密级 内部5年 论文编号：

Transcription

1 密级内部 5 年论文编号 : 中国农业科学院 学位论文 我国小麦主要品种的选择牵连效应分析 Selection Sweeps in Chinese Major Cultivars of Triticum aestivum L. 博士研究生 : 盖红梅 指导教师 : 张学勇研究员 申请学位类别 : 农学博士 专 业 : 作物种质资源学 研究方向 : 小麦应用基因组学 培养单位 : 作物科学研究所 研究生院 提交日期 2008 年 6 月

2 Secrecy: secret No. Chinese Academy of Agricultural Sciences Ph.D Dissertation Selection Sweeps in Chinese Major Cultivars of Triticum aestivum L. Ph.D Candidate: Ge Hong-mei Supervisor: Major: Specialty: Institute: Prof. Zhang Xue-yong Crop Germplasm Wheat Applied Genomics Institute of Crop Science Chinese Academy of Agricultural Sciences June, 2008

3 摘要 小麦是我国主要粮食作物之一, 其生产发展离不开品种的改良和提高, 拥有并认知优异 ( 良 ) 种质材料是育种成功的关键 金善宝 (1983) 和庄巧生 (2003) 在总结和分析我国小麦育种时发现, 虽然有大量的品种和育种材料参与了我国的新品种形成, 但仅有 20 个左右在我国小麦育种中发挥了举足轻重的作用, 并称这些材料为育种骨干亲本 从基因组水平来理解和认识骨干亲本, 将为未来小麦育种奠定良好的理论基础 在作物的驯化与育种中, 自然选择和人工选择是促进基因组进化的主要动力, 它们推动作物向着既适应特定生态环境又满足人类需要的方向发展 随着分子生物学及植物基因组学的不断发展, 近年来选择牵连效应和标记 / 性状关联分析广泛应用于人类及动 植物的复杂性状解析中, 跟踪分析自然和人工选择所留下的痕迹, 为研究人类的遗传疾病 生物的种群分化 动植物品种的衍替提供了新的思路 本文通过对两套小麦品种的全基因组高密度标记扫描分析, 试图寻找到基因组中经历选择的 痕迹, 通过标记 / 性状关联分析, 研究关键基因组区段控制 ( 影响 ) 的主要农艺性状, 探讨骨干亲本易出品种的原因, 分析重要区域关键位点的等位变异组成和分布规律, 并根据关键位点的信息进行亲本选择和组合预测 主要研究结果如下 : 1. 对我国 66 份大面积推广的小麦品种和 13 份育种骨干亲本在 481 个 SSR 位点进行了基因型扫描分析,NJ 聚类分析表明, 我国大面积推广品种可聚成 6 个大组, 每一组中至少有一个骨干亲本 系谱分析表明, 除衍生大面积推广品种之外, 原有骨干亲本还是新一代骨干亲本的奠基者 ; 虽然如此, 骨干亲本之间仍存在较大的遗传差异 骨干亲本碧蚂 4 号 郑引 4 号携带的优势等位变异数多于大面积推广品种碧蚂 1 号和郑引 1 号 2. 对阿勃和郑引 4 号衍生品种的遗传组成分析表明 : 育种选择存在很强的偏向性, 阿勃的后代材料, 尤其是第一 二代材料, 多为其基础上的修修补补 虽然 PCO 分析表明这两套材料为相对独立的群体, 但在全基因组范围内找到的 V 字形选择谷, 在这两套材料间的一致性非常好, 能够相互验证 且已克隆的关键基因和定位的主效 QTLs 多定位在 V 字形选择谷内, 表明这些选择谷与重要性状密切相关 3. 在 PIC 比较低的位点, 阿勃和郑引 4 号共享的等位变异比较多, 如果骨干亲本携带的是优异等位变异, 则其在后代材料中高频率保留, 反之, 则会被迅速替代 ; 在 PIC 比较高的位点, 阿勃和郑引 4 号携带的等位变异的一致性和阿勃与中国春之间无明显差异 4. 本研究根据现有群体对小麦基因组的连锁不平衡进行了探讨, 结果表明 A 基因组的连锁不平衡程度最高, 而 B 基因组的连锁不平衡程度最弱, 可能与 A 基因组经历了很强的选择压 B 基因组供体拟斯卑尔脱山羊草是异花授粉习性有关 并结合 5D 染色体引物个数对检测选择谷的模拟, 建议在进行小麦全基因组关联分析时, 标记间的遗传距离最好控制在 5cM 以内 5. 半个多世纪的小麦育种, 使品种农艺性状发生了较大变化, 株高呈降低趋势, 尤以 70 年代育成品种的株高降低幅度最大 ; 千粒重呈平稳上升趋势, 有效分蘖呈减少趋势, 但变幅不大 I

4 综合多个性状的表现,2000 年以后的小麦品种在多个性状上达到比较协调的水平 6. 全基因组关联分析发现许多 V 字形选择谷是重要性状基因的集聚区 第 部分同源群上关联的性状比较多 第 2 部分同源群主要受 Ppd 基因及 Rht8 基因的影响, 相关联的性状主要有穗粒数 穗长 穗密度 株高等 ; 第 5 部分同源群影响的性状较多, 包括千粒重 粒形 株高 穗长及籽粒蛋白质含量和淀粉含量等 ; 第 6 部分同源群主要影响千粒重 粒形 成熟期 有效分蘖 穗长等性状 许多关联上的性状与已克隆的重要基因和主效 QTLs 定位的结果基本一致 因此, 关联分析与 QTL 作图互相补充, 相互验证, 是进行农作物数量性状作图的有效途径 7. 对部分关联位点等位变异的表型差异进行了分析, 结果表明, 多数优势等位变异为优异等位变异 ; 同时, 在遗传多样性较高的位点上明确了一些新的优异等位变异, 为小麦分子标记辅助育种提供了重要线索 8. 一份材料在育种中的价值可以通过关键位点的基因型组成进行预测, 初步结果表明 : 阿勃 五一麦和矮孟牛 小偃 6 号是比较优异的杂交组合, 以往的育种实践证明这两组合是成功的, 前者衍生了甘麦 8 号等品种, 后者衍生了小偃 22; 此外, 攀 矮孟牛 攀 矮丰 3 号也是互补性非常好的组合, 我们已从其 F 2 群体中筛选到矮秆 大穗 多粒 饱满的优异单株 因此, 更深入的工作有可能将组合选配从 性状互补 提升到在此基础上的基因组互补 总之, 资源的创新和突破是选育大面积推广品种的基础, 新的 更优异的等位变异可能存在于小麦的祖先种 地方品种或野生近缘植物中, 有必要通过杂交 回交, 发现 引进和利用这些材料中隐藏的优异等位变异, 为小麦育种的突破奠定基础 关键词 : 小麦品种改良, 骨干亲本, 选择牵连效应, 关联分析, 设计育种 II

5 Abstract Wheat is the second major food crop in China. Wheat improvement has contributed greatly to the national food production. It is very important for breeders to conserve and master a set of excellent genetic germplasms. After pedigree analysis of Chinese wheat cultivars, Prof. Jin Shan-bao (1983) and Zhuang Qiao-sheng (2003) considered that there only 20 wheat breeding lines played important roles in national wheat breeding though many cultivars (lines) were used in breeding program. They call these lines as cornerstone breeding lines (founder genotypes). Understanding these founders at genomic level will benefit future wheat breeding. During domestication and improvement of crops, natural and artificial selection were promoting the crop evolution, which have driven crop to adapt environments and meet human needs. Great progress of molecular maker and high density linkage maps make hitchhicking effect analysis and marker/trait association mapping being widely adopted in disscecting complex traits. This also makes it possible for us to follow the tracks of selection within genomes. 1. In this dissertation, 66 varieties cultivated in large scale (VCLs) and 12 founder genotypes in China were scanned at 481 SSR loci. Neighbor Joining cluster analysis showed that VCLs were clustered into 6 major groups and each group cotained at leat one founder. Pedigree analyses indicated that the founders created not only VCLs but also new founder genotypes. Further, great differentiation exists among the founder genotypes. Bima-4 and Bima-1, St and St were two pairs of sister lines from the same crosses respectively, but Bima-4 and St convery more alleles favored in breeding than Bima-1 and St respectively. 2. Analysis of the genomic information inherited from Abbondanza and St to their derivatives reveals strong preferred selection in wheat breeding, i.e. first and second generation cultivars derived Abbondaza were very much similar to Abbondanza than to other parents. Selection sweep valleys co-exist between derivatives of the two founders, Abbondanza and St , even though PCO analysis showed that they were two independent populations. Isolated key genes and major QTLs were located in or near these selective sweep valleys. 3. After comparison the allelic componenets of Abbondanza-CS and Abbondanza-St , we found that Abbondanza and St shared more alleles than Abbondanza and CS at loci with lower PIC. If excellent alleles possessed by founders at the critical genomic regions, then these alleles were transfered to their derivatives in high frequency. Otherwise, they were replaced by other excellent alleles rapidly. 4. In the three genomes, wheat genome A had the highest linkage disequlibrium (LD) and wheat genome B had the lowest LD which may relate to the out-cross pollination nature of genome B III

