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摄兄尤
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1 生物多样性 2012, 20 (1): Biodiversity Science Doi: /SP.J http: // 一种高等植物小片段 RNA 分子标记方法 * 刘文梁红杨碧忍林杰文胡延吉 ( 仲恺农业工程学院生命科学学院, 广州 ) 摘要 : 分子生物学技术特别是分子标记方法越来越多应用于研究植物间相似关系及其进化规律为试图寻找一种适合缺乏分子生物学数据的, 以及能够在属以上高阶元间快速比较研究的小片段 RNA 分子标记方法, 作者通过含 HAc-NaAc 缓冲体系的 SDS 总核酸提取方法, 提取了 53 种高等植物的总核酸将总核酸在 7% 的聚丙烯酰胺凝胶中电泳, 结果发现 : (1) 在 bases 的位置有高丰度的 RNA 条带, 条带稳定清晰, 结果可重复再现, 用 DNase I 和 RNase A 处理后认为这些片段属于小片段 RNA (2) 比较了绿豆幼苗经 0 8 h 不同光照处理, 以及猕猴桃不同品种和器官之间的小片段 RNA, 表明不同光照时间不同性别的花蕾叶片和染色体倍性间的带型一致, 说明这些片段部分具有一定的空间结构, 其表达极其稳定, 无明显差异 (3) 同一科内的植物的带型存在多态性, 主要是由地理隔绝造成的差异, 并且分类阶元高的多态性百分比和多态性信息量高于分类阶元低的 (4) 经过比较蕨类植物裸子植物和被子植物 53 种植物的小片段 RNA, 发现在 bases 中含 3 6 条清晰的条带, 带型跟植物亲缘关系相关因此, 作者认为 bases 位置的小片段 RNA 可作为鉴定植物科间和科内亲缘关系的一种分子辅助标记关键词 : SDS 法, 总核酸, 小分子 RNA, 亲缘关系, 分子标记 Short RNAs, potential novel molecular markers for higher plants Wen Liu, Hong Liang, Biren Yang, Jiewen Lin, Yanji Hu * College of Life Sciences, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou Abstract: In recent years, molecular biology techniques, especially molecular markers, have been applied to the study of species similarity and evolutionary relationships in the field of plant systematics. Here, we attempted to find a small fragment of RNA that could be used as a molecular marker for the rapid identification of plant taxa above genus. To do so, total nucleic acids were isolated from 53 species of higher plants using SDS extracting solution containing HAc-NaAc buffer. The isolated nucleic acids were subjected to 7% polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Results showed: (1) A large number of bands, which were at the length of bases and with clear shape. The bands patterns were stable and repeatable. These segments were confirmed to be short RNAs by DNaseI and RNaseA treatment; (2) No obvious differences in band patterns were found among different varieties, organs, sexualities and ploidy of kiwifruit seedlings. A similar case existed in mung bean seedlings after different light treatment periods; (3) Banding patterns of plants in the same family were polymorphic, with differences mainly related to geographic