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1 基因转录蛋白代谢金开瑞带您玩转多组学武汉金开瑞生物工程有限公司 WUHAN GENECREATE BIOLOGICAL ENGINEERING CO., LTD. 地址武汉东湖新技术开发区高新大道666号生物城创新园B4栋二楼邮编客户服务热线南区销售热线北区销售热线技术支持专线邮箱网址您的蛋白研究合作伙伴

关于多基因组研究包括两方面的内容以全基因组测序为目标的结构基因组学 structural 基因 genomics 和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学 functional genomics) 又被称为后基因组 postgenome 研究是系统生物学的重要方法在医学领域基因组学能为一些疾病提供新的诊断治疗方法有助于医生获得更多的治疗信息并进行个性化医疗在食品农业

2 关于多基因组研究包括两方面的内容以全基因组测序为目标的结构基因组学 structural 基因 genomics 和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学 functional genomics) 又被称为后基因组 postgenome 研究是系统生物学的重要方法在医学领域基因组学能为一些疾病提供新的诊断治疗方法有助于医生获得更多的治疗信息并进行个性化医疗在食品农业环境等研究领域基因组学的应用也十分广泛基因组学的主要工具和方法包括生物信息学遗传分析基因表达测量和基因功能鉴定金开瑞提供基因组学测序服务包括 16S 18S ITS等扩增子测序全基因组测序外显子组测序单细胞基因组测序对于发病原因复杂的疾病通常很难用单一的理论模式进行表述系统生物学研究的引进为其发病机制的研究提供了新思路系统生物学是通过整合生物系统中诸多相互联系和作用的组分来研究复杂生物过程的机制即研究生物系统中所有组成 16S 18S ITS等扩增子测序成分基因 RNA 蛋白质和代谢产物等的构成以及在特定条件下这些组分间的相互作用和关系并分析生物系统在某种或某些因素干预扰动下在一定时间内的动力学过程及其规律高通量的组学 Omics 技术为系统生物学提供了海量的实验数据和先进的技术方法扩增子测序是对特定长度的PCR产物或捕获的片段进行测序分析序列中的变异 16S/18S/ITS等扩增子测序即通过提取环境样品的DNA 选择合适的通用引物扩增16S/18S/ITS的目标区域通过检测目标区域的序列变异和丰度以研究环境微生物多样性及群落组成差异金开瑞提供基因组学转录组学蛋白质组学及代谢组学实验及数据分析服务提供多组学联合分析技术优势生物信息学分析 1 通量高适用于大量样本的特定基因组区域研究扩增子原始序列 2 周期短可缩短研究周期加速临床应用及文章发表基因组学转录组学 1 16S 18S ITS等扩增子测序 2. 外显子组测序 3. 单细胞测序 4. Hi-C技术 3 信息度高针对感兴趣的基因组区域进行遗传变异位点优化序列的寻找可对特定区域进行深入研究 Alpha多样性分析 1. mrna测序 2. lncrna测序 3. small RNA测序 4. cirrna测序样品准备稀释性曲线 PCA 物种分类数 DNA提取与检测各样品多样性指数 PCoA 各层级物种丰度热图物种丰度曲线 NMDS RDA/CCA分析样品聚类 Metastasts分析 PCR扩增产物纯化蛋白组学 Beta多样性分析物种注释和统计分析实验路线 1. 单一蛋白鉴定 2. 发现蛋白质组学 3. 比较蛋白质组学 4. 修饰蛋白质组学 5. 靶向蛋白质组学文库制备与库检 Hiseq上机测序环境微生物肠道微生物发酵微生物菌群研究等代谢组学 1.非靶标代谢组学 2.靶标代谢组学常见环境样本样品量土壤淤泥沉积物 3 g 建议使用5 ml EP 管进行装载粪便 500 mg 详情咨询水样过滤后的滤膜拭子 2 个组织样本 DNA/PCR产物最适滤膜直径3-4 cm 孔径大小一般选择0.22 um或者0.45 um 肠道组织等 1 g 详情咨询 DNA 浓度 5 ng/ul 150 ng DNA要有明显主带无降解无RNA 蛋白质等杂质污染 PCR产物浓度 20 ng/ul 400 ng 片段大小 450 bp 条带单一无降解无引物二聚体 02