6 ancestor Ae.speltoides Tausch. LD analysis and simulations suggest that one locus should be genotyped for each 5cM to detect most of the V valleys in wheat. 5. Analysis of major agronomic characters of cultivars bred at different time showed that plant height (PH) reduced significantly especially during 70s, 1000 grain weight (TGW) rise steadily and little changes occurred in fertile tillers (FT). Cultivars released after 2000 show more coordinate in multi agronomic traits. 6. Association mapping revealed that most V selective sweep valleys were regions of gene clustering. Group 2, 5 and 6 convey more breeding traits. Loci on homoeologous group 2 associated with grain number (GN), spike length (SpL), spike density (SD) and plant height etc, which are related to Ppd and Rht8 genes. Loci on Group 5 mainly associated with TGW, grain shape, PH, SpL, protein content (PC) and starch content (SC). And the loci on group 6 associated with TGW, grain shape, maturity period (MP), FT and SpL etc. Therefore, association mapping is an effective strategy for complex quantitative traits dissection. 7. Evaluation the phenotype associated with different alleles suggested that most of the major alleles are favored ones in breeding with excellent phenotypes. However, we also found new excellent alleles at several loci with moderate PIC value. 8. Allelic genotyping at crucial loci make it possible to predicate breeding value of a line. Our preliminary results showed that Abbondanza Wuyimai and Aimengniu Xiaoyan No.6 should be excellent combination for breeding. Very good cultivars such as Ganmai 8, Xiaoyan 22 etc were created from the two crosses in Chinese wheat breeding. Furthermore, we also predicated Pan Aimengniu and Pan Aifeng-3 are also excellent cross, from which we obtain lines with short stem, big spike, multi- florets etc. Innovation and breakthrough of germplasm is the base for breeding of new cultivars, especially those cultivated in large scale. New excellent alleles may exist in wheat ancestors, landraces and wild relatives. Therefore, we should go back nature to find better alleles via advanced QTL backcross. Key Words: Wheat Improvement; Founder Genotypes; Hitchhicking Effects; Association Mapping; Design Breeding IV

7 目录 第一章引言 我国小麦育种概况 小麦品种改良 大面积推广品种 育种骨干亲本 种质创新与育种 选择牵连效应与遗传作图 自然选择和人工选择 群体中的定向选择 育种中的选择 选择对基因组的影响 选择牵连效应 关联分析作图 连锁不平衡 群体结构 关联分析作图 分子设计育种 本研究的目的和意义 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 材料与方法 研究材料 研究方法 数据统计分析 结果与分析 我国小麦大面积推广品种及骨干亲本的遗传多样性分析 我国小麦育种骨干亲本与大面积推广品种的 Neighbor Joining 聚类分析 V

8 2.2.3 我国小麦大面积推广品种及育种骨干亲本的系谱分析 来自相同组合的骨干亲本和大面积品种的遗传组成分析 讨论 种质遗传基础的拓宽是育种工作的基础 种质创新是育种取得突破的前提 骨干亲本与新品种选育 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代染色体保守遗传区段浅析 材料与方法 实验材料 研究方法 数据统计分析 结果与分析 阿勃衍生材料与郑引 4 号衍生材料为两个相互独立的群体 阿勃及郑引 4 号在全基因组水平上的保守遗传信息研究 阿勃及郑引 4 号的保守遗传的染色体区段分析 不同保留比例 SSR 位点 PIC 在染色体上的分布 阿勃和郑引 4 号在全基因组水平的一致性检测 连锁不平衡估计 讨论 保守遗传的 SSR 位点在阿勃和郑引 4 号所衍生的两套材料间基本一致 V 字形选择谷与重要性状有关 寻找 V 字形选择信号所需最低标记密度的估计 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 材料与方法 实验材料 研究方法 数据统计分析 VI

9 4.2 结果与分析 不同年代小麦主要农艺性状演变 小麦不同农艺性状间的相关关系 群体结构检测 全基因组关联分析 关联位点不同等位变异的性状比较 讨论 小麦农艺性状向协调方向发展 关联分析是进行数量性状定位的有效方法 优势等位变异与优异等位变异 第五章小麦分子设计育种初探 - 亲本选配 材料与方法 实验材料 研究方法 结果与分析 讨论 基因组水平亲本选配及组合预测方法初步探讨 分子设计育种的进一步发展思路 第六章全文结论 参考文献 附录 致谢 作者简介 VII

10 第一章引言 第一章引言 小麦是世界上种植面积最大 总产量最高的粮食作物, 在中国是仅次于水稻的第二大粮食作物 小麦品种改良在小麦生产中的作用不容忽视, 其科学改良在我国已有近 90 年的历史, 新中国成立以来, 这项事业取得了很大的进展, 先后育成了近 2000 个优良品种, 每年 轮番 在农业生产第一线 服役 的就有 300~400 个, 其中不乏出类拔萃的佼佼者, 仅年种植面积在 hm 2 以上的品种就超过 60 个 ( 庄巧生,2003) 拥有并认知优异 ( 良 ) 种质材料是育种成功的关键 拥有的数量越多, 对材料的认识越深, 成功的把握性就越大 金善宝和庄巧生等在总结和分析我国小麦育种时发现, 虽然有大量的品种和育种材料参与了我国的新品种形成, 但仅有 20 个左右在我国小麦育种中发挥了举足轻重的作用, 并称这些材料为育种骨干亲本 ( 金善宝,1983; 庄巧生,2003) 遗传变异是生物进化的基础, 选择是进化的动力, 并决定着进化的方向 在作物的驯化与栽培史中, 自然选择和人工选择是促进基因组进化的主要动力, 它们推动作物向着既适应特定生态环境又满足人类需要的方向发展 对控制优异性状基因的选择, 会引起该基因两侧中性位点多样性的下降, 这种现象称为选择牵连效应 (Hitchhicking Effects,Selection Sweep), 最早由 Smith 和 Haigh 于 1974 年提出 70 年代末的相关研究多数集中在从群体遗传学角度对这种现象的进一步阐述和模拟 (Hedrick & Holden,1979;Charlesworth,1979) 选择牵连效应为解析复杂性状提供了新思路 (Barton,2000; 张学勇等,2006), 并被广泛用于人类和动植物复杂数量性状的定位和基因挖掘研究 (Schlotterer et al.,2003) 同时, 近几年发展起来的以连锁不平衡为基础的标记 / 性状关联分析也为复杂性状的解析提供了很好的思路和方法 (Remington et al.,2001;lowe et al., 2007;Bierut et al.,2007) 借助这些思路和方法对骨干亲本进行研究, 可以将骨干亲本成功的历史经验上升到理论水平, 促进作物功能基因组学和育种学的研究和发展, 并为小麦分子设计育种奠定基础 Peleman(2003) 提出分子设计育种 (Breeding by Design) 概念, 即通过大量渐渗系的形态鉴定和基因型分析, 发现一些来自不同供体亲本或同一供体的优异等位变异, 再通过渗入系间杂交, 将不同位点上的优异等位变异综合于一体, 直接用于生产或通过分子标记辅助选择, 培育出优异品种 随后, 这一思想体系引起学术界广泛兴趣, 并从不同的方面将这一概念进行了发展 (Varshney et al.,2005; 万建民,2006; 张学勇等,2006) 随着分子生物学和基因组学的飞速发展及生物信息数据库的不断完善, 设计育种将在基因组学和育种学之间搭起一座桥梁, 从基因组学水平为育种家提供亲本选配和后代选择策略, 提高育种效率 ( 万建民,2006; 张学勇等,2006) 1.1 我国小麦育种概况 高产 优质 多抗 高效是作物品种改良的永恒目标 作物育种的成效取决于材料是否恰当 和方法是否正确, 其中材料起着决定性的作用, 小麦也不例外 由于我国小麦分布范围广, 气候 1

