第 5 期摇摇摇摇熊建华, 等 : 凡纳滨对虾内质网膜转运通道蛋白基因 Sec61 酌的克隆及表达分析 447 质量分别为 18 郾 24 g 和 10 郾 33 g, 日龄为 93 d 每组取 10 尾虾, 每尾对虾取 30 mg 肌肉组织, 组内混合后分别提取 RNA 按照 Invitrogen

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弹于臧
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1 第 26 卷第 5 期大连海洋大学学报 Vol. 26 No 年 1 0 月 JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Oct 文章编号 : (2011) 凡纳滨对虾内质网膜转运通道蛋白基因 Sec61 酌的克隆及表达分析熊建华 1 1, 盛小伟 2 1, 高永华 2, 李文兰 2, 杨彦豪 1 1, 陈晓汉 (1. 广西水产研究所遗传育种与健康养殖重点实验室, 广西南宁 ; 2. 桂林理工大学化学与生物工程学院, 广西桂林 ) 摘要 : 以生长性状为指标分离凡纳滨对虾 Litopenaeus vannamei 家系的肌肉组织, 构建凡纳滨对虾生长性状差减 cdna 文库, 进行斑点杂交筛选获得内质网膜转运通道蛋白基因 Sec61 酌基因, 克隆获得 cdna 全长编码序列及部分非编码序列序列包含 270 bp 的开放阅读框, 推测编码的蛋白质为 89 个氨基酸, 预测的相对分子质量为 , 理论等电点为 10 郾 58 通过荧光定量 PCR 的方法研究了 Sec61 酌基因在对虾不同组织和不同生长期肌肉组织中的表达情况, 结果表明 : Sec61 酌基因在对虾的血液以及心脏肝胰腺肌肉胃肠眼柄等器官或组织中都有表达, 其中在肌肉组织中表达量最高, 在肠中表达量最低 ; 在对虾不同生长期肌肉中的表达量各不相同, 在 10 日龄的对虾肌肉组织中表达量最高, 为 45 日龄的对虾肌肉组织中表达量的 27 郾 6 倍关键词 : 凡纳滨对虾 ; Sec61 酌基因 ; 抑制性差减杂交 ; 荧光定量 PCR 中图分类号 : Q 785 摇摇摇摇文献标志码 : A 摇摇 Sec61 酌基因编码是内质网膜转运通道蛋白 Sec61 的一种亚基 [1] 在真核生物中, Sec61 是一种位于内质网上的跨膜复合体, 是转运功能蛋白的运输通道 [2], 其主要功能是形成一个疏水通道在新生肽链的共翻译转运过程中, 由于新生肽链的 N 端带有正电荷, 不能轻易易位进入疏水的内质网膜, 要完成蛋白质的转运, 必然要形成一个蛋白引导通道, 让核糖体合成的新生多肽通过并穿过内质网的内腔 [3-4] 通道的形成涉及 Sec61 复合体与核糖体内质网膜蛋白三者的相互作用 [5] 目前, 关于 Sec61 通道主要基因的研究主要集中在微生物 [6] [7] 果蝇和哺乳动物 [8] 对于 Sec61 酌基因的认识仅限于其作为 Sec61 通道一个亚基, 其单独的功能研究鲜见报道本研究中, 作者在构建的凡纳滨对虾 Litopenaeus vannamei 生长性状差减 cdna 文库中筛选并克隆得到凡纳滨对虾 Sec61 酌基因氨基酸序列, 研究了其在不同组织和不同生长期肌肉中的表达模式, 旨在为进一步弄清该基因复合物的结构与功能的关系以及在凡纳滨对虾生长和发育中的作用提供参考资料 1 摇材料与方法 1 郾 1 摇材料实验用凡纳滨对虾取自国家级广西水产研究所南美白对虾良种场选择一个生长性状分离的对虾家系, 在水族箱中暂养 7 d, 充气, 使其适应实验室内养殖环境实验用海水是用盐卤配制的, 盐度为 28, 水温为 28 益实验所用 Taq DNA 聚合酶购自北京百泰克生物技术有限公司 ; SYBR Green Master 荧光定量 PCR 试剂盒 PCR-Select TM cdna Subtraction kit 购自大连宝生物工程有限公司 ; 扩增试剂盒购自 Clontech 公司 ; M -MLV 反转录酶购自 Promega 公司 ; pmd18-t 克隆载体 dntp 购自北京天根生化科技有限公司 1 郾 2 摇方法 1 郾 2 郾 1 摇差减文库的构建摇两组凡纳滨对虾平均体摇收稿日期 : 摇基金项目 : 国家科技支撑计划项目 (2008BADB9B03); 广西直属公益性科研院所基本科研业务费资助项目 ( GXIF ); 国家虾产业技术体系岗位科学家经费资助项目 (nycytx-46) 摇作者简介 : 熊建华 (1976-), 男, 助理研究员 vannamei@ live 郾 cn 摇通信作者 : 陈晓汉, 男, 研究员 chenxhan@ yahoo 郾 com 郾 cn

