还兼顾了方法的实用性和易操作性, 为重庆地区常见毒物的检验工作提供参考 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 Agilent 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱仪, 配有 Dual Agilent Jet Stream Elec trospray Ionization( ESI) 源 ( 美国 Agilent 公司 ); ML104 电子天平 ( 瑞士 Mettler Toledo 公司 ); Allegra X 22R Centrifuge 型冷冻离心机 ( 美国 Beckman Coulter 公司 ) Direct Q3 型纯水机 ( 美国 Millipore 公司 ); KQ3200E 超声波清洗器 ( 中国昆山超声仪器有限公司 ) 甲醇乙腈二氯甲烷乙酸乙酯和乙醚均为色谱纯 ( 美国 TEDIA 公司 ); 甲酸为色谱纯 ( 美国 ACS 公司 ) 实验用血液样品由重庆市血液中心提供氧化乐果乐果敌敌畏呋喃丹安定舒乐安定阿普唑仑三唑仑氯丙嗪和异丙嗪标准品均购自美国 Sigma 公司, 纯度均 98 0% 准确称取各标准品 10 0 mg, 分别置于 10 ml 棕色容量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度, 于 -18 下避光保存, 使用时根据需要用甲醇稀释配制成不同质量浓度的单标准溶液和混合标准溶液 1.2 样品前处理取 1 0 ml 血液于 15 ml 具塞离心管中, 加入 5 ml 乙酸乙酯, 涡旋混匀后, 超声 5 min, 以 r / min 离心 5 min, 取上清液至 15 ml 具塞离心管 ; 用饱和 Na 2 CO 3 溶液溶解残渣并调节 ph 至 10, 加入 5 ml 乙酸乙酯, 涡旋混匀后, 超声 5 min, 以 r / min 离心 5 min, 取上清液至 15 ml 具塞离心管中 ; 合并上述中性和碱性提取液, 用氮气吹至近干 ; 用甲醇定容至 0 5 ml, 过 0 22 μm 有机滤膜, 滤液供 UPLC Q TOF / MS 分析 1.3 液相色谱条件 Waters ACQUITY BEH C18 色谱柱 (100 mm 2 1 mm, 1 7 μm); 柱温 :35 ; 进样量 :

3 540 色谱第 34 卷 2 μl 流动相 :A 为甲醇,B 为 0 1% ( v / v) 甲酸水溶液 ; 梯度洗脱程序 :0 ~ 1 0 min, 90% B ~ 80% B; 1 0~7 0 min, 80% B ~ 10% B; 7 0 ~ 9 0 min, 10% B; 9 0 ~ 9 1 min, 10% B ~ 90% B; 9 1 ~ 12 0 min, 90% B; 流速 :0 4 ml / min 1.4 Q TOF / MS 条件文献 [23] Q TOF / MS 条件数据采集和数据处理见参考 2 结果与讨论 2.1 UPLC Q TOF / MS 条件的选择在 UPLC Q TOF / MS 分离中, 流动相的组成和添加剂的种类直接影响目标物的峰形保留时间和响应强度本研究考察了 0 1% (v / v) 甲酸水溶液甲醇水甲醇 0 1% (v / v) 甲酸水溶液乙腈水乙腈对分离含有 μg / L 氧化乐果乐果敌敌畏呋喃丹安定舒乐安定阿普唑仑三唑仑氯丙嗪异丙嗪的混合标准溶液的影响结果表明 : 当用乙腈和甲醇作为流动相中的有机相时, 乙腈的洗脱能力更强, 目标物出峰时间较早, 易受杂质干扰, 分离效果不如甲醇好当水作为流动相的水相时, 各化合物峰形和重现性均较差, 响应强度较弱 ; 当使用 0 1% (v / v) 甲酸水溶液时, 各化合物峰形对称, 重现性好, 响应强度明显增加因此本实验选择 0 1% (v / v) 甲酸水溶液甲醇作为流动相通过优化实验, 改变不同时间段流动相中有机相和水相 ( 含 0 1% (v / v) 甲酸 ) 的比例, 确定了最佳梯度洗脱条件,10 种目标物混合标准溶液 (100 0 μg / L) 的色谱图如图 1 所示图 1 10 种目标物混合标准溶液 (100 0 μg / L) 的色谱图 Fig. 1 Chromatogram of a mixed standard solution of the 10 analytes (100 μg / L) 1. dichlorvos; 2. omethoate; 3. dimethoate; 4. carbofuran; 5. promethazine; 6. diazepam; 7. chlorpromazine; 8. estazolam; 9. alprazolam; 10. triazolam. 