11 面积 ( 面积万 ha) (hm 单产 2 ) 单产 (kg/ha) (Kg/ hm 2 ) 总产 (mt) 中国农业科学院博士学位论文 第一章引言 和土壤多样, 耕作制度复杂, 加之小麦栽培历史悠久, 因此在漫长的自然选择和人工选择过程中, 形成了丰富多彩的小麦种质资源 小麦种质资源主要包括地方品种 育成品种 原始栽培类型 野生近缘种及人工创造的种质资源, 其中, 育成品种由于其具有较好的丰产性与较广的适应性, 一般被用作育种的基础材料 小麦品种改良 从庄巧生先生 (2003) 总结的 1949~2000 年我国小麦种植面积 总产量和单产的动态变化图和中国农业年鉴 1950~2004 年总产 单产和面积的变化趋势图 ( 图 1.1) 可以看出, 在小麦总产量的增长中, 扩大面积与提高单产都起了重要的作用, 但不同时期两者的贡献率不同 在 20 世纪 50 年代, 面积扩大和单产提高对总产量的贡献率分别为 42.4% 与 57.8%; 随着年代的增长, 种植面积的贡献率越来越小,90 年代的种植面积为负增长, 总产量的提高全是单产提高的结果, 小麦单产的提高很大程度上依赖于小麦品种改良 但是进入新世纪后, 小麦总产对种植面积的依赖性明显增强, 表现在总产随着播种面积波动而波动, 究其原因, 与城镇化建设速度的加快, 大量的良田变成了城镇或公路密不可分 因此, 未来小麦增产很大程度上依赖于单产的提高 ( 李振声,2008) 面积 ( 万 ha) 单产 (kg/ha) 总产 (mt) 年 图 年我国小麦种植面积 单产和总产量 ( 中国农业年鉴 2005) Fig. 1.1 Wheat area, yield and production from 1950 to 2004 in China 改良品种是各国提高单产的主要措施 1997 年前国家科委中国科技促进发展中心和中国农业科学院农业宏观研究室报道了 1985~1994 年间对五大作物 ( 水稻 小麦 玉米 大豆 棉花 ) 在 10 个主产省 ( 自治区 ) 所种植的优良品种和对照种的单产 推广面积及其占播种面积的比例和单位面积施肥量等进行了调查, 并建立良种贡献率的计算模型以估算出遗传改良对作物增产的贡献 结果表明, 小麦品种的贡献率为 30.9% 1954~1979 年间, 小麦新品种对增产的贡献率为 17%, 而且与环境因素存在较大关系 (Feyerherm et al.,1984) 20 世纪 50~60 年代, 随着矮秆基因资源的发现 人工合成制剂 ( 化学肥料 杀虫剂 杀菌剂和除草剂 ) 以及高效灌溉设施在农作物生产中的应用, 主要农作物 ( 小麦和水稻 ) 单产大幅度提高, 导致了第一次绿色革命 (Conway, 2

12 第一章引言 1999) Evenson 和 Gollin(2003) 探讨了第一次绿色革命后作物品种改良对产量的巨大贡献 生产实践证明, 不断选育和推广优良品种, 是提高产量最经济有效的措施 而且产量越向高产阶段发展, 品种的地位就显得越重要 因而, 选育和推广良种是促进生产 发展经济的有效措施之一 ( 王江春,2006) 目前各国在小麦品种改良上多以高产稳产为首要目标, 并很重视品质的改进 在抗逆稳产性方面十分重视品种的抗病虫性与广泛适应性, 并从专一抗性发展到广谱抗性, 并注重多抗品种的培育 在抗病育种中注意把垂直抗性与水平抗性 (Vandeplank,1963) 抗侵入与抗扩展结合起来, 使育成品种的抗性更为持久 (Johnson & Law,1973;Griffey,1993) 因此, 根据育种目标不断进行品种改良对作物生产及粮食安全具有重要意义 大面积推广品种 数以万计的品种对小麦生产做出了重要贡献, 尤其是大面积推广的小麦品种 1964~1969 年美国由于推广高产 矮秆 高抗条锈病的品种格恩斯与纽格恩斯 (Nugaines)( 孙剑,2006), 华盛顿州的小麦单产比 1958~1962 年提高 25% 在前苏联,60 年代中后期由于推广无芒 1 号 ((Bezostaya 1) 和米罗诺夫 808 两个高产品种, 每年增产小麦 200~350 万吨 在法国, 推广冬小麦舒瓦极星 (Etoile de Choisy) 使南部地区小麦单产由平均每公顷 2500kg 提高到 4000kg 60 年代以来, 墨西哥由于选育推广半矮秆高产品种, 配合以相应的栽培措施,1968~1969 年全国小麦平均产量每公顷 2680kg, 比 50 年代初期提高两倍多, 至 80 年代已增长到每公顷约 4000kg ( 中国从 1949 年以来陆续育成和推广了大批丰产抗病品种, 多数地区已实现 4~5 次品种更换 1960 年前后, 北方冬麦区的碧蚂 1 号 南方冬麦区的南大 2419, 种植面积曾分别达到 600 万公顷和 467 万公顷 ;1970 年前后, 济南 2 号 北京 8 号 内乡 5 号种植面积都在 100 万公顷以上 ; 1980 年前后, 泰山 1 号种植面积达 374 万公顷, 丰产 3 号 博爱 7023 绵阳 11 的面积也都超过 100 万公顷 ; 至 80 年代中期, 济南 13 百农 3217 种植面积均达到 140 万公顷左右 庄巧生 (2003) 总结了 59 个年种植面积超过 m 2 以上的品种, 并对其在生产上的使用年限和地区来源进行了总结分析 其中, 博爱 7023 的种植面积超过 hm 2 的年数最长为 9 年, 而南大 2419 在生产上的使用寿命最长, 种植了 41 年 (1942~1982), 其次为阿勃 38 年 (1961~1998) 最近几年又陆续出现了豫麦 18 郑麦 9023 济麦 20 烟农 19 扬麦 158 邯郸 6172 等超千万亩品种 育种骨干亲本 育种工作实际上就是对遗传资源的科学加工, 对资源了解得越透彻, 组合配制越科学, 越容易选出好的亲本材料 目前, 大多数育种家每年都要配置数百或上千个杂交组合, 但真正出品种的组合往往依赖于少数几个品种, 即育种骨干亲本 纵观小麦育种历史, 凡是突破性的育种成就, 都与关键性遗传资源的研究和利用密切相关 日本的赤小麦携带 Rht8 基因, 由该种质育成了一批著名的意大利半矮秆品种, 如中农 28(Villa Glori) 达米亚诺(Damiano) 南大 2419(Mentana) 矮粒多 (Ardito) 等, 这些半矮秆品种又作为主要亲本在意大利 南斯拉夫 墨西哥国际玉米小 3

13 第一章引言 麦改良中心 中国 前苏联等国家和地区的小麦育种中广泛应用 (Worland et al.,1998) 以 洛类 品种为代表的 1B/1R 小麦, 携带来自黑麦抗条锈 叶锈 秆锈和白粉病基因 Yr9 Lr26 Sr31 和 Pm8(McIntosh,1998; 周阳,2004), 同时具有较好的丰产性和适应性 (Villareal et al.,1991; Carver,1994;Moreno-Seville et al.,1995), 因此在世界范围内广泛利用, 育成了许多品种 ( 金善宝,1983; 庄巧生,2003) 自从 50 年代发现阿特拉斯 66(Atlas 66) 含有来自巴西品种弗朗多索 (Frondoso) 的高蛋白基因后, 许多育种工作者以此为基础材料, 开展品质育种, 育成了产量不低于推广品种而蛋白质含量高出 1~2% 的新品种在生产上应用, 同时还创造了不少高蛋白质 高赖氨酸的新种质 在我国小麦育种历史上, 曾多次进行国外种质资源的搜集, 这些种质资源对我国小麦新品种选育做出了重要贡献, 促进了我国的小麦生产 早期引进的南大 2419 中农 28 以及碧玉麦 矮粒多等, 为黄淮冬麦区 华南冬麦区和西北春麦区的品种改良建立了不朽功勋 ; 胜利麦 早洋麦和钱交麦为北部冬麦区的品种改良奠定了基础 ; 阿夫 阿勃 郑引 4 号 郑引 1 号等在黄淮冬麦区 长江中下游冬麦区 云贵高原和西北春麦区做出了重要贡献 另外, 洛夫林 10 山前麦和牛朱特等为代表的 1B/1R 抗源品种在北部冬麦区及黄淮冬麦区做出了重要贡献 通过系谱分析, 总结了 16 个小麦育种骨干亲本, 包括 5 个地方品种 : 蚂蚱麦 燕大 1817 江东门 成都光头 蚰子麦 ;4 个育成品种 : 碧蚂 4 号 北京 8 号 西农 6028 和五一麦 ;7 个国外引进品种 : 南大 2419 欧柔 阿夫 阿勃 早洋麦 洛夫林 10 墨巴 66( 金善宝,1983; 庄巧生,2003) 可见, 国外品种尤其是欧洲品种对我国小麦育种做出了重要贡献 骨干亲本往往具有比较独特的优异性状 燕大 1817 以抗逆著称, 抗寒 耐旱 耐瘠 分蘖力强, 主要分布在北部冬麦区 ; 江东门早熟性状突出且配合力好, 是长江流域的好 早源 ; 蚂蚱麦 成都光头 蚰子麦分别是陕西关中 四川盆地和华北平原的老丰产品种, 有较广泛的适应性 北京 8 号在北部冬麦区作为早熟 抗锈 丰产的亲本利用 ; 洛夫林 10 作为主要的抗源利用, 对条锈病 叶锈病 白粉病具有很强的抗性, 而且丰产性 茎秆强度 后期熟相都很好, 主要缺点是晚熟 ( 庄巧生,2003) 小偃 6 号的突出特点是耐干热风, 产量稳定, 品质好 ( 李振声,2007); 含牛朱特抗源的矮孟牛具有矮秆 多抗 高产等优异性状, 且配合力好 ( 李晴祺,1998) 总之, 骨干亲本是对半个多世纪育种历史的总结, 是小麦育种和生产的功臣 如果能从基因组学水平系统地分析和认识这些骨干亲本, 无疑对未来的育种工作, 特别是亲本的选择和组合的选配可提供重要的科学依据, 推动育种工作从 艺术 向 科学 的转变 ( 张学勇等,2006) 种质创新与育种 种质创新 (Germplasm Enhancement) 泛指人们利用各种变异 ( 自然的或人工的 ), 通过人工选择的方法, 根据不同目的而创造成的新作物 新品种 新类型 新材料 因此, 种质创新是种质资源有效利用的前提和关键, 是作物遗传育种发展的基础和保证 种质创新根据目标的不同可以分为两大类 :1 以遗传学材料为主要目标的种质创新, 例如非整倍体材料 近等基因系等 ;2 以育种亲本材料为主要目标的种质创新, 例如国际水稻所的 低脚乌尖, 中国的 野败型 不育系, 小麦 1B/1R 代换 / 易位系 ( 周阳,2004) 及获国家发明一等奖的矮孟牛 ( 李晴祺,1998) 4