3 单细胞测序外显子组测序外显子组测序 Whole Exome Sequencing WES 是利用探针杂交富集外显子区域的DNA序列通过高通量测序发现与蛋白质功能变异相关遗传突变的技术手段相比于全基因组测序外显子组测序更高深度更经济高效单细胞测序通过对单个细胞进行基因组或转录组测序解决了用组织样本无法获得不同单个细胞的异质性信息样本量太少无法进行常规测序的难题为科学家研究解析单个细胞的行为机制与机体的关系等提供了新方向为早期检测诊断疾病及疾病的个体化治疗提供指导技术优势实验路线 1 直接对蛋白编码序列进行测序找出影响蛋白结构的变异 2 高深度测序可发现常见变异低频变异及罕见变异 3 外显子区段大小约为全基因组的1 有效降低费用及周期材料选取 DNA样品单细胞或0.5pg-1ng 基因组DNA 文库组建 bp 生物信息学分析 PE150测序实验路线 DNA样品 0.6ug 材料选取文库构建 bp PE150测序生物信息学分析生物信息学分析单细胞裂解生物信息学分析原始测序数据参考基因组 DNA水平 RNA水平 MALBAC扩增 SMART扩增过滤去接头和污染序列文库构建上机测序 Clean reads 数据过滤质控单碱基深度分析及覆盖度分析和均一性统计 Mapping 参考序列比对 SNP检测汲取在基因组的分布单一Mapping到基因组上序列 Single cell genome/exome Single cell mrna Single cell lincrna DNA分析 mrna分析 lincrna分析整体质量评估变异注释易感基因筛查肿瘤驱动突变预测整体质量评估 TSS和TTS位点统计可变剪切分析差异表达分析整体质量评估 lincrna拼接与筛选 lincrna保守性分析 Cis/Trans作用分析生物信息学分析小片段InDel检测及其在基因组的分布外显子区域参考已有数据库注释SNP/InDel 识别和研究与疾病相关的编码区的基因组变异排除无害突变及解释变异信息之间的关联和致病机理样品量 DNA 提取自新鲜及冻存样本 0.6 ug DNA 提取自FFPE样本 1 ug 疾病早期诊断检测疾病癌症发生机制 a. DNA水平单个细胞单染色体少量细胞等稀有样本或0.5 pg的基因组dna b. RNA水平单个细胞微量细胞几个到几千个和微量Total RNA 10pg-10ng 中含polyA尾的RNA 03 04

Hi-C技术辅助基因组组装 Hi-C (High-through chromosome conformation capture) 是以整个细胞核为研究对象利用高通量测序技术结合生物信息分析方法 300bp文库构建研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系获得高分辨率的染色质调控元件相互作用图谱 Hi-C可以与RNA-Seq

技术流程基因组框架图进行酶切如 Hind III等限制性内切酶使交联两侧产生粘性末端用甲醛对细胞进行固定使 DNA与蛋白蛋白与蛋白之间进行交联末端修复引入生物素标记连接解交联使 DNA和蛋白蛋白和蛋白分开提取 DNA 打断捕获带有生物素标记片段进行建库染色体水平组装精细基因组图谱测序泛基因组测序关键基因定位克隆相关表型分析

4 Hi-C技术辅助基因组组装 Hi-C (High-through chromosome conformation capture) 是以整个细胞核为研究对象利用高通量测序技术结合生物信息分析方法 300bp文库构建研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系获得高分辨率的染色质调控元件相互作用图谱 Hi-C可以与RNA-Seq ChIP-Seq等数 600bp文库构建二代建库测序 Hi-C 据进行联合分析从基因调控网络和表观遗传网络来阐述生物体性状形成 Mate-pair文库构建的相关机制技术优势图1 染色体三维结构图三代代建库测序 1 无需专门构建群体单个样本实现辅助基因组组装大片段文库构建聚类/排序/定向 2 精确率高人类基因组锚定染色体精确率为98% 排序和定向 3 周期短性价比高技术流程基因组框架图进行酶切如 Hind III等限制性内切酶使交联两侧产生粘性末端用甲醛对细胞进行固定使 DNA与蛋白蛋白与蛋白之间进行交联末端修复引入生物素标记连接解交联使 DNA和蛋白蛋白和蛋白分开提取 DNA 打断捕获带有生物素标记片段进行建库染色体水平组装精细基因组图谱测序泛基因组测序关键基因定位克隆相关表型分析样品关键性状GWAS分析图2 Hi-C实验流程生物信息学分析 Hi-C文库 Hi-seq 2500测序 Hi-C 染色体跨度的单倍型图谱构建探索基因组的 3D结构开发调控基因的 DNA元件 Hi-C辅助基因组组装为疾病风险预测提供思路为肿瘤形成机制提供依据为农业动植物经济性状连锁标记及基因组进化奠定基础有助于了解基因组折叠对基因表达的影响有助于了解基因组三维结构对细胞发育分化及细胞命运的决定揭示基因组远程调控元件介导的分子网络通过分析调控元件空间互作热点开发潜在的药物作用靶点辅助动植物基因组组装宏基因组组装及菌群精确分类数据质控重测序多组学分析参考基因组比对与基因组草图比对转录组 a 细胞交联细胞量满足一个标准Hi-C文库建议培养5 10 7至保证实验可重复性有效reads的互作分析聚类/排序/定向 b 组织DNA 提供组织DNA量为15-20 ug c 运输方式足量干冰运输互作图谱构建 TAD分析 05 三维重构具有染色体信息的基因组调控元件的开发 06