isolation. Higher taxonomic categories had a higher percentage of polymorphic band (PPB) and higher values of polymorphism information content (PIC) than lower taxonomic categories; (4) Three to six clear bands with a length of bases, whose band patterns were related to the phylogenic relationship, were found through comparison of short RNAs from 53 species of ferns, gymnosperms and angiosperms. Thus, short RNAs with a length of bases showed potential as a molecular marker for determining inter- or intrafamily phylogenic relationships. Key words: SDS method, total nucleic acid, short RNA, phylogenic relationship, molecular markers 在早期的植物系统分类学研究中, 由于受到知识和仪器设备的限制, 人们主要凭借肉眼对植物的收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 广东省科技计划项目 (2008B ) * 通讯作者 Author for correspondence. yanjihu@163.com 外部形态特征进行物种的描述和分类虽然这在当下的植物系统分类学研究中仍很重要, 但是, 在实

2 第 1 期刘文等 : 一种高等植物小片段 RNA 分子标记方法 87 际分类研究过程中, 经常有不少物种难以用形态学方法鉴定譬如中华猕猴桃 (Actinidia chinensis), 存在性别多样性个体多态性染色体倍性变化和非整数倍等现象 ( 黄宏文等, 2000; 黄宏文, 2009; 曾华等, 2009) 特别是形态上相似的亲缘种和远缘杂交种的出现, 或者是种内种间变异错综复杂, 也直接影响了人们在形态学上对植物的分类近几十年, 应用于植物间亲缘关系和进化规律的研究方法有叶绿体 DNA 分析 DNA 保守序列分析同源基因分析 DNA 条形码蛋白质条形码和分子生物学标记等其中, 分子标记技术是常用的方法之一, 已发展了 RFLP RAPD AFLP SSR ISSR SRAP 等标记利用分子标记的相关性聚类分析等数量遗传学手段, 还可以对不同亲缘种间的分类遗传距离系统发育亲缘关系等进行研究 ( 周媛等, 2009) 本研究主要选取了 bases 位置的高丰度小片段 RNA 进行研究, 试图寻找一种适合缺乏分子生物学数据以及能够在属以上高阶元间快速比较研究的小片段 RNA 分子标记方法 1 材料与方法 1.1 实验材料材料包括被子植物门裸子植物门和蕨类植物门的 53 种植物共 57 份材料 ( 详见表 1), 材料均来自仲恺农业工程学院校园内和番禺钟村农场品种资源圃分类系统参考中国植物志采用的系统 1.2 总核酸和总 RNA 提取总核酸提取方法是一种可以获得动物和植物总核酸的方法, 并根据实验需要加入 DNase I 或 RNase A 消化分别获得总 RNA 和总 DNA( 刘文等, 2008) 称取植物幼嫩叶片 100±5 mg, 放入研钵并加入约 1 g 石英砂和 1.6 ml 提取液, 提取方法参考刘文等 (2008), 提取的总核酸沉淀用 140 μl ddh 2 O 溶解, 并用 1.5 U/100 μl 的 DNase I 消化总核酸中的 DNA 获得总 RNA, 提取的总核酸和总 RNA 通过 1.2% 的琼脂糖凝胶电泳检测质量 1.3 RNA 样品变性及电泳取总核酸或总 RNA 样品 10 μl 和 4 μl 6 loading buffer, 在漩涡震荡仪中混匀, 6,000 rpm 离心 15 s 后, 放入 PCR 仪中 : min, 迅速 4 10 min, 7% 聚丙烯酰胺凝胶 (7% acrylamide/bisacrylamide (19:1) 和 7 mol/l 尿素溶于 TBE 缓冲液中, ph8.3) 电泳分离和 0.1% 硝酸银染色检测 1.4 数据分析根据条带的有无构建 0,1 矩阵图, 利用 NTSYSpc2.10 软件进行物种间的相似系数计算和生成树状聚类图 ( 王丽侠等, 2011) 多态性位点百分比 (percentage of polymorphic band, PPB) 按照下面公式计算 : PPB= 多态性位点数 / 总位点数 (1) 等位位点频率 (p) 的计算方法参考等位基因频率的计算方法 (Frankham et al., 2005): p= 等位位点数 / 总位点数 (2) 