2 第 5 期摇摇摇摇熊建华, 等 : 凡纳滨对虾内质网膜转运通道蛋白基因 Sec61 酌的克隆及表达分析 447 质量分别为 18 郾 24 g 和 10 郾 33 g, 日龄为 93 d 每组取 10 尾虾, 每尾对虾取 30 mg 肌肉组织, 组内混合后分别提取 RNA 按照 Invitrogen 公司的 Trizol 使用说明书提取并纯化其总 RNA 差减文库构建的具体操作依照 clontech 差减杂交试剂盒 PCR-Se 鄄 lect TM cdna Subtraction kit 的方法进行以较大一组对虾样品 (18 郾 24 g) 作为差减杂交的试验方 (Tester), 以较小一组的对虾样品 (10 郾 33 g) 作为驱动方 (Driver) 试验步骤简述如下 : 将 RNA 依次合成 cdna 第 1 链与双链 cdna, 纯化后经 Rsa I 酶切消化成平末端 cdna 片段, 将试验方连接接头后与驱动方进行两轮杂交, 然后进行抑制性 PCR, 第二轮 PCR 采用的是套式 PCR 引物 (Nested prim 鄄 er 1 和 Nested primer 2R ) SSH 产物按 qiagen pcr 纯化试剂盒的方法纯化, 产物经浓缩后溶于 25 滋 L 10 mmol / L Tris HCl 中采用 T / A 克隆方法, 取纯化的 PCR 产物 3 滋 L, 按 Promega pgem-t Easy Vector Systems 的方法与载体 pgem-t 连接, 形成抑制差减杂交质粒文库取 1 滋 L 连接物与 40 滋 L 感受态细胞 DH10B 混合, 电转化后加入 1 ml SOC 培养液置于 37 益培养箱中, 慢速摇 l h 取 100 滋 L 菌液涂于含 50 滋 g / ml Amp 的 LB / X-gal / IPTG 培养板上, 37 益下培养 14 h 统计培养板上的蓝白菌落数, 计算滴度挑取白斑克隆, 点种于盛有 LB 液体培养基的 384 孔克隆板中, 培养过夜, 加入质量分数为 25% 甘油后于液氮中速冻, -80 益下保存 1 郾 2 郾 2 摇斑点杂交与测序摇从差减文库中挑选阳性克隆, 经细菌培养和抽提质粒后, 利用接头序列引物进行 PCR 扩增, 将产物点膜, 分别与标记的 Tester 和 Driver cdna 作探针进行斑点杂交 42 益下先预杂交 1 h, 然后杂交 18 h, 洗膜, 用 CYCLONE 扫描仪扫描图像, 信号定量并分析试验结果只与 Tester cdna 有杂交信号而与 Driver cdna 无杂交的克隆, 为含 Tester 组特异表达 ; 与 Tester cdna 杂交信号比与 Driver cdna 杂交信号强的克隆, 为上调表达的基因挑选特异性表达和上调表达斑点克隆, 经扩大培养, 提取质粒进行 DNA 序列测定测序工作由上海生工生物工程有限公司完成 1 郾 2 郾 3 摇 RNA 的提取及 cdna 的合成摇分离 6 尾 93 日龄健康对虾的血液以及心脏肝胰腺肌肉胃肠眼柄等器官或组织, 混合相同组织提取总 RNA, 同时分别取日龄健康对虾 ( 各 6 尾 ) 的肌肉组织, 按 Trizol ( Invitrogen) 试剂盒说明书的方法提取各器官或组织的总 RNA 按照逆转录酶 M-MLV 的操作说明将 RNA 逆转录为 cdna, 产物作为 PCR 扩增的模板 1 郾 2 郾 4 摇 Sec61 酌基因的克隆及序列分析摇在 NCBI 搜索 Sec61 基因同源序列, 用 CAP3 程序进行序列拼接根据拼接的序列设计引物 F1 R1 见表 1 PCR 扩增体系为 : 0 郾 5 滋 mol / L 引物各 2 滋 L, 模板 cdna 2 滋 L, PCRmix 10 滋 L, 加水补足 20 滋 L 扩增参数为 : 95 益下变性 30 s, 53 益下退火 30 s, 72 益下延伸 1 min, 如此进行 40 个循环 ; 最后在 72 益下延伸 10 min PCR 扩增产物经 15 g / L 琼脂糖凝胶检测回收后, 与 pmd18 -T 载体连接, 并转入大肠杆菌 DH5 琢感受态细胞中阳性克隆的 PCR 产物送生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司测序使用 NCBI 网站 (http: 椅 www 郾 ncbi 郾 nlm 郾 nih 郾 gov / blast) 的 Blastn 和 Blastx 软件进行同源基因的搜索 ; 使用 Gene Runner 3 郾 05 软件进行开放阅读框的搜索和氨基酸序列的推断 ; 使用 Expasy 工具包 (http: 椅 www 郾 expasy 郾 ch / tools / pi_ tool 郾 html) 进行 PI 和蛋白相对分子质量的预测 ; 用 SignalP 3 郾 0 (http: 椅 www 郾 cbs 郾 dtu 郾 dk / services / SignalP / ) 预测编码蛋白的信号肽, 用 Tmhmm 软件 ( http: 椅 www 郾 cbs 郾 dtu 郾 dk / services / Tmhmm2 郾 0) 进行跨膜区预测用 Clustalx 2 软件对氨基酸的多序列进行排列 ; 使用 Mega 4 郾 1 软件的邻接法构建 NJ 系统树 (Neighbor-joining tree), 设置次 bootstraps 进行评估 1 郾 2 