5 转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的所有RNA的总和是研究细胞表型转录和功能的一个重要手段与基因组不同的是转录组的定义中包含了时间和空间的限定同一 lncrna测序分析细胞在不同的生长时期及生长环境下其基因表达情况是不完全相同的转录组测序是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序全面快速地获取某一物种特长链非编码RNA long noncoding RNA, lncrna 是一类长度超过200 nt 的长链非编码RNA 通过与DNA RNA 定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本相对于传统芯片而言转录组测序无需预先设或蛋白质结合在表观遗传转录及转录后等水平调控基因表达测序采用Illumina HiSeq 平台进行测序针对有参考基计探针即可对任意物种的任意细胞类型的转录组进行检测能够提供更精确的数字化信号因组样本开展准确的lncRNA 鉴定和lncRNA靶基因预测同时提供针对测序数据中mRNA 的分析结果更全面广泛应更高的检测通量以及更广泛的检测范围是目前深入研究转录组复杂性的强大工具用于医学农学研究领域全转录组测序转录本构建在有参考基因组的情况下能够快速获得基因表达谱可以对转录本的序列及结构信息进行精确分析对检测低丰度转录本和发现新转录本具有独特的优势 mrna与lncrna联合分析 lncrna鉴定结构水平比较分析 lncrna表达量分析 lncrna保守性分析在无参考基因组的情况下能够快速获取该物种的mRNA序列并预测可能的非编码RNA 提供全面的转录组信息材料选取 Illumina 平台测序特异性文库构建核苷酸提取生物信息学分析共表达网络分析生物信息学分析差异表达lncRNA分析无参考基因组的转录组分析原始测序数据原始测序数据测序数据质量评估测序数据质量评估差异表达lncRNA靶基因鉴定靶基因功能注释 SSR分析参考序列比对分析转录本拼接新转录本预测基因功能注释参考序列比对分析 RNA-seq相关性分析可变剪切分析 CDS预测基因表达水平分析基因差异表达分析 SNP和Indel分析基因表达水平分析 KEGG富集分析蛋白互作网络分析转录因子分子 SNP和Indel分析靶基因富集分析 GO KEGG富集分析靶基因蛋白互作网络分析 RNA-seq 整体质量评估基因差异表达分析 GO富集分析差异表达lncRNA筛选差异表达lncRNA聚类分析表达调控网络分析有参考基因组的转录组分析 GO富集分析特异表达筛选表达水平比较分析表观遗传基因功能研究 lncrna 功能研究基因调控研究 cerna 网络样品量 total RNA 2.0 ug 100 ng/ul KEGG富集分析疾病诊断表达差异的研究寻找可能致病基因或疾病相关基因基因点突变及多态性检测新转录本预测可变剪切分析 07 样品量 total RNA 1.0 ug 浓度 50 ng/ul 08