14 第一章引言 等 这两类种质创新都十分重要, 目前, 国内学者比较重视以育种亲本为目的的种质创新 种质创新的技术多种多样, 概括起来主要有以下三类 :1 充分利用自然的基因进行培育 改造 现在的农作物大都是在一万年以前由其野生祖先栽培驯化而来, 野生种的驯化使品种遗传基础狭窄, 现代育种又使品种基础进一步狭窄化, 野生种中蕴藏着许多栽培种不具备的优良基因, 而古老地方品种遗传基础也比较宽, 从中发掘新的有用基因是行之有效的 例如我国水稻的 矮脚南持 小麦的 矮变一号 2 通过种内杂交 远缘杂交 组织培养 无性系变异 人工诱变等手段创造新的变异类型, 这是目前种质创新的主要手段和方法, 几乎所有人工创造的新类型均来源于此 3 利用基因工程手段进行种质创新是 80 年代以来发展起来的新技术, 它不仅可以在不同科 族间, 而且可以打破动植物的界限而进行基因转移, 极大地丰富了变异类型, 增大了遗传多样性 例如棉花的转基因抗虫类型 ( 郭三堆等,1999) 1.2 选择牵连效应与遗传作图 自然选择和人工选择 在自然界中生物的遗传和变异普遍存在, 达尔文从生物的变异和生存竞争的关系中发现 : 对生存有利的等位变异使得个体能在生存竞争中获胜, 具有不利变异的个体便会在生存竞争中失败而死亡, 这就是适者生存 这种适者生存, 不适者被淘汰的过程叫自然选择 (Natrual Selection) 自然选择是进化生物学中最核心的概念, 是生物进化的主要动力, 能够导致同一种群中, 不同遗传性状的分布比例在下一个世代发生较大变化 达尔文曾形象地描述 : 可以说, 自然选择每时每刻都在瞪大眼睛搜索着世界每一个角落的生物, 不放过任何一点变异, 哪怕是最微小的变异 在这一过程中它不断淘汰差的, 保留好的 ; 只要一有机会, 它就会悄然无声 不漏痕迹地发挥作用 自然选择在群体遗传平衡中发挥着重要的作用, 其作用在于改变了个体的适合度 (Fitness) 适合度是指一个个体能够生存并把这种生存能力遗传给下一代的相对能力 ( 孙冬琳,2007) 它导致群体更好地适应较稳定的生态环境及变化着的生态环境 从分子水平上讲, 这种变化是通过更有利的基因替换原有基因而产生的 当群体中产生新的有利基因, 或者由于环境条件的改变, 现有野生型等位基因变得不适应或不利于生存或繁衍时, 它就会逐渐被新的有利突变 ( 等位基因 ) 所替代 ( 陈家宽和杨继,1994) 分析自然选择中等位基因频率的统计学方法很多, 最为常用的包括检测功能性突变位点频率的 Ka/Ks 值 (Li et al.,1985) Mcdonald-Kreitman(MK) 值 (McDonald et al.,1991); 检测基因多样性的 Tajima s D 值 (Tajima,1989) Hudson-Kreitman-Aguade(HKA) 值及 Fu and Li s D* 值 (Hudson et al.,1987;fu & Li,1993); 检测衍生等位基因频率的 H 值 (Fay & Wu,2000); 检测人群间等位基因频率差异的 Fst 值及 P 值等 (Akey et al.,2002) 人工选择是人类按自身要求, 利用各种自然变异或人工创造的变异类型, 保存具有优异变异的个体和淘汰具有 不良变异 的个体, 以改良生物的性状和培育新品种的过程 它与自然选择存在明显的区别 : 首先, 人工选择所保留的变异主要对人有利, 而自然选择所保留的变异对生物的生存与繁衍有利 ; 其次, 在人工选择里发生作用的是人, 它是以对人类的好恶作为选择的标准 ( 生产性能 经济价值 娱乐观赏价值等 ), 表现出很强的目的性 ; 而在自然选择里发挥主导作 5

15 第一章引言 用的是自然条件, 它完全是生物与环境互作的历史过程, 是按照具体的自然条件进行的, 既无目的性, 又无预见性 ; 再次, 人工选择见效快, 在短时间内, 就可培育出新品种, 而自然选择见效一般需要较长的时间 ( 方宗熙,1964) 自从达尔文首次系统论述家养动物和栽培植物因人工选择而发生显著变异的现象以来, 因为囿于人工选育性状的复杂性及其往往不遵循典型的孟德尔遗传方式, 人们对人工选择的遗传机制和在人工选择下基因和基因组的变化及进化规律依然知之甚少 在作物的驯化和育种中, 人工选择和自然选择是紧密联系在一起的, 它们共同推动作物的进化 我们种植的每个作物品种, 不仅是人工选择的产物, 也是自然选择的产物, 它在符合人类某些需求的同时, 也必需适应特定的生态环境条件 而那些对人类有利但对作物有害的变异也难以保存下来, 最终会被自然淘汰 ( 游光霞,2006) 群体中的定向选择 定向选择是表型变异和物种分化的源动力, 是达尔文适应性进化的基础, 它使物种的表型向着有利的方向发展, 通过有利等位变异的增加和不利等位变异的减少来实现, 主要用适合度和选择系数 (Selection Coefficient) 来衡量 (Hoekstra et al.,2001;rieseberg et al.,2002) 定向选择的压力既可能来源于自然, 也可能来源于人类, 前者涉及的是适应性相关的性状, 后者涉及的是人类所需的性状 Higuet(1991) 对果蝇的体重和杂种不育性状的定向选择进行了研究, 结果表明, 不育系和可育系对不同选择方向的响应不同, 前者的响应强而后者弱, 且当选择压减弱时, 选择响应随之减弱甚至消失 Rieseberg 等 (2002) 通过对种间和种内 QTLs 效应检测证明定向选择在群体分化中扮演着重要的角色, 而且对驯化性状的选择压力强于对形态学或生理性状的选择 Merritt 和 Quattro(2001) 的研究表明, 长时间的定向选择导致丙糖异构酶发生基因复制 (Gene Duplication) 因此, 定向选择在物种的进化过程中起着非常重要的作用 育种中的选择 育种中的选择是指在一个群体中选择符合需要的基因型的过程 传统育种, 通常依据表现型进行选择, 即依据表现型推断其基因型 由于表型选择依赖于性状的表现, 因此它受到许多限制 首先是时间上的限制 : 许多重要性状必须在个体发育后期或成熟时才得以表现 ( 如果实的产量和品质 ), 无法在苗期进行, 这对于生活周期长的植物 ( 如树木 ) 显然十分不利 其次为空间上的限制 : 有些性状的表现需要特定的环境条件 ( 如抗病性的鉴定需要人工接种和合适的温度及湿度 ), 如果条件不满足, 则性状不能充分表现, 从而影响选择的可靠性 第三是技术上的限制 : 有些性状 ( 如生理生化性状 ) 的表型测量难度大 成本高, 而且往往误差较大, 还可能会对生物体造成很大伤害, 甚至死亡, 因此, 对这些性状的表型选择非常困难, 甚至无法进行 另外, 表型选择一般对质量性状有效, 而对数量性状, 由于其表现型与基因型之间没有明确的对应关系, 因此表型选择效率通常较低 ( 方宣钧,2003) 总之, 基于表型选择的方法存在许多不足, 要提高选择效率, 最理想的方法应是能够直接对基因型进行选择 6