郾 5 摇实时荧光定量 PCR 摇实时荧光定量 PCR 是在 ABI 7500 Fast Real-Time PCR 仪上完成的根据 Sec61 酌基因 cdna 序列设计特异定量引物 Sec1 Sec2, 根据凡纳滨对虾内参序列设计 Beta-actin 特异引物 Actin1 Actin2 ( 表 1) 20 滋 L 的 PCR 反应体系中含有 : 2 滋 L cdna, 9 滋 L SYBR Green Mas 鄄 ter mix, 5 滋 L RNAase-free H 2 O, 上游和下游引物 (0 郾 5 滋 mol / L) 各 2 滋 L 扩增参数为 : 95 益下预变性 30 s ; 95 益下变性 5 s, 55 益下退火 34 s, 共进行 40 个循环同一样品的内参和目的基因在同一板中进行, 每个样品做 3 个重复实时定量 RT- PCR 反应及信息的收集都在 ABI 7500 Fast Real - Time PCR 仪中进行采用 2 驻驻 Ct 法计算 Sec61 酌基因 mrna 的相对表达量, 不同组织中的表达分析设定肌肉组织 Sec61 酌基因 mrna 的表达量为 1, 不同时期表达分析设定 10 日龄 Sec61 酌基因 mrna 的表达量为 1

3 448 大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 26 卷 2 摇结果与分析 2 郾 1 摇 cdna 文库的构建与质量检测本试验中成功构建了生长性状差减文库, 共获 Tab 郾 1 摇表 1 摇得个克隆随机挑选 24 个单克隆, 以载体特异的 M13 正向引物和 M13 反向引物进行 PCR 扩增, 大小分布在 300 ~ bp, 平均插入片断大小为 600 bp 左右本试验中所用引物的序列 Primer sequences used in the study 引物 Primer 序列 (5 忆寅 3 忆 ) Sequence (5 忆寅 3 忆 ) 用途 Purpose F1 GGATGTGACGTCAGCGTGACGT 正向引物扩增全长编码区 R1 CCTGAAGTCTTAACCTACAAAC 反向引物扩增全长编码区 Sec1 TTCGATGAGGCTCCTCAAACGTTG real-time PCR 上游引物 Sec2 ATGCCGTCGTTCACTCTTCGTGAG real-time PCR 下游引物 Actin1 GGGCGATGATCTTGATCTTCATGG Actin real-time PCR 上游引物 Actin2 GACGTGGACATCCGTAAGGACCTG Actin real-time PCR 下游引物 2 郾 2 摇斑点杂交将抑制消减文库 PCR 中鉴定为单一条带的产物点于尼龙膜上, 共获得 768 个基因片段的点阵膜, 经变性中和及固定后与标记的探针进行杂交将杂交后的信号曝光在 X-ray film 上 ( 图 1), 挑选较大对虾和较小对虾杂交信号差异显著的克隆进行测序, 从中选取一个 420 bp 的差异基因片段 A 为大的对虾 cdna 探针杂交的结果 ; B 为小的对虾 cdna 探针杂交的结果 ; 方框内表示 Sec61 酌基因位点 Note: A is the result of big shrimp cdna probe hybridization; B is the result of shrimp cdna probe hybridization; The insert box is lo 鄄 cus of Sec61 酌. 图 1 摇 cdna 点阵膜杂交的结果 Fig 郾 1 摇 The results of cdna bitmap membrane hybrid 2 郾 3 摇目的基因 cdna 序列的特征经过同源序列搜索序列拼接并设计引物, 经克隆得到的 Sec61 酌基因 cdna 序列长为 500 bp, 包含 270 bp 的开放阅读框 (ORF), 含 1 个 ATG 启动子和 1 个 TGA 终止子在编码 89 个氨基酸中, 带正电的氨基酸 (Arg 和 Lys) 有 15 个, 带负电的氨基酸 ( Asp 和 Glu) 有 6 个理论等电点 I 为 10 郾 58, 预测的相对分子质量大小为编码的氨基酸序列经 Expasy 推测在 14 ~ 42 氨基酸处存在 1 个 Sec61 酌标签经 Tmhmm 预测 Sec61 酌在 39 ~ 61 氨基酸处有 1 个跨膜螺旋 ( 图 2), 用 SignalP 3 郾 0 软件预测无信号肽 2 郾 4 摇氨基酸序列比对及系统进化分析 Blastp 搜索结果表明, 凡纳滨对虾 Sec61 酌基因的编码氨基酸序列与其它物种的同源性较高, 但较稳定与有爪蟾蜍 Xenopus laevis 和穴居狼蛛 ly 鄄 cosa singoriensis 的相似性为 84% ; 与小家鼠 Mus musculus 文昌鱼 Branchiostoma floridae 智人 Ho 鄄 mo sapiens 和玻璃海鞘 Ciona intestinalis 的相似性均为 