6 small RNA测序 cirrna测序 Small RNA 是一大类调控分子包括 mirna ncrna sirna snorna pirna rasirna 等几乎存在于所 CircRNAs Circular RNAs 环形RNA 分子是一类不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴并以共价键形成环形结有的生物体中 Small RNA 通过多种多样的作用途径如mRNA 降解翻译抑制异染色质形成以及DNA 去除来调控构的非编码RNA 分子通过高效富集circRNA 借助最主流软件可以对circRNA 进行参考序列比对 circrna 鉴定生物体的生长发育和疾病发生 circrna 来源基因分析 circrna 表达水平定量差异表达分析 GO KEGG 富集分析 mirna 结合位点预测点预测等 Small RNA srna 测序采用Illumina HiSeq 平台可针对样本中的miRNA sirna pirna展开全面分析既能鉴定已知 srna 也能预测新的 srna 并预测 srna 的靶基因为研究 smallrna 功能及调控机制提供有力手段 RNA样品检测原始测序数据测序数据质量评估测序数据质量控制与参考基因组比对长度分布公共及特有序列分析 snorna,scrna,repeat circrna来源基因分析 rrna,trna,snrna srna分类注释预测circRNA circrna表达水平分析已知miRNA鉴定新miRNA预测 mirna结构分析碱基编辑碱基偏好性分析 mirna家族分析靶基因预测差异表达分析差异表达分析 GO富集分析差异表达miRNA靶基因功能注释 microrna结合位点分析差异表达miRNA靶基因功能富集分析 KEGG富集分析基因功能基因表达调控疾病发生分子互作 cerna 网络等基因调控疾病发生染色体形态生物生长发育样品浓度样品总量 total RNA 100 ng/ul 5.0 ug 09 样品量 total RNA 3.0 ug 200 ng/ul 10

7 蛋白蛋白翻译后修饰位点鉴定蛋白质组 proteome 是指一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质总和而蛋白质翻译后修饰 PTMs 几乎参与了细胞所有正常生命活动的过程并发挥十分重要的调控作用蛋白质修饰位点蛋白质组学是指利用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新学科其主要目的是研究生物体能够影响蛋白的多种属性包括蛋白质折叠活性以及最终的功能对于蛋白质修饰位点的发现及研究对阐明蛋白质的功内所有蛋白质的种类表达水平修饰状态了解蛋白质之间的相互作用与联系揭示蛋白能具有重要作用质功能与生命活动的规律金开瑞采用超高分辨率质谱技术结合生物信息学分析提供磷酸化乙酰化泛素化甲基化糖基化等蛋白翻译后修饰位点鉴定技术服务单一蛋白鉴定单个蛋白质身份鉴定是生物化学领域常见的问题目前有两大方法论 Edman降解法和质谱法质谱法又细分为两类 MALDI-TOF和主流文献中的方法都是(首选AB SCIEX的5600-plus或者Thermo的Orbitrap类型的质谱接受订单及样品蛋白提取肽段混合数据解析结果交付仪) 具有更高的灵敏度和几乎100%的可靠性且具有MALDI-TOF不可比拟的从单一蛋白质胶带中准确鉴定出多个蛋白质组分的能力武汉金开瑞采用AB SCIEX的5600-plus质谱平台可提供蛋白胶点/胶条鉴定及翻译后修饰位点鉴定服务技术特点 1 时间快周期短 2 识别位点准确采用超高分辨率质谱技术可以准确定位到发生修饰的氨基酸位点蛋白胶点/胶条鉴定蛋白质组学研究中常用双向电泳(Two-dimensional gel electrophoresis 2-DE)和聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis 分离蛋白质混合物收集目的蛋白质胶点和胶条经胶内酶已知蛋白序列明确翻译后修饰的类型解后用于质谱分析以获得蛋白质信息是目前使用最广泛的蛋白质组学研究手段金开瑞采用MS/MS技术进行蛋白胶点胶条鉴定并对胶内酶解法进行系列优化可显著提高蛋白质胶内酶解的质谱鉴定成功率和肽段覆盖率蛋白量运输方式胶粒/胶条 Fmol 考马斯亮蓝或银染染色肉眼可见银染过程中未使用戊二醛作为固定剂在电泳后一周内进行切胶送样去离子水防干蛋白液 Fmol 浓度 1 ug/µl 挥发性盐<20 mm 无PBS SDS和尿素等物质干冰或冰袋接受订单及样品蛋白点切取蛋白质酶解 MS/MS 数据解析结果交付技术优势 1 样品简单容易检测 2 目标性强易于分析物种已完成全基因组测序转录组测序或已知目标蛋白的序列 11 蛋白量运输方式胶粒/胶条 Fmol 考马斯亮蓝或银染染色肉眼可见银染过程中未使用戊二醛作为固定剂在电泳后一周内进行切胶送样去离子水防干蛋白液 Fmol 浓度 1 ug/µl 挥发性盐<20 mm 无PBS SDS和尿素等物质干冰或冰袋 12