计算出等位位点频率后用 Picalc 软件计算位点的多态性信息量 (polymorphism information content, PIC) 2 结果 2.1 小片段 RNA 稳定性的鉴定从图 1 可以看出, 采用总核酸提取方法, 对蕨类植物门裸子植物门和被子植物门的双子叶植物纲和单子叶植物纲的植物均可分离出带型清晰的总核酸和总 RNA 图 2 显示对绿豆 (Vigna radiata) 幼苗每天分别进行 h 光照处理 ( 连续处理 7 d), 其叶片及 RNA 表达情况, 可以看出, 虽然叶片生长发生了明显的变化 ( 图 2, A F), 但其幼叶的小片段 RNA 表达却完全一致 ( 图 2, 1 6) 由图 3 可以看出, 中华猕猴桃和美味猕猴桃 (A. chinensis var. deliciosa) 的 7 个不同雌雄品种, 其带型一致, 不同的品种染色体倍性和性别之间差异极小 ( 图 3, 1 7) 当进一步将总核酸样品稀释 1 倍后 ( 不经过 70 变性处理 ), 发现条带数均减少, 但差异仍很小说明本方法还可以根据研究需要来调整样品浓度另外, 从武雄和武植 3 号猕猴桃的叶片和花蕾的带型来看, 猕猴桃性别和器官间小片段 RNA 差异也不明显 ( 图 3, 8 11) 提取的总核酸样品主要由总 DNA 和总 RNA 组成, 这些 bases 的条带可以被 RNase A 降解, 但不能被 DNase I 降解, 因此我们认为它们是一种小片段 RNA 比较不经过 70 变性处理的样品与经过 min 变性处理的样品, 发现部分条带出现了迁移率的变化, 推测这部分条带可能存在一定的空间结构 ( 图 3, 8 11)

3 88 生物多样性 Biodiversity Science 第 20 卷表 1 本实验所采用的植物材料 Table 1 Plants used in the present study 分类阶元 Taxonomic category 被子植物门 Angiospermae 双子叶植物纲 Dicotyledononeae 单子叶植物纲 Monocotyledoneae 裸子植物门 Gymnospermae 蕨类植物门 Pteridophyta 中文名 Chinese name 拉丁名 Scientific name 猕猴桃科中华猕猴桃品种红阳 A. chinensis Hongyang Actinidiaceae 中华猕猴桃品种红阳 A. chinensis Hongyang 中华猕猴桃品种武雄 A. chinensis Wuxiong 中华猕猴桃品种武植 3 号 A. chinensis Wuzhi No.3 美味猕猴桃品种帮增 1 号 A. chinensis var. deliciosa Bangzeng No.1 美味猕猴桃品种和平 1 号 A. chinensis var. deliciosa Heping No.1 美味猕猴桃品种米良 1 号 A. chinensis var. deliciosa Miliang No.1 桑科 Moraceae 大叶榕 Ficus altissima Blume 水同木 Ficus fistulosa Reinw. ex Blume 垂叶榕 Ficus benjamina L. 柳叶榕 Ficus variolosa Lindl. ex Benth. 细叶榕 Ficus microcarpa L. f. 桂木 Artocarpus nitidus subsp. lingnanensis (Merr.) F. M. Jarrett 面包树 Artocarpus communis J. R. Forst. et G. Forst. 树菠萝 Artocarpus heterophyllus Lam. 豆科 Leguminosae 红花羊蹄甲 Bauhinia blakeana Dunn 酸豆 Tamarindus indica L. 紫花苜蓿 Medicago sativa L. 花生 Arachis hypogaea L. 柱花草 Stylosanthes scabra Vogel. 黄槐 Cassia surattensis Burm. f. 红绒球 Calliandra haematocephala Hassk. 绿豆 Vigna radiata (L.) R. Wilczek 夹竹桃科 Apocynaceae 夹竹桃 Nerium oleander L. 鸡蛋花 Plumeria rubra L. 狗牙花 Tabernaemontana divaricata (L.)R. Br. ex Roem. et Schult. 长春花 Catharanthus roseus (L.) G. Don 沙漠玫瑰 Adenium obesum (Forsk.) Roem. & Schult. 木犀科 Oleaceae 茉莉 Jasminum sambac (L.) Aiton 樟科 Lauraceae 樟树 Cinnamomum camphora (L.) J. Presl. 禾本科 Poaceae 玉米 Zea mays L. 