83% ; 与囊舌虫 Saccoglossus kowalevskii 的相似性为 77% ( 图 3) 所有分析物种与凡纳滨对虾 Sec61 酌基因跨膜螺旋区域 (39 ~ 61 氨基酸 ) 的序列一致运用 Mega 4 郾 1 软件构建凡纳滨对虾 Sec61 酌基因和 GenBank 中 12 个物种 Sec61 基因氨基酸序列系统进化树 ( 图 4), Sec61 酌基因氨基酸序列严格按照种属关系聚成两大支, 分别是植物组和动物组另外, 凡纳滨对虾所在的甲壳纲在进化上与蛛形纲和肠鳃纲较近, 而与昆虫纲和脊椎动物亚门较远使用 Mega 4 郾 1 软件的邻接法构建 NJ 系统树, 并用 bootstraps 进行了次评估系统树绘制所用基因的 GenBank 登录号如下 : ACG76276 郾 1 Amblyomma americanum ( 美洲钝眼蜱 ), XP _ 郾 1 Ixodes scapu ( 肩硬蜱 ), ABX75489 郾 1 Lycosa singoriensis ( 穴居狼蛛 ), XP _ 郾 1 Branchiostoma floridae ( 文昌鱼 ), XP _ 郾 1 Saccoglossus kowalevskii ( 囊舌虫 ),XP _ 郾 1 Pediculus humanus corporis( 体虱 ),NP_ 郾 1 Ho mo sapiens( 智人 ),XP_ 郾 1 Musmusculus

4 第 5 期摇摇摇摇熊建华, 等 : 凡纳滨对虾内质网膜转运通道蛋白基因 Sec61 酌的克隆及表达分析 449 注 : 起始密码子由灰色阴影显示, 终止密码子以 * 表示, 冶表示 Sec61 酌标签位点, 阴冶为跨膜螺旋区域 Note: The start codon (atg) is shown by gray shadow and the stop codon (taa) indicated by an asterisk. The sec61 酌 signature is underlined with a single line and the transmembrane region is in box 图 2 摇 Sec61 酌基因 cdna 的核甘酸序列及其推导的氨基酸序列摇摇摇摇摇摇摇 Fig 郾 2 摇 The cdna nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Sec61 酌 gene 图 3 摇凡纳滨对虾的 Sec61 酌基因和其它物种 Sec61 基因的氨基酸序列比对摇摇摇摇摇摇 Fig 郾 3 摇 Comparison of Sec61 酌 gene amino acid sequences in the Pacific white leg shrimp with other species. ( 小家鼠 ), NP_ 郾 1 Xenopus laevis ( 有爪蟾蜍 ), NP_ 郾 1 Ciona intestinalis ( 玻璃海鞘 ), ADD20301 郾 1 Glossina morsitans ( 刺舌蝇 ), ABK21891 郾 1 Picea sitchensis ( 北美云杉 ), ADB02901 郾 1 Jatropha curcas ( 麻疯树 ), XP _ 郾 1 Vitis vinifera ( 葡萄 ) 2 郾 5 摇 Sec61 酌基因的组织表达分布及在不同生长期肌肉中的表达用实时荧光定量 PCR 方法检测凡纳滨对虾 Sec61 酌基因在不同组织中的表达情况, 结果如图 5 所示从图 5 可见 : Sec61 酌基因在所检测的组织中都有表达, 其中在肌肉中的表达量最高, 其次是胃肝胰腺心脏眼柄以及血, 最低的是肠 Sec61 酌基因在对虾不同生长时期肌肉中的相对表达量各不相同, 在 45 日龄对虾肌肉中的表达量最低, 在 10 日龄对虾肌肉中的表达量最高, 为 45 日龄的 27 郾 6 倍 3 摇讨论生物细胞中大多数蛋白 ( 包括许多细胞器蛋白 ) 常常通过内质网 ( ER) 进行运输内质网蛋白质转运通道 Sec61 复合体具有 3 种蛋白亚基 Sec61 琢 Sec61 茁和 Sec6 酌, 其中 Sec61 琢具有 10 个跨膜区, 而 Sec61 茁和 Sec61 酌仅有一个跨膜区 [9-10] 本研究中涉及的 Sec61 酌基因也是一个跨膜蛋白 ( 图 2), 跨膜螺旋区域位于 39 ~ 61 氨基酸处与其它物种的氨基酸序列进行比对, 结果表明 : 凡纳滨对虾 Sec61 酌基因与有爪蟾蜍和穴居狼蛛的相似性为 84 %, 与小家鼠文昌鱼智人和