2.2 样品前处理条件的优化提取溶剂的选择本实验考察了二氯甲烷乙酸乙酯乙醚作为提取溶剂时,10 种常见毒物的回收率 ( 见表 1) 取血样 1 0 ml, 加入 0 1 ml 1 mg / L 的混合标准溶液, 分成 3 组, 每组 6 份, 分别加入 5 ml 二氯甲烷乙酸乙酯乙醚, 按 1 2 节处理后,UPLC Q TOF / MS 分析结果表明 : 当乙酸乙酯和二氯甲烷为提取溶剂时, 目标物的提取回收率均较高且重现性好, 明显优于乙醚作为提取溶剂时的回收率, 但考虑到二氯甲烷挥发性强毒性较大对人体危害大, 故本实验最终选择乙酸乙酯作为提取溶剂表 1 不同提取溶剂提取加标血液中 10 种目标物的平均回收率和相对标准偏差 (n = 6) Table 1 Average recoveries and RSDs of the 10 analytes spiked in blank blood by different extraction solvents (n = 6) Dichloromethane Recovery / % RSD / % Ethyl acetate Diethyl ether Dichlorvos Omethoate Dimethoate Carbofuran Promethazine Diazepam Chlorpromazine Estazolam Alprazolam Triazolam 超声时间的选择取血液 1 0 ml, 加入 0 1 ml 1 mg / L 的混合标准溶液, 考察超声时间为 min 时,10 种目标物的回收率 ( 见表 2) 结果表明 : 超声时间为 2 min 表 2 不同超声提取时间下加标血液中 10 种目标物的平均回收率和相对标准偏差 (n = 6) Table 2 Average recoveries of the 10 analytes spiked in blank blood by different ultrasonic extraction (UE) time (n = 6) 2 min 5 min 10 min Dichlorvos Omethoate Dimethoate Carbofuran Promethazine Diazepam Chlorpromazine Estazolam Alprazolam Triazolam

4 第 5 期石银涛, 等 : 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法快速筛查血液中 10 种常见毒物 541 时, 提取回收率偏低 ; 超声时间为 5 min 和 10 min 时, 提取回收率均较高, 且差异不大, 因此本实验将超声时间设为 5 min 2.3 方法评价线性关系检出限和定量限分别配制质量浓度为 μg / L 的系列混合标准溶液, 以峰面积为纵坐标 (Y) 10 种常见毒物的质量浓度为横坐标 (X, μg / L) 作校正曲线在 10 0 ~ μg / L 质量浓度范围内,10 种常见毒物的线性关系良好 ( r> ); 本实验测得 10 种常见毒物的检出限 (LOD, S / N = 3) 和定量限 (LOQ, S / N = 10) 分别为 1 0 ~ 2 0 μg / L 和 4 0 ~ 8 0 μg / L( 见表 3) 乐果 [7] 氧化乐果和呋喃丹的定量限比文献报道值低分别取质量浓度为 μg / L 的 10 种常见毒物的混合标准溶液各 6 份, 按 1.2 节处理, 用 UPLC Q TOF / MS 分析 1 天内用相同方法分析 6 次, 测得日内精密度为 3 5% ~ 5 6%; 连续测定 3 天, 测得日间精密度为 4 3% ~ 8 4% 说明该混合标准溶液在选定时间内稳定性良好表 3 10 种目标物的回归方程相关系数 (r) 检出限和定量限 Table 3 Regression equations, correlation coefficients (r), limits of detection ( LODs) and limits of quantification ( LOQs) of the 10 analytes Regression equation r LOD / (μg / L) LOQ / (μg / L) Dichlorvos Y = 1820X Omethoate Y = 19467X Dimethoate Y = 13431X Carbofuran Y = 17150X Promethazine Y = 3646X Diazepam Y = 11078X Chlorpromazine Y = 23325X Estazolam Y = 4600X Alprazolam Y = 13936X Triazolam Y = 4611X Y: peak area; X: mass concentration, μg / L; linear range: μg / L 回收率和精密度取空白血样 