香根草 Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty 狗尾草 Setaria viridis (L.) P. Beauv. 小麦 Triticum aestivum L. 水稻 Oryza sativa L. 佛肚竹 Bambusa ventricosa McClure 棕榈科 Arecaceae 鱼尾葵 Caryota ochlandra Hance 天南星科 Araceae 合果芋 Syngonium podophyllum Schott. 鸭跖草科 Commeliaceae 鸭跖草 Commelina communis L. 银杏科 Ginkgoaceae 银杏 Ginkgo biloba L. 苏铁科 Cycadaceae 华南苏铁 Cycas rumphii Miq. 罗汉松科 Podocarpaceae 罗汉松 Podocarpus macrophyllus (Thunb.) Sweet 松科 Pinaceae 马尾松 Pinus massoniana D. Don 南洋杉科 Araucariaceae 南洋杉 Araucaria cunninghamii Aiton ex D. Don 杉科 Taxodiaceae 落羽杉 Taxodium distichum (L.) Rich. 柏科 Cupressaceae 龙柏 Sabina chinensis (L.) Antoine Kaizuca 海金沙科 Lygodiaceae 海金沙 Lygodium japonicum (Thunb.) Sw. 凤尾蕨科 Pteridaceae 井栏边草 Pteris multifida Poir. 铁角蕨科 Aspleniaceae 鸟巢蕨 Neottopteris nidus (L.) J. Sm. 鹿角蕨科 Polypodiaceae 鹿角蕨 Platycerium wallichii Hook. 肾蕨科 Davalliaceae 波士顿肾蕨 Nephrolepis exaltata (L.) Schott Bostoniensis

4 第 1 期刘文等 : 一种高等植物小片段 RNA 分子标记方法 89 图 1 部分植物总核酸和 RNA 电泳图谱 1: 鱼尾葵 ; 2: 细叶榕 ; 3: 垂叶榕 ; 4: 桂木 ; 5: 夹竹桃 ; 6: 猕猴桃雌株叶片总核酸 ; 7: 猕猴桃雄株叶片总核酸 ; 8: 猕猴桃雌花蕾总 RNA; 9: 猕猴桃雄花总 RNA; 10: 银杏总 RNA; 11: 井栏边草总 RNA Fig. 1 The electrophoretogram of the total nucleic acid and RNA from certain plants. 1, Caryota ochlandra; 2, Ficus microcarpa; 3, F. benjamina; 4, Artocarpus lingnanensis; 5, Nerium oleander; 6, Total nucleic acid from Actinidia chinensis (, leaf); 7, Total nucleic acid from Actinidia chinensis (, leaf); 8, Total RNA from Actinidia chinensis (, bud); 9, Total RNA from Actinidia chinensis (, bud); 10, Total RNA from Ginkgo biloba; 11, Total RNA from Pteris multifida. 图 2 不同光照时间对绿豆叶片和小片段 RNA 的影响 A 至 F 分别为每天光照 h 处理的叶片, 连续 7 d, 2,000 lx, 25 ; 1 6 分别为 h 光照处理 7 d 后提取的小片段 RNA, M 为单链 RNA marker Fig. 2 The influence of illumination on the leaf of mung bean and short RNA segments. A to F show the leaves of mung bean after 0, 1, 2, 4, 6, 8 hours illumination each day, respectively (for seven days, 2,000 lx, 25 ); 1 6 show the short RNA segments after 0, 1, 2, 4, 6, 8 hours illumination each day for seven days. M is the single strand RNA marker. 