8 发现蛋白质组定量蛋白质组蛋白质组学的核心内容之一就是蛋白质鉴定传统的方法如蛋白质微量测序氨基酸组成分析如Edman 降解法费时费力通量低存在不容易实现规模化和自动化结果灵敏度差等问题当前主流的基于软电离技术的液相色谱-质谱系统是实现高通量蛋白鉴定的主要方法 Label-free定量 Label-free 定量不需要对比较样本做特定标记处理只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据 Label-free 技术又可分为基于谱图数 Spectra Count 简称SC 和基于肽段母离子强度或色谱离子流的峰面积即XIC 两种方法后者更准确接受订单及样品蛋白酶解 HPLC 分组分数据解析结果交付使用更广泛 Label-free 技术对液相色谱串联质谱的稳定性和重复性要求较高但无需昂贵的同位素标签做标记技术特点 1 通量大金开瑞一次实验可鉴定6000多种蛋白质以人HepG2为例样品1 样品2 肽段混合物1 肽段混合物2 2 结果准确可靠金开瑞质谱仪的质量精度可达到1ppm以下分辨率能达到4 10 4以上可提供高质量的数据 3 适用范围广泛对物种要求无限制理论上适用于任何物种要求物种具有蛋白质参考数据库 EST序列转录组或基因组注释信息 HPLC分组分样品量植物组织湿重 2 g 富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于 5 g 根木质部韧皮部组织等微生物真菌细菌噬菌体等湿重 2 g 请咨询细胞细胞数需大于5 10 6个约细胞沉淀体积50 µl左右动物组织湿重 100 mg / 体液唾液羊水脑脊液等 500 ul 无溶血现象血液 5 ml / 血清血浆 500 ul / 尿液 50 ml / 蛋白提取物蛋白总量 500 ug 蛋白浓度 1 ug/µl 需告知缓冲液成分及对应浓度原始质谱数据蛋白质鉴定 GO注释 COG注释蛋白质定量 KEGG通路注释 GO富集 KEGG富集表达量聚类结果产出适合大样本量的定量比较对无法用标记定量实现的实验设计宜用label-free 技术要求物种具有蛋白质参考数据库 EST序列转录组或基因组注释信息 1 疾病标志物筛选 2 分子机制研究 3 药物作用靶点研究 13 14

9 SWATH itraq定量 itraq isobaric tags for relative and absolute quantitation 技术是由AB SCIEX公司研发的一种体外同重同位 SWATH Sequential Window Acquisition of all THeoretical Mass Spectra 是瑞士苏黎世联邦理工学院的素标记的相对与绝对定量技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团经高精度质谱仪串联分析 Ruedi Aebersold 博士及其团队与AB-SCIEX联合推出的一项全新的质谱技术 SWATH采集模式是一种新型的MS/MS 扫可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量是近年来定量蛋白质组学中应用最广泛的高通量筛选技术描技术它将扫描范围划分为以25 Dalton 为间隔的一系列区间通过超高速扫描来获得扫描范围内全部离子的所有碎片金开瑞蛋白质组学技术平台提供iTRAQ定量蛋白质组技术服务具有灵敏度高分离能力强高通量等特点特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析并可同时得出鉴定和定量结果信息是 MS/MSALL技术的扩展 SWATH技术是一种真正全景式的高通量的质谱技术同时也大大提高了定量的可重现性金开瑞现有的Triple-TOF 5600-plus质谱系统使SWATH定量具有较高的准确度和动态范围可检测到蛋白质的丰度差异极大跨越4个数量级且SWATH方法的灵敏度和动态范围与SRM分析水平相当样品1 样品2 肽段混合物1 肽段混合物2 生物样品蛋白提取酶解肽段混合物 itraq标记样品混合 LC-SWATH 质谱原始数据 SWATH质谱原始数据 HPLC分离数据质控构建参考谱图库蛋白质全谱鉴定 SWATH定量原始质谱数据蛋白质鉴定蛋白质定量 GO注释 COG注释 KEGG通路注释 GO富集 KEGG富集表达量聚类差异蛋白 GO注释 COG注释 KEGG通路注释 GO富集 Pathway富集表达量模式聚类结果产出结果产出技术特点技术特点 1 灵敏度高可检测出较低丰度蛋白胞浆蛋白膜蛋白核蛋白胞外蛋白等 2 分离能力强可分离出酸/碱性蛋白小于10K或大于200K的蛋白难溶性蛋白 3 高通量可同时对8个样本进行分析特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析 1 灵敏度高 SWATH技术继承了MRM的数据采集模式结合高分辨率的AB sciex Triple TOF-plus 具有与MRM相当的灵敏度 2 可重现性高重复样品间的定量相关性可达到0.99以上 3 定量准确度高定量准确度几乎与MRM技术相当 4 线性动态范围广定量范围可跨越4个数量级 5 通量大一次实验可检测到2000种以上蛋白并定量 4 结果可靠准确定性与定量同步进行同时得出鉴定和定量结果重复样品间的蛋白表达量相关性可达到0.95以上 5 自动化程度高液质连用自动化操作分析速度快分离效果好适用于任何类型的样本一次最多能标记8个样本物种具有基因组序列 ESTs序列或蛋白质参考序列最好检测细菌等复杂度较低的样品可以和MRM HR/PRM技术联合使用发现生物标志物可以和TAP技术联合使用鉴定相互作用蛋白要求物种具有蛋白质参考数据库 EST序列转录组或基因组注释信息 15 16