16 第一章引言 随着现代分子生物学的迅速发展, 分子选择技术为实现对基因型的直接选择提供了可能 分子标记辅助选择 (Molecular Assistant Selection,MAS) 是在此基础上发展起来的一种方法, 用 DNA 分子标记代替表型标记从基因组水平上对育种群体进行选择, 大大提高了选择精度和育种效率 (Ribaut,1998) 分子标记辅助选择在回交育种中取得了较大成效, 称为回交分子标记辅助选择 (Marker-Mssisted Backcrossing,MABC)( Frisch,1999) 在 MABC 中存在前景选择 (Foreground Selection) 或正向选择和背景选择 (Background Selection) 或负向选择, 对目标基因的选择称为前景选择, 其作用是保证从每一回交世代选出的作为下一轮回交的个体都包含目标基因, 其可靠性取决于标记与目标基因的连锁程度 回交育种中除了目的基因的转移外, 主要目标是尽可能快速和完全地恢复轮回亲本基因组, 即背景选择 (Hospital & Charcosset,1997) 将前景选择和背景选择结合使用, 可缩短育种周期, 降低育种成本, 提高育种效率 (Bai et al,2006) 宋敏等(2005) 通过对与 opaque2 基因紧密连锁的分子标记 phi057 的前景选择和利用 AFLP 标记进行的背景选择, 选出了与轮回亲本具有较高相似性的单株个体, 加快了优质蛋白玉米的育种进程 在育种中, 目标基因是选择的首要对象, 因此, 一般应首先进行前景选择, 以保证不丢失目标基因, 然后再对中选的个体进一步进行背景选择 选择对基因组的影响 近年来, 越来越多的研究表明, 在生物进化过程中, 基因组中许多基因都经历了正向达尔文选择作用 Schlötterer(2002) 的研究表明, 在人类基因组中非洲人群的 D10S249 位点和其他人群的 D6S462 位点都经历过较强的选择作用 人类蛋白质中绝大部分氨基酸替代作用都与自然选择有关, 而果蝇蛋白质中 40% 的氨基酸替代作用受到了自然选择的影响 (Fay & Wu,2001;Fay et al.,2002;smith and Eyre-Walker,2002) 另外, 欧洲和非洲果蝇的多个基因组区段或序列也存在明显的选择痕迹 (Harr et al.,2002;orengo & Aguade,2004) 而对于受自然选择和人工选择较强的作物品种更是留下了深深的选择烙印 在由大刍草向玉米的进化过程中, 与株型相关基因 tb1 储藏蛋白表达调节基因 pbf 和支链淀粉酶基因 sul 都受到了很强的选择作用 (Vicente-Carbajosa et al.,1997;rahman et al.,1998;jaenicke-despres et al.,2003); 玉米 1 号染色体的 21 个基因中有 3 个 (sse1 seed2 和 dwarf8) 经受了选择作用 (Tenaillon et al.,2001) Vigouroux(2002) 和 Wringht(2005) 等的研究表明, 玉米基因组中约 2~5% 的基因在驯化和现代育种中经受了较强的选择作用 另外, 水稻的 Waxy 基因 (Olsen & Purugganan,2002) 小麦的 Rht-B1 和 Rht-D1 基因 (Peng et al.,1999) 番茄的 fw2.2 基因 (Frary et al.,2000) 花椰菜的 CAULIFLOWER 基因 (Purugganan et al.,2000) 等都存在较强的选择痕迹 选择无时无刻不在发生, 这种选择会对基因组产生什么样的影响呢? 研究表明, 选择主要对基因组产生三种效应 :1 显著降低被选择位点及其侧翼序列的遗传多样性 (Nurminsky et al.,2001; Harr et al.,2002;schlötterer,2002);2 增加该基因组区段的连锁不平衡性 (Hudson et al.,2001; Huttley et al.,2000;kohn et al.,2000;wootton et al.,2002); 3 改变该区段各位点等位变异的分布模式, 使它们发生偏分布 ( 即不均衡分布 ) 选择对群体遗传多样性的改变不同于其他因素, 如迁移 遗传漂变 重组 突变及瓶颈效应等的作用 迁移和遗传漂变通常造成群体整个基因组 7

17 第一章引言 遗传多样性的改变, 重组和突变只会增加该位点的遗传多样性, 瓶颈效应造成的是整个基因组遗 传多样性的降低 只有选择作用才会造成靶位点及其两侧序列遗传多样性的显著下降 (Schlötterer,2003; 图 1.2) 选择牵连效应 在生物的自然进化中, 当某一 有利 等位变异被选择并逐渐固定下来, 其后代群体中具有此等位变异个体的比例将会大大增加, 而且具有其他等位变异的个体会逐渐减少甚至消失, 因此该位点的遗传多样性急剧下降 同时, 由于遗传连锁, 该位点的侧翼序列也会随着 有利 等位基因的固定而大量保留下来, 致使其遗传多样性大大降低 遗传学中将这种对个别基因的选择导致其侧翼序列遗传多样性降低的现象称为选择牵连作用 (Hitchhicking Effects), 但未受选择影响的基因组其它区域, 其多样性并不会发生改变 (Smith & Haigh,1974; 张学勇等,2006; 游光霞和张学勇,2007) 在作物的驯化和现代育种中, 为了提高产量 改良作物的农艺性状及营养品质等, 人们不断地对目标性状进行选择, 这些选择作用降低了靶基因及其侧翼序列的遗传多样性, 发生了很强的选择牵连作用 (Rieseberg et al.,2002) 影响选择牵连效应大小的因素主要有群体的交配方式 选择压和被选择位点附近的重组率等 与异交作物 ( 如玉米 ) 相比, 自交作物的驯化和育种选择更易造成较大区段发生选择牵连效应 ; 对目标基因或 QTL 的选择压越大, 牵连效应越强 ; 重组率越低的基因组区段, 选择牵连效应越强 (Andolfatto,2001; 张学勇等,2006; 游光霞和张学勇,2007) 一般来说, 对与生命休戚相关基因的选择引起的选择牵连作用较强, 对发育调控相关基因的选择引起的选择牵连作用较弱, 而对重要农艺性状基因的选择引起的选择牵连作用也较强 (Rieseberg et al.,2002; 游光霞,2006; 张学勇等,2006) 根据基因组水平受到选择的三种 信号 及选择牵连效应进行基因定位作图及功能分析的方法, 称为选择牵连作图法 (Harr et al.,2002;schlötterer,2003) 即如果发现某位点的等位变异发生严重偏分布, 表明该位点 ( 或附近区域 ) 必然存在与生态适应性或农艺性状相关的重要基因, 而且这一基因在过去肯定经历过很强的选择作用 (Fay & Wu,2002) 同理, 如果发现某位点的遗传多样性降低, 或是此位点所在基因组区段的连锁不平衡性增强, 我们也可推测此位点 ( 或附近区域 ) 经历过很强的选择作用 但是并非所有的基因都经历过很强的选择作用, 有些只是经历了一定的自然选择和人工选择作用, 而且由于进化中的许多因素如重组 突变 遗传漂变 迁移 群体扩张 瓶颈效应等的影响, 这些位点所在的基因组区段一般不会出现 高频等位变异, 因而我们很难通过单位点信息来判断某基因组区段是否经历了较强的选择作用, 必须进行多位点分析 ( 游光霞,2006) Schlötterer(2003) 的研究给出了进行多位点分析的理想思路 ( 图 1.3A), 依据选择牵连作用原理, 存在选择作用的基因组区段其遗传多样性一般呈 V 字形变化, 即以被选择基因为中心向两侧其遗传多样性不断增加 Sutter 等 ( 2007) 在狗 IGF1 基因附近发现了 V 字形选择谷的存在 ( 图 1.3B), 证实了 Schlötterer(2003) 思路的可行性 我们的研究也证明小麦驯化及育种过程中, 有较多的 V 字形选择谷产生 ( 游光霞,2006; 图 1.3C) 8

18 第一章引言 图 1.2 不同基因组区段的等位变异分布模式 (a) 恒定大小的群体中经受自然选择的位点分布模式 ;(b) 群体瓶颈效应对基因组多样性的影响 ;(c) 选择牵连作用对靶位点及侧翼区域多样性的影响 (Schlötterer,2003) Fig.1.2 Partitioning of variability at three different chromosomal locations. For eachchromosomal region, segregating variation (e.g. single nucleotide polymorphisms) is indicated by circles, squares and triangles. Allelic states are distinguished by filled and empty symbols. (a) Neutral scenario in a population of constant size.(b) Population bottleneck leading to genome wide reduction in variability. (c) The central genomic region was subjected to a recent selective sweep, resulting in areduced variability and linkage disequilibrium at this locus only. 9