2.2 高等植物小片段 RNA 的多态性分析在 bases 区间禾本科植物主要由 5 条片段组成, 聚类分析显示 6 个禾本科物种可以分成两大类群 : 其中玉米 (Zea mays) 和香根草 (Chrysopogon zizanioides) 聚为一个类群, 原产地在欧亚大陆的狗尾草 (Setaria viridis) 小麦(Triticum aesti- vum) 水稻(Oryza sativa) 和佛肚竹 (Bambusa ventricosa) 聚为另一个类群普通六倍体小麦是由二粒小麦 (Triticum dicoccoides) 和山羊草 (Aegilops squarrosa) 杂交形成的异源三倍体经过环境突变染色体加倍形成, 虽然经过杂交突变和染色体变异, 但其带型依然和狗尾草一致, 只是存在片段表达量上的差异 ( 图 4, A1 A6) 本研究结果与经典分类学中将竹类独立成一个亚科不同, 而与樊龙江等 (2006) 利用 8 个全长 mrna 基因序列比较了竹类植物和水稻玉米麦类作物等禾本科的系统进化和序列组成得到的结果类似, 他们也发现水稻与竹类植物有着最近的亲缘关系和更相似的基因序列特征, 与竹类植物存在良好的基因组共线性关系, 它们甚至比水稻与玉米或水稻与麦类之间的亲缘关系更近桑科的 8 个物种只有 3 种带型 ( 图 4, B1 B8) 桑科的材料涉及的原产地主要在热带及亚热带亚洲和南太平洋, 范围较小, 因此物种的相似系数较高原产地在南太平洋各岛屿的面包树 (Artocarpus communis) 只有 1 种带型 ; 原产地都在热带及亚热带亚洲的水同木 (Ficus fistulosa) 和其他 6 种植物仅有 1 条片段有差异 ; 大叶榕 (F. altissima) 等 6 种植物的带型一致, 说明 bases 位置的片段在长度变异方面极其保守 ; 面包树与其他 7 个物种仅有 2 条片段存在差异可以看出地理隔离可以促使同科物种在进化过程中朝着不同方向分化从图 4(C1 C5) 的聚类分析发现, 在相似系数约为 0.59 处可将夹竹桃科 5 个物种分成三大类群, 趋向于支持将夹竹桃科划分为夹竹桃亚科鸡蛋花亚科和狗牙花亚科三个亚科的观点 ( 蒋英, 1977) 不过, 本研究显示的长春花 (Catharanthus roseus) 与沙漠玫瑰 (Adenium obesum) 相似系数达 1.0, 与有些学者的研究不同 ( 黄久香等, 2007), 这可能需要扩大物种选取和取材范围, 作进一步的分析才能解释对于夹竹桃科内的划分, 不同学者观点不同, 需要依靠研究手段的不断进步和资料的丰富积累来解决广义的豆科植物在 bases 之间主要由 4 5 条片段组成, 经过聚类分析发现, 原产地同在南美洲的花生 (Arachis hypogaea) 和柱花草 (Stylosanthes scabra) 相似系数最高, 它们与其他 5 种植物亲缘关系最远 ( 图 4, D1 D7) 但是, 本研究所得结果不能与传统的分类学结果吻合目前, 学者

5 90 生物多样性 Biodiversity Science 第 20 卷图 3 猕猴桃不同品种和器官的小片段 RNA 电泳图谱 1 7 分别为红阳武雄帮增 1 号红阳武植 3 号米良 1 号和平 1 号 ( 总 RNA 经过 min 变性处理 ); 8 11 分别是 : 武植 3 号雌株花蕾武植雄株花蕾武植 3 号雌株叶片武植雄株叶片 ( 总 RNA 稀释 1 倍后, 不经过 70 变性处理 ) M: 单链 RNA marker Fig. 3 The electrophoresis result of short RNA segments from different kiwifruit varieties and organs. 1 7 are Actinidia chinensis Hongyang ( ), A. chinensis Wuxiong ( ), A. chinensis var. deliciosa Bangzeng No.1 ( ), A. chinensis Hongyang ( ), A. chinensis Wuzhi No. 3, A. chinensis var. deliciosa Miliang No.1 ( ), A. chinensis var. deliciosa Heping No.1 ( ), respectively. The total RNA samples which had been hold in 70 for 10 minutes are A. chinensis Wuzhi No. 3 ( ) bud, A. chinensis Wuxiong ( ) bud, A. chinensis Wuxiong ( ) leaf, A. chinensis Wuzhi No. 3 ( ) leaf, respectively. The total RNA samples which had 1-fold dilution and had not been hold in 70. M is the single strand RNA marker. 