10 SILAC定量修饰蛋白质组学 2002 年德国Matthias Mann 实验室Ong SE 等对AACT Amino acid coded-mass tagging 技术作了进一步改进建立了SILAC 技术并首次应用于定量蛋白质组研究为全面系统地定性和定量分析复杂哺乳动物细胞蛋白质组提供了有效的方案 SILAC 的基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(中性或重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸细胞经5-6 个倍增周期后稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基蛋白质翻译后修饰 PTMs 几乎参与了细胞所有正常生命活动的过程并发挥十分重要的调控作用蛋白修饰已经成为国际上蛋白质研究的一个极其重要的领域金开瑞结合先进的HP系统分析和生物信息学分析技术提供磷酸化乙酰化糖基化泛素化等蛋白质组修饰定量技术服务以磷酸化蛋白质组鉴定为例酸不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合经分离纯化后进行质谱鉴定根据一级质谱图中两个同位磷酸化蛋白质组鉴定素型肽段的面积比较进行相对定量属于体内代谢标记法细胞培养基轻标细胞培养基中标蛋白质磷酸化是生物体中最常见最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式它可以通过激发调节诸多信号通路进而参与调控生物体的生长发育逆境应激疾病发生等多种生命过程所以磷酸化一直是生物学研究的重点与热点根据客户需求金开瑞蛋白质组平台可提供磷酸化蛋白质组全谱鉴定 label-free定量技术服务细胞培养基重标混合1 1 1 磷酸化蛋白质组全谱鉴定以组织细胞等较为复杂样本为研究对象目的在于鉴定样品中发生磷酸化的蛋白质以及相应的磷酸化位点首先对蛋白样本进行酶解 TiO2或IMAC-Fe或IMAC-Ti富集磷酸化多肽 5600-plus质谱检测利用得到的质谱谱图与相应数据库搜索比较从而得到肽段序列结果同时通过生物信息软件计算出磷酸化位点对于磷酸化位点鉴定为了增加定位修饰位点的准确性金开瑞采用较流行的Ascore算法对发生在各位点的磷酸化修饰做进一步打分评估从而正确辨别真实修饰位点混合溶菌产物蛋白提取酶解肽段混合物样品1 HPLC分离蛋白提取肽段酶解肽段混合物 TiO 2富集磷酸化肽段原始数据 HPLC 蛋白质鉴定数据质控蛋白质定量差异蛋白 GO注释 COG注释 KEGG通路注释 GO富集 Pathway富集质谱原始数据鉴定表达模式聚类磷酸化位点鉴定磷酸化蛋白质鉴定定量 or label-free定量 itraq定量磷酸化蛋白定量结果产出 GO注释 COG注释 COG注释 motif预测 GO富集 Pathway富集磷酸化位点定量只适用于活体培养的细胞对于生物医学研究中常用的组织样品体液样品等无法分析对于动物模型的标记成本太大结果产出无法实现物种已知基因组序列 ESTs 或蛋白质组全库序列技术特点 1 富集方法特异性高对低pH溶液去垢剂盐类其它低分子污染物有更高的耐受性容易与非磷酸化肽段分离 2 通量大金开瑞一次可以鉴定1000个以上磷酸化位点蛋白质复合体及蛋白质相互作用研究蛋白质翻译后修饰研究动物水平蛋白质功能研究蛋白质绝对定量研究已知物种基因组序列 ESTs序列或蛋白质序列全库无其他特别要求 17 18