19 第一章引言 A B C 图 1.3 A: V 字形选择谷示意图 (Schlötterer,2003); B: 狗 IGF1 基因序列及其侧翼存在的 V 字形选择谷 (Sutter et al.,2007);c: 小麦 1B 连锁群上的 V 字形选择谷 ( 游光霞,2006) Fig. 1.3 A: The sketch of selective sweep of V ;B: The selective sweep of V identified in IGF1 gene of dog;c:the selective sweep of V identified in 1B linkage group of wheat 1.3 关联分析作图 关联分析作图又叫连锁不平衡作图, 是利用不同位点等位基因间的连锁不平衡关系, 进行标记 / 性状的相关性分析, 从而鉴定目标性状基因或染色体区段的作图方法 其基于连锁不平衡分析, 受群体结构的影响, 与传统的 QTL 作图相比, 在作图群体构建 解析率及所需时间上存在明显优势 这一部分主要阐述了与关联分析作图密切相关的连锁不平衡 群体结构研究方面的进展, 并对国内外关联分析作图的近况进行了简要介绍 10

20 第一章引言 连锁不平衡 早在 20 世纪初期,Jinnings 提出了连锁不平衡 (Linkage Disequilibrium, LD) 这一概念, 描述群体内不同位点等位基因间非随机性组合的现象, 即如果一基因座上的特定等位变异与另一基因座的某等位变异同时出现的几率大于在群体中随机分布的频率时, 就称这两个基因处于连锁不平衡状态 它既包括染色体内连锁不平衡, 又包括染色体间连锁不平衡, 在关联分析中利用的是染色体内的不平衡 (Flint-Garcia,2003;Zhang et al.,2002) 连锁不平衡现象在群体遗传学参数估计 基因精细定位 关联分析等方面有广泛应用 从本质上讲, 关联分析检测的就是遗传标记和性状之间的连锁不平衡 (Pritchard et al.,2001a) 由于有限的群体大小和复杂的群体历史, 这种非随机组合在基因组中普遍存在, 因此, 可以依据此方法进行目标性状基因的精细定位及发掘 连锁不平衡研究中的相关概念 单倍型 (Haplotype) 最初源于单倍体, 单倍体指一个配子中全部染色体的总和, 在单倍体中一条染色体全部基因的组合即称作单倍型 单倍型的概念现在被充分地延伸, 一条染色体 一个基因, 甚至于一条 DNA 片段上各种遗传标记 ( 包括 SNP 限制性酶切片段长度多态性 微卫星标记等 ) 的特定组合均被称作单倍型 可以简单定义为一些染色体特定区域内等位基因的特殊组合, 其缩小模型就是基因型 它是在 SNP 研究的基础上, 从基因组学研究中形成的新概念 : 基因组 DNA 序列并不是随机地排列在一起, 而是由被称为 单倍型 的基本结构单元所组成 美国科学家对人类 21 号染色体进行分析, 认为其中 80% 的 DNA 序列是由三个单倍型为结构单元搭建而成的 (Ptail et al.,2001) 美国国立卫生研究院在 2002 年 10 月启动了一项单倍型作图 (Haplotype Map) 计划, 要在 3 年内测定不同人种的单倍型图谱, 启动该项计划的假设是, 单倍型在不同人种中是不一样的, 正是这些微小的基因组差异, 导致了人与人之间对环境 疾病和药物等的不同反应 (The International HapMap Consortium,2003) 单倍域 (Haplotype Blocks) 又称单倍型区段, 是指在某一 DNA 片段上的多态性标记所构建的全部单倍型集合 (Daly et al.,2001) 基因组中单倍型的分布呈 块状 结构, 同一单倍域中的 SNPs 间连锁不平衡, 所有 SNPs 有一致的遗传趋势 不同的单倍域间 SNPs 的个数, 单倍型的种类, 单倍域的跨度都不同 Patil 等 (2001) 将人类 21 号染色体的 个普通的 SNPs( 频率在 0.01 以上 ) 划为 4135 个 单倍域, 其中 14% 的单倍域中每个区块的 SNPs 个数超过 10 个, 平均每个区块有 2.7 种普通单倍型, 最大的 单倍域 跨度为 115Kb,SNPs 的个数为 114 个 由于重组率在不同的基因组区段存在较大差异, 从而形成了间隔不同的 单倍域 单倍域 间的重组机率要大, 所以 单倍域 间的区域被称为重组热点 (Hot Spot); 每个 单倍域 内重组机率要小的多, 所以 单倍域 本身又被称为非重组热点区 (Luikart et al.,2003) Aranzana 等 (2005) 的研究发现拟南芥不同品种的聚类图与品种的单倍域密切相关, 单倍域比较一致的品种往往聚到一起 单倍域 SNP 标签 (Haplotype Tag SNPs,htSNPs) 单倍域一旦被确认, 就可以精确的检测出在单倍域中特异性区分普通单倍型的 SNPs, 这些特异性的 SNPs 被称为 单倍域 SNPs 标签, 它可用于捕获基因单倍型或研究连锁不平衡区域 (Johnson et al.,2001) 因为不必对某区域内所有位点进行分型, 就可以推测该区域大部分位点的个体类型, 所以单倍型标签位点对关联分析 11

21 第一章引言 的广泛开展非常有利 (Horne and Camp,2004) 连锁不平衡的估算 连锁不平衡常用 r 2 (Squared Allele-Frequency Correlations) 和 D (Standardized Disequilibrium Coefficients) 表示 r 2 和 D 越大, 两等位基因间的连锁不平衡关系越强 ; 当 D 和 r 2 为零时, 两等 位基因连锁完全平衡 ;D 和 r 2 为 1 时, 两者连锁完全不平衡 D 和 r 2 的计算公式如下 : ; ; 对于 A B 两个位点, 其中 A 位点具有等位变异 A 和 a,b 位点具有等位变异 B 和 b, 其在 基因组中的频率分别为 π A,π a,π B,π b ; 其可能的四种单倍型的频率为 π AB,π Ab,π ab,π ab, 其中 公式中 D ab =(π AB -π A π B ) 另外,min(π Ab,π ab ) 和 min(π AB,π ab ) 分别表示 π Ab 与 π ab,π AB 与 π ab 两个值中的最小值 进行统计时, 可将频率小于 5% 或 10% 的稀有等位变异删除 (Pritchard et al., 2001a; 游光霞 张学勇,2006) 在 r 2 和 D 中,D 较多的反应了重组率的影响, 而 r 2 同时考虑 了重组率和突变率的影响, 因此,r 2 更能客观地反映不同位点上基因间的连锁不平衡关系 影响连锁不平衡的主要因素 影响连锁不平衡的因素很多, 诸如重组 选择 突变 瓶颈效应 遗传漂变 繁殖方式和群 体融合等都对连锁不平衡有一定的影响 重组会增加连锁位点间的遗传多样性, 降低位点间的连 锁不平衡性, 可提高关联分析作图的精度, 但需要较多的遗传标记 ; 选择和瓶颈效应能增加位点 间的不平衡性, 降低了关联分析作图的精度, 但需较少的遗传标记就可检测到较大范围的连锁不 平衡 ; 植物的授粉方式不同, 其基因组连锁不平衡的程度也不一样, 一般异花授粉植物的重组率 普遍高于自花授粉植物, 因此基因组连锁不平衡程度一般比自花授粉植物的连锁不平衡要低 ( 游 光霞,2006) 以上因素导致不同物种, 甚至同一物种的不同群体, 其基因组间连锁不平衡程度 不同 例如, 玉米地方品种的 LD 为 1Kb(Tenaillon et al.,2001), 其自交系的 LD 为 2Kb(Remington et al.,2001), 而商用自交系的 LD 竟高达 100Kb(Ching et al.,2002), 造成两种自交系连锁不 平衡差异巨大的主要原因是人工选择 连锁不平衡与关联分析的关系 关联分析 (Association Analysis) 是利用等位基因间连锁不平衡关系来分析控制生物特定性状的基因组 DNA 区段, 研究基因型和表型关系的一种有效方法 从本质上讲, 关联分析检测的就是遗传标记和性状之间的连锁不平衡 (Pritchard et al.,2001a) 了解基因组连锁不平衡结构和规律是有效进行关联分析的前提和基础 根据基因组连锁不平衡结构进行标记 / 性状关联分析的基本原理如下 : 先确定一批在整个基因组上分布比较均匀的遗传标记, 然后在群体中寻找这些标记与特定性状之间的关系, 即确定与目标性状相关的标记基因型, 从而确定控制生物出现目标性状的基因组区域 如果某群体内一特定性状与一个遗传标记或某一单倍域标签之间存在高度连锁不平衡, 则可以推断该特定性状与这一标记基因相关 从分子标记的角度看, 连锁不平衡与关联分 12