5 450 大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 26 卷图 4 摇构建的 Sec61 酌基因氨基酸序列的系统进化树 Fig 郾 4 摇 Phylogenetic tree of Sec61 酌 gene amino acid sequences Fig 郾 5 摇图 5 摇 Sec61 酌基因在对虾不同生长期的肌肉中以及在不同组织中的相对表达量 Expression of Sec61 酌 gene in the muscles of different organs / tissues during different growth periods 玻璃海鞘的相似性均为 83%, 与囊舌虫的相似性为 77%, 与所比对的 7 种物种在凡纳滨对虾 Sec61 酌基因的跨膜螺旋区域处的氨基酸序列完全一致 ( 图 3) 这表明该氨基酸的跨膜区域是高度保守的, 推测 Sec61 酌的跨膜区域对于其功能的发挥具有重要的作用由构建的 NJ 进化树体系可知 ( 图 4), 其由两个主要分支组成, 动物和植物分别聚为一簇, 同属一纲的物种也相应聚成一个分枝, 准确地体现了物种的进化关系进化树还显示, 凡纳滨对虾所属的甲壳纲在进化上同蛛形纲和肠鳃纲较近, 而与昆虫纲和脊椎动物亚门较远, 这为我们进一步研究节肢动物门中多个纲的进化关系及起源提供了参考资料摇摇本研究中涉及的 Sec61 酌基因通过实时荧光定量 PCR 方法检测到其在血液以及心脏肝胰腺肌肉胃肠眼柄等器官或组织中都有表达, 且在肌肉中表达量最高凡纳滨对虾的出肉率高达 53 郾 03% ~ 53 郾 81% [11], 因此对虾的生长主要体现在肌肉的生长生长快的对虾, 其肌肉的生长也相应较快, 同时需要大量蛋白质和必需氨基酸, 而 Sec61 酌蛋白的大量表达则可能促进肌肉细胞蛋白质的合成以及增加物质运输另外, Sec61 通道是

6 第 5 期摇摇摇摇熊建华, 等 : 凡纳滨对虾内质网膜转运通道蛋白基因 Sec61 酌的克隆及表达分析 451 内质网膜上的一个双向转运蛋白的通道 [12], 在形成一个疏水通道让新生多肽通过的同时, 也可能促进肌肉代谢中产生的蛋白质降解产物的快速运输, 从而保证肌肉细胞代谢活动的正常运行本研究结果表明, Sec61 酌基因在对虾不同生长期肌肉中的表达量各不相同, 其中在 10 日龄对虾肌肉中表达量最高, 45 日龄时表达量最低, 80 日龄时表达量又大幅上升, 125 日龄时表达量又回落, 结果有待在不同家系的对虾中进一步验证下一步将对 Sec61 复合体其它蛋白亚基 Sec61 琢 Sec61 茁的表达模式进行研究, 这将有助于人们更深入地探讨 Sec61 基因的功能参考文献 : [1] 摇 Cannon K S,Or E,Clemons W M Jr,et al. Disulfide bridge forma 鄄 tion between Sec61 酌 and a translocating polypeptide localizes the translocation pore to the center of Sec 酌 [ J]. Cell Biol,2005,169 (2): [2] 摇 Beckmann R,Bubeck D,Grassucci R,et al. Alignment of conduits for the nascent polypeptide chain in the ribosome Sec61 complex [ J]. Science,1997,278(5346): [3] 摇 Cheng Z,Jiang Y,Mandon E C,et al. Identification of cytoplasmic residues of Sec61pinvolved in ribosome binding and cotranslational translocation[ J]. Cell Biol,2005,168: [4] 摇 Rapoport T A,Rolls M M,Jungnickel B. Approaching the mecha 鄄 nism of protein transport across the ER membrane[ J]. Curr Opin Cell Biol,1996,8(4): [5] 摇 Heinrch S U,Mothes W,Brunner J,et al. The Sec61p complex me 鄄 diates the integration of a membrane protein by allowing lipid parti 鄄 tioning of the transmembrane domain [ J]. Cell,2000,102: [6] 摇 Or E,Boyd D,Gon S,et al. The bacterial ATPase SecA functions as a monomer in protein translocation[ J]. Biol Chem,2005,280: [7] 摇 Valcarcel R,Weber U,Jackson D B,et al. Sec61 beta,a subunit of the protein translocation channel,is required during Drosophila de 鄄 velopment[ J]. Cell Sci,1999,112: [8] 摇 Meyer H A,Grau H,Kraft R,et al. Mammalian Sec61 is associated with Sec62 and Sec63[ J]. Biol Chem,2000,275: [9] 摇 DIatchenko L,Lau Y F,Campbell A P,et al. Suppression subtrac 鄄 tive hybridization:a method for generating differentially regulated of tissue-specific cdna probes and libraries[ J]. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93: [10] 摇 Wickner W,Schekman R. Protein translocation across biological membranes[ J]. Science,2005,310: [11] 摇 Becker T,Bhusshan S,Jarasch A,et al. Structure of monomeric yeast and mammalian Sec61 complexes interacting with the transla 鄄 ting ribosome[ J]. Science,2009,326: [12] 摇陈晓汉, 陈琴, 谢达祥. 南美白对虾含肉率及肌肉营养价值的评定 [J]. 水产科技情报,2001(4): Cloning and expression of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei Sec61 酌 gene encoding endosplasmic reticulum membrane translocation channel protein XIONG Jian-hua 1, SHENG Xiao-wei 1,2, GAO Yong-hua 1,2, LI Wen-lan 2, YANG Yan-hao 1, CHEN Xiao-han 1 摇摇摇 (1. Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Health Cultivation, Guangxi Institute of Fisheries, Nanning , China; 2. College of Chemistry and Bioengineering, Guilin University of Technology, Guilin , China) Abstract: A subtracted cdna libraries of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei on growth was construc 鄄 ted, and Sec61 酌 gene of the shrimp was obtained by dot blot and cloning. There was a 270 bp open reading frame( ORF) encoding 89 amino acids( aa) in the sequence whose molecular weight was predicted to be with theoretical isoelectric point of Quantitative real time PCR was used to assess the mrna expression of Sec61 酌 in different tissue and different growth period. The expression was detected in the heart, hepatopancreas, muscles, stomach, bowel, eye hilt and blood. The maximal expression level was observed in the muscle, while the minimal in hepatopancreas; the expression of Sec61 酌 in different growth period showed that the maximal expres 鄄 sion level in muscles was found in 10 day old shrimp, while the minimal was found in the 45 day old shrimp. Key words: Litopenaeus vannamei; Sec61 酌 gene; suppression subtractive hybridization (SSH); real time PCR

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