11 目标蛋白质组 MRM HR/PRM 基因组学和蛋白质组学告诉你什么可能发生而代谢组学则告诉你什么确实发生了代谢 MRM Multiple reaction monitoring 是一种基于已知信息或假定信息设定质谱检测规则对符合规则的离子进行信号记录去除大量不符合规则离子信号的干扰从而得到质谱信息的一种数据获取方式对于MRM技术而言关键在于首先要能够检测到具有特异性的母离 Bill Lasley UC Davis 生命科学研究日新月异基因组次及相关分析技术的提高极大地推动力转录组学蛋白质组学代谢组学表型组学等的快速发展人们可以采用系统集成的手段多层次揭示生命现象这种研究的思路和方法催生了系统生物学代谢组学是系统生物学的重要组成部分代谢物与表型最为接近代谢物的变化更直接地揭示基因的功能因此代谢组学研究越来越受到广泛的关注代谢组学手段在解析生物系统及基因功能等方面也发挥着越来越重要的作用代谢组 metabolome 指参与生物体新陈代谢维持生物体正常生长功能和生长发育的小分子化合物的集合主要是相对分子量小于1000的内源性小分子子然后只将选定的特异性母离子进行碰撞诱导(Collision-induced) 最后去除其他子离子的干扰只对选定的特异子离子进行质谱信号的采代谢组学 metabolomics 指对某一生物组织或细胞中所有低分子量通常指 MV 1000 代谢产物进行定性和定量分析的一门科学集金开瑞依据前人的工作在AB SCIEX的5600-plus 仪器上开发出了 MRM HR技术因为MRM HR采纳了高精度的数据因此选择Transition更 MRM HR技术工作原理图加可信定量更加准确非靶标代谢组学 MRM方法建立 MRM实验分析目标蛋白信息生物样品蛋白提取酶解特异性肽段挑选非靶向代谢组学又称为发现代谢组学主要是将对照组和实验组的代谢组某一生物体的全部代谢物进行比对以找出其代谢物的差异主要分为医学代谢组学植物代谢组学微生物代谢组学药物代谢组学及脂质代谢组学技术流程肽段混合物加内标肽采样代谢物的提取上机检测 GC-MS LCMS NMR 数据预处理信息峰提取识别 LC MRM HR 生成MRM transitions 多元变量统计分析 PCA PLS-DA OPLS-DA 深度数据挖掘代谢通路分析关联分析数据分析内容质谱原始数据 MRM transitions优化数据分析结果产出基本数据分析数据预处理 PCA分析 PLS-DA分析 OPLS-DA分析差异化合物筛选差异化合物鉴定高级数据分析多组分关联分析同一标本同时取多组分代谢通路分析代谢网络分析多组学数据关联分析具备多组学数据技术特点差异代谢物寻找筛选疾病发病机制研究药物治疗机制研究 1 灵敏度高通过两级离子选择排除大量干扰离子使质谱的化学背景降低目标检测物的信噪比显著提高从而实现检测的高灵敏度 2 重现性好在MRM HR 技术选择性的质谱信号采集中避免了待测分子离子化质谱信号的抑制及源内碰撞碎裂过程的靶标代谢组学影响因此重现性也相应得到了提高 3 准确度高利用MRM HR技术的特异性进行连续增强的离子扫描分析得到高分辨的串联质谱(MS/MS)碎片数据与全扫描和中性丢失质谱扫描模式相比降低了分析过程中定性结果的假阳性率保证了分析的准确度 4 通量高使用目前最先进的质谱系统 MRM HR技术每个工作循环能处理多达300对母离子-子离子对这种特点为研究主要是以标准品为参照对特定的代谢物群进行有针对性地特异性地检测与分析相对于全代谢组分析而言靶向代谢组分析具有特异性强检测灵敏度高和定量准确等几个特点,主要包括LC-MS靶标代谢组学/GC-MS靶标代谢组学技术流程多种蛋白质的多种修饰和丰度变化提供了机会更能满足蛋白质组学的研究需求规范取样样品冻干样品提取上机跑样检测下机数据分析 19 适合验证已知蛋白质序列的蛋白质表达量差异验证可以检测较低丰度的蛋白验证由发现代谢组学实验提出的假说一次MRM实验只能检测20个左右目标蛋白进行基于假说的探索性实验通常根据最新的解释针对特定代谢物研究代谢模型 20