22 第一章引言 析有着密切的关系, 关联研究的成效如何, 在很大程度上取决于群体中连锁不平衡的强弱和方式 (Pritchard,2001a) 连锁不平衡是生物群体在自然选择和进化过程中出现的一种现象 利用连 锁不平衡作图来研究基因型和表现型之间的相关性, 可使作图精度大大提高 (Zheng et al.,2008) 群体结构 群体结构的概念在群体遗传学中, 群体结构指目标群体内仍存在分组的现象 (Pritchard,2001b;Gabriel et al., 2002) 与传统 QTLs 作图方法一样, 关联分析作图也需要作图群体, 两者所用的群体不同 前者需要诸如重组近交系 (RILs) 近等基因系(NILs) 加倍双单倍体(DH) 及 F 2 等分离群体 ; 而关联分析所用的是自然群体, 这类群体在自然进化或育种过程中积累了丰富的重组信息 因此, 关联分析作图能够寻找到更为优异的等位基因 关联分析的理想群体应足够大且符合 Hardy-Weinberg 平衡 ( 无群体结构 ), 但是这种群体很难找到, 多数群体存在一定程度的群体结构 群体结构对关联分析的影响群体结构能增加基因组的连锁不平衡性, 若不采取统计学处理, 则可能出现由于亚组间混合而造成目标性状与不相关的位点表现出关联性, 即造成伪关联, 导致作图失败 (Yu & Buckler, 2006) 进行关联分析时, 应尽量使用无群体结构或群体结构效应小的群体, 使用群体样品的数量应该足够大, 大群体有利于减少关联分析不利因素的影响, 提高其作图能力 Flint-Garcia 等 (2005) 认为在利用关联分析对作物农艺性状进行作图时, 所用的群体应尽可能包含所有的表现类型 Long 和 Langley(1999) 的研究表明, 利用由 500 个个体组成的群体, 关联分析就可以检测到解释某性状 5% 的数量性状位点 ; 增加群体样品的数量比增加检测的标记数量更能提高关联分析作图的能力 但 Szalma 等 (2005) 研究的研究认为群体结构的校正还可能引起基因与表型关联的丧失 王荣焕等 (2007) 分析其原因为 :1 所检测到的多态性是没有功能的多态性, 并且这种关联由群体结构引起 ;2 所检测到的多态性确实是功能多态性, 只是其多态性的分布与群体结构恰恰相吻合 群体结构的检测由于作物复杂的进化史及驯化育种史, 群体结构是不可避免的 (Liu et al.,2003;garris et al., 2005) 为了降低关联分析作图的假阳性, 必须进行群体结构检测 不同的群体结构, 应采取不同的统计方法进行关联分析 (Yu et al.,2006) 图 1.4a 表示该作图群体是比较理想的带有微弱的群体结构及家系干扰的群体, 利用该群体进行关联分析采用回归分析或基因组控制分析即可 (Genomic Control,GC); 图 1.4b 表示该群体无群体结构, 但存在家系干扰, 应采取传动不平衡检测 (Transmission Disequilibrium Test,TDT), 数量性状 TDT(QTDT) 或混合模型 ; 图 1.4c 表示该群体存在群体结构, 但无家系干扰, 应采取具有群体结构的关联分析方法 (Structured 13

23 第一章引言 Association,SA) 或基因组控制 (GC); 图 1.4d 表示该群体同时具有群体结构和家系干扰, 应采取 SA,GC 或混合模型 ; 图 1.4e 表示该群体存在严重的群体结构及家系影响, 无相应的统计方法解决, 不能用于关联分析作图 (Yu & Buckler,2006) 另外, 对于存在分群现象的群体, 可在不同亚群内部进行关联分析, 结果互相对比和验证, 得到比较可靠的结论 ( 王兰芬等,2007) 随着统计分析软件的完善,Structure 软件广泛应用于群体结构检测 (Pritchard,2000;Evanno et al., 2005 ), Tassel 软件的逻辑回归及混合模型等都可以将群体结构信息纳入关联分析 ( 图 1.4 具不同群体结构的作图群体 (Yu & Buckler,2006) Fig.1.4 Mapping populations with different structure(yu & Buckler,2006) 关联分析作图 关联分析依据的基本原理关联分析作图是在对物种连锁不平衡研究的基础上进行的 漫长的进化历史对连锁不平衡有深远的影响, 尤其是作物的驯化及育种对连锁不平衡的影响更大, 在基因组上留下了深刻的选择印迹 对目标性状基因的选择, 会影响其邻近区域, 张学勇等 (2006) 对其进行了很好的整理, 总结出了选择牵连作用, 即由于人为选择作用, 在一些控制重要农艺性状的基因位点, 只有极个别基因 ( 等位变异 ) 被保留下来, 其他等位变异则逐步被淘汰, 致使一些基因座的遗传多样性显著低于基因组多样性平均水平 ; 同时对这些基因座的选择导致其两侧区域遗传多样性显著低于基因组平均水平 关联分析找到的是某等位基因与某性状的相关关系, 而选择牵连作用是这种相关关系与最终精细定位甚至找到基因本身的纽带 研究表明, 控制胚乳颜色基因 (y1) 附近 800Kb 的区域存在很强的连锁不平衡 (Palaisa et al.,2004), 乙醇脱氢酶基因 (adh1) 附近 500Kb 也存 14

24 第一章引言 在连锁不平衡 (Jung et al.,2004), 如此高水平的连锁不平衡现象表明它们在驯化及育种过程中 受到了很强的选择 关联分析作图的基本方法 目前进行标记 / 性状关联分析的方法主要有两种, 即全基因组扫描法和候选基因法 ( 游光霞, 2006) 全基因组扫描法指选择一定数量的分子标记对作图群体进行全基因组扫描, 利用所得的分子数据再与表型数据进行关联分析 但是, 这种方法往往需要检测数量巨大的分子标记, 例如人类基因组需要检测 7 万个标记, 拟南芥需要检测 2000 个标记, 玉米地方品种需要检测 75 万个, 商用玉米自交系需检测 5 万个 (Flint-Garcia,2003) 因此, 庞大的基因型扫描工作使这种方法的应用受到限制 但这种方法对基因组连锁不平衡水平较高的群体, 例如自花授粉植物群体和瓶颈效应群体, 可能比较适合 (Hastbacka et al.,1992) 候选基因法是建立在对目标性状基因有一定了解的基础上, 利用关联分析对其候选基因进行验证的方法, 该方法目前应用较多 如玉米中控制分枝的基因 tb1 和控制胚乳颜色的基因 y1 就是候选基因法进行关联分析的 Pritchard 等 (1999,2000) 倡导的作法是 :(1) 在候选基因周围选出一定数量的分子标记 (I 类标记 ), 对目标作图群体和对照群体进行扫描, 获得分子数据 ;(2) 进行标记 / 性状的关联性分析, 找到目标性状的靶位点 ;(3) 选出一定数量与靶位点不连锁的分子标记 (II 类标记 ), 对群体进行检测, 利用获得的分子数据也与目标性状进行关联分析 ;(4) 对所得结果进行分析, 若发现性状与 II 类标记间不存在关联性, 则表示群体结构不存在, 该作图结果有效, 否则, 则需要比较两类标记的关联分析结果, 予以统计处理以消除群体结构的影响 关联分析作图与其他数量性状作图方法的比较传统的 QTL 作图研究的是分子标记与数量性状位点间的连锁关系 (Kato,1998), 通常以标记基因型为分类依据把作图群体分成两组, 比较两组目标性状的差异显著性, 以此推断该性状位点与标记位点的连锁关系 ; 而关联分析研究的是在连锁不平衡基础上, 检测分子标记与数量性状位点间的相关关系 (Pritchard et al.,2001a), 这种相关关系由于选择牵连效应的存在, 能进一步精细定位甚至发掘到基因本身 传统 QTLs 作图与关联分析作图所需的作图群体不同 : 前者需要构建分离群体, 如 F 2 群体 近等基因系 重组近交系 加倍单倍体群体 渐渗系等 ; 传统 QTLs 作图方法主要有 : 单标记作图法 区间作图法 复合区间作图法 混合线性模型和 Bayesian 分析法等 ( 游光霞,2006) 关联分析作图需要的是自然群体, 其主要方法为回归分析或基因组控制 传动不平衡检测 存在群体结构的 GC 统计方法及混合模型等 (Buckler,2006) 两者的作图效率存在较大差异 (Yu & Buckler,2006; 图 1.5), 与传统 QTL 作图技术相比, 关联分析作图存在三个明显的优势 :(1) 关联分析定位更精确, 由于利用自然群体在长期进化中所积累的重组信息, 而具有较高的解析率, 可实现数量性状基因的精细定位, 甚至直接定位到基因本身, 而传统的 QTLs 作图利用的是群体构建中的配子的重组信息, 解析率低, 一般只能将基因定位到 10-30cM 内 Bierut 等 (2007) 通过全基因组高密度关联分析方法, 发现了尼古丁依赖型的新基因 ; 而 II 型糖尿病高发的位点也通过全基因组关联分析方法得到 (Sladek et al.,2007) 15