1 0 ml, 分别加入质量浓度为 μg / L 的混合标准溶液各 6 份, 按 1 2 节处理 10 种常见毒物的平均回收率为 56 7% ~ 83 0%, 相对标准偏差为 3 6% ~ 8 9%( 见表 4) 表 4 不同加标水平下 10 种目标物在血液中的平均回收率和相对标准偏差 (n = 6) Table 4 Average recoveries and RSDs of the 10 analytes spiked in blood with different levels (n = 6) 20.0 μg / L 50.0 μg / L μg / L Dichlorvos Omethoate Dimethoate Carbofuran Promethazine Diazepam Chlorpromazine Estazolam Alprazolam Triazolam 数据库的建立及筛查利用 Agilent Mass Hunter PCDL Manager 软件建立目标物数据库该数据库包括目标物的名称分子式保留时间精确质量数不同碰撞能量下的二级质谱图通过实际测定样品的碎片离子信息的谱图与建立的目标物数据库中碎片离子信息进行比对给出镜像对比结果, 从而实现对目标物的定性确认 [23] 利用建立的数据库对血液样品添加标准品进行检验, 结合样品采集的精确质量数保留时间同位素丰度同位素间距以及不同碰撞能量下的碎片离子信息等信息, 通过软件进行自动检索对加标样品进行快速筛查和确认 [23] 在设定的筛查条件下, 添加的目标物能全部被检测出 ( 见表 5) 保留时间偏差均小于 0 1 min, 质量偏差小于 1 mda, MS 匹配得分同位素丰度匹配得分和同位素间距得分均大 Table 5 表 5 利用 Agilent Mass Hunter PCDL Manager 软件对加标血液中 10 种目标物的筛查结果 Screening results of the ten analytes spiked in blood using Agilent Mass Hunter PCDL Manager software MS matching Theoretical Measured score mass / Da mass / Da Deviation of mass / mda Deviation of Isotopic abundance retention time / min matching score Isotope space matching score MS / MS matching score Dichlorvos Omethoate Dimethoate Carbofuran Promethazine Diazepam Chlorpromazine Estazolam Alprazolam Triazolam

5 542 色谱第 34 卷于 90; 10 种常见毒物的 MS / MS 匹配得分均大于 70, 达到 70 分的确认标准 [26] 舒乐安定的镜像对比图如图 2 所示, 血液加标样品中测得的谱图和标准谱图匹配度较高, 进一步确认了舒乐安定的存在图 2 血液加标样品中舒乐安定的碎片离子镜像信息对比图 Fig. 2 Comparison of the spectral difference of estazolam spiked in blood 2.4 实际样品分析利用该研究建立的目标物数据库及快速筛查方法对近期发生的一起毒化案件样品进行了测定案例如下 : 某区居民张某, 男,32 岁,2015 年 10 月在宾馆被麻醉抢劫取受害人血液, 按本文的研究方法进行检验, 检出舒乐安定, 质量浓度为 μg / L 该结论为案件性质的确定和侦破提供了依据 3 结论本文建立了同时测定血液中氧化乐果乐果敌敌畏呋喃丹安定舒乐安定阿普唑仑三唑仑氯丙嗪和异丙嗪的 UPLC Q TOF / MS 分析方法该方法具有快速准确分析通量大等优点, 经方法学验证, 能满足常见毒物的日常检测要求, 对司法鉴定临床诊断和治疗提供可靠的检验依据参考文献 : [1] Zhang X W. China Criminal Science and Technology: Drug and Poison Test. Beijing: Chinese People s Public Security University Press, 2003 张新威. 中国刑事科学技术大全 : 毒品和毒物检验. 北京 : 中国人民公安大学出版社, 2003 [2] Liao L C, Wang Y J. Forensic Toxicology Analysis. Beijing: People s Medical Press, 2009 廖林川, 王玉瑾. 法医毒物分析. 