近年来随着新技术的不断涌现加快了多组学研究向定量化多联合分析高通量的发展特别是在单细胞层次研究基因组学转录组学蛋案例分析白质组学和代谢组学已成为人们发现生命化学物质基础和深入了解其分子机制的新方向通过对多组学数据的整合分析

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结果更可靠数据更丰富组学研究整体框架生物信息学系统生物学经典分子生物学文献验证基因组转录组分子机制建模功能验证多层统计分析转基因标志物筛选蛋白组功能分析图1. 转录组及蛋白质组差异表达分析图2.

Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals[j].

12 近年来随着新技术的不断涌现加快了多组学研究向定量化多联合分析高通量的发展特别是在单细胞层次研究基因组学转录组学蛋案例分析白质组学和代谢组学已成为人们发现生命化学物质基础和深入了解其分子机制的新方向通过对多组学数据的整合分析有利于系统性地研究临床发病案例一蛋白质组+转录组机理确认疾病靶点发现生物标志物与进行疾病早期诊断从而对个体化治疗和用药指导发挥重要作用参考文献 Cabezas-Wallscheid N,Klimmeck D, et al. Identification of Regulatory Networks in HSCs and Their Immediate Progeny via Integrated Proteome, Transcriptome, and DNA Methylome Analysis[J]. Cell Stem Cell, 2014, 15 (4) : 文章内容文章针对造血干细胞 hematopoietic stem cells HSCs)及四种多能祖细胞群 multipotent progenitor 多组学联合分析 MPP 的定量蛋白质组转录组及甲基化分析数据进行了整合分析从鉴定到的27000余条转录本 6000余个蛋白和15000余段差异甲基化区域 differentially methylated regions DMRs 中分析出与早期分化相关的协同作用的分子变化文章数据揭示出493种转录因子的转录本与628条lncRNA的差异表达图谱并找出了HSCs中重点的特异表达群同时还发现了在HSCs分化过程中的起关键作用的转录本亚型动态调控模式以及与MPP2细胞多能性相关的细胞周期/DNA修复特征文章在造血层级系统的顶层提供了一个综合的全基因组的分析资料便于探讨涉及分子细胞表观遗传的机制调控 v 核酸组学从底层原因层面探究和解决生物学问题 v 蛋白组学从表层原因层面探究和解决生物学问题 v 代谢组学从分子性状及结果层面探究和解决生物学问多层组学整合组学发展的新趋势结果更可靠数据更丰富组学研究整体框架生物信息学系统生物学经典分子生物学文献验证基因组转录组分子机制建模功能验证多层统计分析转基因标志物筛选蛋白组功能分析图1. 转录组及蛋白质组差异表达分析图2. 基因表达特征谱及转录本亚型调控案例二转录组+蛋白质组+代谢组 RT-PCR WB IHC 参考文献 Quirós PM, Prado MA, et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals[j]. Journal of Cell Biology, 2017, 216 (7) :2027 代谢组生物信息分析组学实验其他分析重点分析文章内容通过分析四种线粒体应激处理后细胞转录组蛋白质组和代谢组的变化发现ATF4基因是线粒体应激调控的关键基因实验组对照组转录组学分析蛋白质组学分析转录本定性定量分析蛋白质定性定量分析差异转录本差异蛋白质蛋白质组与转录组关联分析将转录组数据翻译成蛋白质组学分析数据库图1 低通量手段检测四种处理引起的线粒体功能变化图2 线粒体应激处理后的转录组和蛋白组检测图3 代谢组差异分析及通路示意图图4 下调蛋白的韦恩图与KEGG通路富集图蛋白质与转录本比较关联分析 GO,pathway比较关联分析 1.表达聚类分析 2.GO,KEGG分析 1.表达聚类分析 2.GO,KEGG分析关联分析 21 蛋白质与转录本表达聚类分析可变剪接相互印证 22

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