们多采用广义的豆科概念 ( 朱相云和杜玉芬, 2002), 也有学者则将其提升为豆目 ( 张宏达等, 2006) 但在豆科的分类系统中, 至今仍然存在一定的争议, 本研究提供的方法亦可作为在鉴定豆科植物亲缘关系过程中的参考对于蕨类植物本研究选取了薄囊蕨纲水龙骨目的 5 个科 : 海金沙科 ( 海金沙 Lygodium japonicum) 凤尾蕨科( 井栏边草 Pteris multifida) 铁角蕨科 ( 鸟巢蕨 Neottopteris nidus) 鹿角蕨科( 鹿角蕨 Platycerium wallichii) 肾蕨科( 波士顿肾蕨 Nephrolepis exaltata Bostoniensis ) 从电泳图看 ( 图 4, E1 E5), 水龙骨目的蕨类植物含有 3 4 条带, 其中只有鸟巢蕨是 3 条带, 其余蕨类都是 4 条带通过聚类分析发现, 在相似系数为 0.42 时可以把水龙骨目 5 个科分为两大类群, 其中海金沙与井栏边草亲缘关系最近, 达到 0.83 蕨类植物具有许多独特的特征, 组成植物界一个独立的类群, 在分类系统中它们的组成十分庞杂, 植物学家对蕨类植物的分类各执一见, 曾经提出多个分类系统 ( 郭新弧, 2010) 目前发展了叶表皮微形态 ( 王任翔等, 2009; 王任翔和陆树刚, 2010) 孢子形态 ( 张碧波等, 2006) 基因序列( 张丽君等, 2010; 森林等, 2010) 等标记物来研究蕨类植物亲缘关系和起源, 本研究的小片段 RNA 分子标记方法可作为分析蕨类植物亲缘关系的一种新方法在 7 种裸子植物中, bases 之间存在 3 6 条片段, 经过聚类分析后发现, 在相似性系数为 0.65 的位置将裸子植物分为五大类群, 其中龙柏 (Sabina chinensis Kaizuca ) 和马尾松 (Pinus massoniana) 相似性最高, 达到 0.88, 在 5 条带中, 仅有 1 条存在差异, 说明松科和柏科之间相似性极高, 而且这部分小片段 RNA 的序列长度保守性较高 ( 图 4, F1 F7) 聚类分析显示, 龙柏马尾松的分支和罗汉松的分支可以分别独立成一个类群, 而银杏 (Ginkgo biloba) 和华南苏铁 (Cycas rumphii) 却不能被独立分离出一个类群, 同在松柏目的南洋杉 (Araucaria cunninghamii) 和落羽杉 (Taxodium distichum) 单独聚在一起, 说明本方法可以应用于科间水平亲缘关系分析, 但在分析亲缘关系较远的物种中, 如纲或目的比较时存在一定的局限性对于单子叶植物和双子叶植物而言, 虽然这两个纲的物种在形态上难于直接鉴定亲缘关系, 但它们在 bases 之间都存在多条同源序列, 甚至部分不同科的物种的有些片段长度没有差异尽管本研究的标记方法仅体现了小片段 RNA 碱基长度差异, 未能体现同源片段中的碱基差异, 但由于小片段 RNA 稳定性高, 可以对分子生物学信息缺乏的高阶元物种间亲缘关系进行初步分析 2.3 高等植物小片段 RNA 多态性分析从表 1 各阶元植物的多态性分析可以看出, 桑科的多态性百分比和多态性信息量均比其他植物小, 可能是由于本研究中桑科材料原产地涉及的范围较小, 主要是在亚洲热带和亚热带范围, 而其他科的植物材料原产地范围较广, 因此, 我们推断植物小片段 RNA 多态性百分比与地理隔离有一定的相关性在被子植物中, 豆科的多态性百分比和多态性信息含量均比禾本科桑科和夹竹桃科植物高, 这或许有助于理解有些学者将广义的豆科升级为豆目的观点 ( 张宏达等, 2006) 另外, 水龙骨目和裸子植物门的多态性百分比和多态性信息含量高于禾本科桑科和夹竹桃科的植物, 说明高阶元物种间的多态性百分比和多态性信息含量高于低

6 第 1 期刘文等 : 一种高等植物小片段 RNA 分子标记方法 91 图 4 高等植物的小片段 RNA 图谱及其聚类分析图 A1: 玉米 ; A2: 狗尾草 ; A3: 香根草 ; A4: 小麦 ; A5: 水稻 ; A6: 佛肚竹 B1: 大叶榕 ; B2: 水同木 ; B3: 垂叶榕 ; B4: 柳叶榕 ; B5: 细叶榕 ; B6: 桂木 ; B7: 面包树 ; B8: 树菠萝 C1: 夹竹桃 ; C2: 鸡蛋花 ; C3: 狗牙花 ; C4: 长春花 ; C5: 沙漠玫瑰 D1: 红花羊蹄甲 ; D2: 酸豆 ; D3: 紫花苜蓿 ; D4: 花生 ; D5: 西卡柱花草 ; D6: 黄槐 ; D7: 红绒球 E1: 海金沙 ; E2: 鹿角蕨 ; E3: 鸟巢蕨 ; E4: 波士顿肾蕨 ; E5: 井栏边草 F1: 龙柏 ; F2: 马尾松 ; F3: 罗汉松 ; F4: 银杏 ; F5: 华南苏铁 ; F6: 落羽杉 ; F7: 南洋杉 M 为单链 RNA marker; 由上至下分别为 200 bases 和 100 bases Fig. 4 The pattern and dendrogram of short RNA segments from higher plants. A1, Zea mays; A2, Setaria viridis; A3, Chrysopogon zizanioides; A4, Triticum aestivum; A5, Oryza sativa; A6, Bambusa ventricosa; B1, Ficus altissima; B2, Ficus