北京 : 人民卫生出版社, 2009 [3] Feo M L, Eljarrat E, Barceló D. J Chromatogr A, 2010, 1217: 2248 [4] Ding Y P, You J, Lydy M J. Bull Environ Contam Toxicol, 2009, 83(3): 388 [5] Gerardo M D, Patricia P B, Roberto R G, et al. Talanta, 2014, 118: 277 [6] Giroud B, Vauchez A, Vulliet E, et al. J Chromatogr A, 2013, 1316: 53 [7] Yu L, Song W, Lü Y N, et al. Chinese Journal of Chroma tography, 2015, 33(6): 597 余璐, 宋伟, 吕亚宁, 等. 色谱, 2015, 33(6): 597 [8] Moreno González D, Huertas Pérez J F, García Campaña A M, et al. Talanta, 2014, 128: 299 [9] Moreno González D, Huertas Pérez J F, García Campaña A M, et al. Talanta, 2015, 139: 174 [10] Es haghi Z, Nezhadali A, Bahar S, et al. J Chromatogr B, 2015, 980: 55 [11] Mazzarino M, Cesarei L, de la Torre X, et al. J Pharm Biomed Anal, 2016, 117: 47 [12] Fernández P, González C, Pena M T, et al. Anal Chim Acta, 2013, 767: 88 [13] Sauve E N, Langødegard M, Ekeberg D, et al. J Chroma togr B, 2012, 883 / 884: 177 [14] Marchi I, Schappler J, Veuthey J L, et al. J Chromatogr B, 2009, 877(23): 2275 [15] Wang R, Wang X, Liang C, et al. Forensic Sci Int, 2013, 233(1 / 2 / 3): 304 [16] Wang X, Wang R, Zhang Y R, et al. J Chromatogr A, 2012, 1268: 29 [17] Tian Y, Zhang J J, Lin H, et al. J Pharm Biomed Anal, 2008, 47(4 / 5): 899 [18] Kalogria E, Pistos C, Panderi I. J Chromatogr B, 2013, 942 / 943: 158 [19] Vosough M, Iravani N J. Talanta, 2016, 148: 454 [20] Xiang P, Sun Q R, Shen B H, et al. Forensic Sci Int, 2011, 204(1 / 2 / 3): 19 [21] Mostafa A, Medley G, Roberts D M, et al. J Chromatogr B, 2011, 879: 2234 [22] Broecker S, Herre S, Wüst B, et al. Anal Bioanal Chem, 2011, 400(1): 101 [23] Shi Y T, Guo J Q, Wang H J, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(7): 687 石银涛, 郭璟琦, 王绘军, 等. 色谱, 2014, 32(7): 687 [24] Shi Y T, Feng B L, Wang H J, et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2015, 35(4): 605 石银涛, 冯柏霖, 王绘军, 等. 药物分析杂志, 2015, 35(4): 605 [25] Wilkins C L. Trend Anal Chem, 2007, 26(1): 65 [26] Zhao Z Y, Shi Z H, Kang J, et al. Chinese Journal of Chro matography, 2013, 31(4): 372 赵志远, 石志红, 康健, 等. 色谱, 2013, 31(4): 372

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.