harlandii; B3, Ficus benjamina; B4, Ficus variolosa; B5, Ficus microcarpa; B6, Artocarpus lingnanensis; B7, Artocarpus altilis; B8, Artocarpus heterophyllus, C1, Nerium oleander; C2, Plumeria rubra; C3, Ervatamia divaricata; C4, Catharanthus roseus; C5, Adenium obesum, D1, Bauhinia blakeana; D2, Tamarindus indica; D3, Medicago sativa; D4, Fabales, Arachis hypogaea; D5, Stylosanthes scabra; D6, Cassia surattensis; D7, Calliandra haematocephala; E1, Lygodium japonicum; E2, Platycerium wallichii; E3, Neottopteris nidus; E4, Nephrolepis exaltata Bostoniensis ; E5, Pteris multifida, F1, Sabina chinensis Kaizuca ; F2, Pinus massomana; F3, Podocarpus macrophyllus; F4, Ginkgo biloba; F5, Cycas rumphii; F6, Taxodium distichum; F7, Araucaria cunninghamii. M is the single strand RNA marker; from up to down are 200 bases and 100 bases separately. 表 2 高等植物的小片段 RNA 多态性分析 Table 2 The short RNA segments polymorphism analysis in higher plants 分类阶元 Taxonomic category 材料数量 No. of species 同源片段数目 No. of band analogs 多态性位点数 No. of polymorphic loci 总位点数 No. of total loci 多态性百分比 PPB(%) 多态性信息量 PIC 禾本科 Poaceae 桑科 Moraceae 夹竹桃科 Apocynaceae 豆科 Leguminosae 蕨类植物门 Pteridophyta 裸子植物门 Gymnospermae PPB, Percentage of polymorphic band; PIC, Polymorphism information content.

7 92 生物多样性 Biodiversity Science 第 20 卷图 5 11 种被子植物的小片段 RNA 图谱 1 11 分别为狗尾草美人蕉蒜鱼尾葵合果芋鸭跖草茉莉中华猕猴桃紫花苜蓿狗牙花樟树 M: 单链 RNA marker Fig. 5 The pattern of short RNA segments from 11 species from Angiosperm are Setaria viridis, Canna indica, Allium sativum, Caryota ochlandra, Syngonium podophyllum, Commelina communis, Jasminum sambac, Actinidia chinensis, Medicago sativa, Ervatamia divaricata, and Cinnamomum camphora, respectively. M is the single strand RNA marker. 阶元的物种类群 3 讨论植物 DNA 和 RNA 提取常用的方法有异硫氰酸胍法热酚法 SDS 法 CTAB 法及 Trizol 等试剂盒 ( 钟凤林等, 2010) 提取高质量的核酸, 除需要防止核酸酶对核酸的破坏之外, 还要防止植物组织中多糖多酚和醌类等物质对 RNA 和 DNA 的干扰从富含多糖多酚的植物组织中提取总 RNA, 关键在于在提取过程中能有效地排除 RNase 多糖蛋白质及多酚的干扰 ( 淳俊等, 2008) 本研究针对自身的实验室条件试验材料和目的, 选取适应性广的 SDS 提取方法, 此方法直接用石英砂替代液氮研磨, 也不需要超高速离心机, 适合研究条件一般的实验室, 而且在裸子植物和被子植物中均获得较好的提取效果, 提取的总核酸和总 RNA 可以满足小片段 RNA 分子标记实验的需要分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记, 一般是以 DNA 水平遗传多态性来直接反映本研究中的小片段 RNA 分子标记方法是基于对总 RNA 提取后的直接电泳, 具有以下优点 : (1) 在属间和科间具有多态性, 属于鉴定高阶元物种间亲缘关系的分子标记方法 ; (2) 小片段 RNA 表达稳定, 能在植物不同组织染色体倍性和生长阶段取样鉴别 ; (3) 无需酶切设计引物和 PCR 扩增, 适合于初步鉴定缺少分子数据的未知物种 ; (4) 实验操作方法简单, 检测手段简单快速, 重复性好, 直观无假阳性但这种方法仅能体现小片段 RNA 碱基长度差异, 未能体现同源片段中的碱基差异传统的系统分类学主要依据形态学结合地理标志来分类 (Ching, 1954, 1978; 张宏达等, 2006) 由于外观形态性状数量有限, 形态学分类有其局限性, 形态学方法无法鉴定许多群体中普遍存在的隐存分类单元 ( 莫帮辉等, 2008); 另外, 形态学鉴定易受遗传变异生长环境的影响和生物性别发育阶段的限制 ( 焦明超等, 2011) 随着技术的发展, 在细胞结构水平蛋白质和核酸分子水平上对植物亲缘关系进行的分析手段越来越多, 因此, 不同的鉴定手段可应用于不同阶元物种的亲缘关系鉴定通常, 鉴定缺少形态数据形态不易区分, 或进化速率较高的性状和标记可以揭示低阶元物种或物种中的隐存种, 本研究中的小片段 RNA 分子的长度进化速率较低, 因此, 可应用于初步鉴定高阶元水平的已知物种和新物种参考文献 Ching RC (1954) A systematic arrangement of the Chinese fern families and genera with corresponding names in Chinese. Acta Phytotaxonomica Sinica ( 植物分类学报 ), 3, Ching RC (1978) The Chinese fern families and genera: systematic arrangement and historical origin. Acta Phytotaxonomica Sinica ( 植物分类学报 ), 16, Chun J ( 淳俊 ), Zheng YF ( 郑彦峰 ), Wang SH ( 王胜华 ), Chen F ( 陈放 ) (2008) A RNA isolation method suitable for a wide range of materials. Progress in Biochemistry and Biophysics ( 生物化学与生物物理进展 ), 35, (in Chinese with English abstract) Fan LJ ( 樊龙江 ), Guo XY ( 郭兴益 ), Ma NX ( 马乃训 ) (2006) Comparative study on phylogenetics and sequences composition of bamboos and cereals. Forest Research ( 林业科学研究 ), 19, (in Chinese with English abstract) Frankham R, Ballou JD, Briscoe A (translated by Huang HW ( 黄宏文 ), Kang M ( 康明 )) (2005) Introduction to Conservation Genetics ( 保育遗传学导论 ). Science Press, Beijing. (in Chinese) Guo BL ( 郭宝林 ), Hong DY ( 洪德元 ), Xiao PG ( 肖培根 ) (2008) Further research on chemotaxonomy of paeonol and analogs in Paeonia. Journal of Systematics and Evolution ( 植物分类学报 ), 46, (in Chinese with English abstract) Guo XH ( 郭新弧 ) (2010) A new tentative idea on the classification system of Pteridophyta. Journal of Anhui Normal

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AFLP % 1. 1 DNA 5 RAPD DNA 0. 1g % ~ ph 6 10 DNA 9 40μl TE SSR STS 20ng /L

AFLP % 1. 1 DNA 5 RAPD DNA 0. 1g % ~ ph 6 10 DNA 9 40μl TE SSR STS 20ng /L 2012 13 2 201-206 Journal of Plant Genetic Resources / 071001 41 SSR 21 SSR 41 52 2 ~ 4 2. 5 Shannon 0. 21 ~ 1. 40 0. 73 5. 54 3 7 9 13. 16% ~ 186. 49% 5. 48 6 11 SSR Genetic Diversity of Peanut Arachis