25 第一章引言 (2) 关联分析作图可同时考察一个基因座的多个等位基因, 而 QTL 作图利用群体来自两个亲本, 因此其考察的每一个基因座只涉及两个等位基因 (3) 关联分析作图不需构建作图群体, 省时省力, 并有较多的群体可利用 ; 而 QTL 作图至少要花费 2 年的时间去完成群体的构建 ( 张学勇等, 2006; 游光霞和张学勇,2007) 图 1.5 关联分析作图与传统 QTLs 作图方法与作图效率比较 (Yu & Buckler,2006) Fig. 1.5 Comparison of efficient between association mapping and QTLs mapping 1.4 分子设计育种 遗传改良是提升作物产量和品质的最主要手段, 但其潜力的发挥受到常规育种思路 方法和技术的制约 近年来的研究表明, 基于功能基因组学知识和技术的分子设计育种是克服常规育种技术瓶颈的有效途径 ( 薛勇彪,2007) Randy(1998) 在论述西北太平洋地区农业森林发展时提到 设计育种 这一概念,Peleman(2003) 比较系统的提出了分子设计育种 (Breeding by Design), 并且进行了商标注册 通过大量渐渗系的形态鉴定和基因型分析, 发现一些来自不同供体亲本或同一供体亲本的优异等位变异, 再通过渗入系间杂交, 将不同位点上的优异等位变异综合于一体, 直接用于生产或通过分子标记辅助选择, 培育出优异品种 渐渗系或导入系 (Introgression Lines) 最早由 Eshed 和 Zamir(1995) 提出, 并在番茄上成功应用, 以此为基础图位克隆了控制番茄果实大小的基因 fw2.2(fray et al.,2000) Takeda 和 Matsuoka(2008) 对以 NILs 群体为基础的基因 ( 或 QTLs) 聚合育种进行了概述 ( 图 1.6), 认为可以将携带不同性状的优异等位变异聚合到同一背景, 实现分子设计育种 Varshney 等 (2005) 提出了基因组学辅助育种 (Genomics-Assisted Breeding), 旨在利用作物基因组学 蛋白组学和代谢组学的生物数据, 发掘和整合遗传资源的有利基因, 借助生物信息学的力量从全基因组水平加快控制作物重要农艺性状的聚合, 加速作物分子设计育种进程 随着基因组学和功能基因组学研究的快速发展, 基因挖掘 分子标记辅助选择及转基因技术取得了很大进展, 加快了分子设计育种的进程 但 Peleman(2003) 倡导的分子设计育种的实施方案需要很大的人力和物力投入, 如何使分子设计育种走近育种家呢? 张学勇等 (2006) 从另一 16

26 第一章引言 个角度进行了研究, 认为如果能够对一批骨干亲本 大面积推广品种进行全基因组的高密度扫描, 并通过选择牵连效应分析, 辅之以标记 / 性状关联分析, 可以找到一些重要的基因组区段, 发现一批不可或缺的重要等位变异, 从而搞清楚骨干亲本及多产组合易出品种的基因组学基础, 进而从另一条思路 研究历史 设计未来, 为品种的分子设计 组合的选配及后代的分子标记选择提供重要的理论依据 图 1.6 分子设计育种之聚合育种示意图 (Takeda & Matsuoka,2008) Fig.1.6 The sketch map of QTLs pyramiding of breeding by design 1.5 本研究的目的和意义 通过对我国半个多世纪育成的一些著名小麦品种及骨干 ( 重要 ) 育种亲本的全基因组高密度 SSR 标记扫描, 探讨骨干亲本在小麦育种中的重要作用 ; 通过骨干 ( 重要 ) 育种亲本阿勃和郑引 4 号及其后代材料的全基因组扫描分析, 确定育种选择主要作用的基因组区段及这些区段的优异等位变异 ; 同时, 结合标记 / 性状关联分析, 寻找关键基因组区段控制 ( 影响 ) 的主要农艺性状 ; 综合在育种中受到选择的基因组区段及它们影响的性状研究, 提出亲本选配模型, 提高选择的准确性, 提升分子标记在育种中的价值, 为分子设计育种奠定基因组学基础, 为我国小麦育种学科的发展寻找科学依据 17

27 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 摘要 : 利用 ABI3730 对我国 66 份大面积推广的小麦品种和 13 份育种骨干亲本的 481 个 SSR 位点进行了基因型扫描分析 主坐标及 NJ 聚类分析发现我国大面积推广品种可聚成 6 个大组, 每一组中至少有一个骨干亲本 系谱分析表明, 每一组中大面积推广品种和骨干亲本之间均存在密切的血缘关系, 前者大多为骨干亲本的后裔 ; 而且同一省份的品种多数聚在一起 来自同一组合的骨干亲本碧蚂 4 号含有的优势等位变异数多于大面积推广品种碧蚂 1 号, 同样, 郑引 4 号多于郑引 1 号 ; 除衍生大面积推广品种之外, 往日的骨干亲本又是新一代骨干亲本的奠基者 因此, 只有对资源的创新 引进和利用给予足够的重视, 育种工作才能取得大的突破 引言 小麦是我国主要粮食作物之一, 其生产发展离不开各个时期的大面积推广品种, 尤其是年推广面积超过千万亩 ( ha) 的小麦品种, 如上世纪 年代黄淮冬麦区的碧蚂 1 号 ( 1959 年,466.6 万 ha), 年代的内乡 5 号 (1961 年,266.7 万 ha), 年代的泰山 1 号 (1979 年,374.2 万 ha),80-90 年代的百农 3217(1984 年,164.8 万 ha) 及 90 年代以后的豫麦 18(1998 年,219.3 万 ha) 等 ( 庄巧生,2003; 郑殿升,2001) 庄巧生先生总结了 90 年代以前年推广面积大于一千万亩的小麦品种, 共 59 份 ( 庄巧生,2003), 最近几年超过千万亩的品种有郑麦 9023 烟农 19 等 ; 此外, 高优 503 陕 229 鲁麦 12 小偃 22 周麦 18 等品种也是主推品种, 为我国小麦单产及总产的提高均做出了重要贡献 庄巧生先生在 中国小麦品种改良及系谱分析 一书中, 明确了 16 个小麦骨干亲本, 包括蚂蚱麦 燕大 1817 江东门 成都光头 蚰子麦 碧蚂 4 号 北京 8 号 西农 6028 五一麦 南大 2419 欧柔 阿夫 阿勃 早洋麦 墨巴 66 及洛夫林 10, 其中阿勃衍生了 217 个品种, 阿夫衍生了 165 个, 南大 2419 衍生 110 个 ( 庄巧生,2003;Zhang et al.,2002) 另外, 郑引 4 号也一直是育种上非常重要的骨干亲本之一, 在黄淮麦区, 尤其是河南省育成了许多品种 目前, 又有许多品种起着骨干亲本的作用, 如矮孟牛衍生了 81 个品种 ( 系 )( 王珊珊等,2007) 小偃 6 号衍生了 44 个品种 ( 系 )( 李振声,2007) 结合系谱分析, 在全基因组水平上分析和认识这些骨干亲本, 研究它们与衍生品种之间的遗传关系, 无疑能够对未来的小麦育种工作, 特别是亲本选择和组合选配具有重要的参考价值 ( 张学勇等,2006) 另外, 在作物的育种实践中有这样一种现象, 即来自同一个组合的品种, 有的虽被大面积推广种植, 但却没有成为一个很好的育种亲本 ; 相反, 其姊妹系本身虽无多大种植面积, 却育成了很多品种, 成为骨干亲本, 在小麦中就有两组品种非常典型 : 碧蚂 1 号和碧蚂 4 号 ( 蚂蚱麦 碧玉麦 ) 郑引 1 号和郑引 4 号 (Mara San-pastore) 当然也有既为大面积推广品种又是骨干亲本的品种, 如阿勃 阿夫 北京 8 号 南大 2419 等 从理论上讲, 大面积推广品种能够广泛推广种植的一个很重要的因素是其必须具有广泛的生态适应性 ; 而骨干亲本能够育成很多品种, 有一点是必须的, 即配合力要好, 性状遗传传递力要高 因此, 从基因组水平研究和揭示上述现象将有助于我们更好的理解骨干亲本在育种中的作用 18

28 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 本研究的目的是通过全基因组 SSR 标记扫描, 分析我国大面积推广的小麦品种及骨干亲本的遗传组成及相互间的遗传关系, 并通过比较分析碧蚂 1 号 碧蚂 4 号及郑引 1 号 郑引 4 号在基因组水平的异同, 探讨大面积推广小麦品种和育种骨干亲本的异同, 为今后的小麦分子设计育种奠定理论基础 2.1 材料与方法 研究材料 表 2.1 本章供试材料 Table 2.1 The cultivars genotyped in this study 代码品种名称代码品种名称代码品种名称代码品种名称代码品种名称 code varieties code varieties code varieties code varieties code varieties # 阿勃冀麦 38 泰山 1 号温麦 6 号扬麦 5 号 Abbondanza Jimai-38 Taishan-1 Wenmai-6 Yangmai-5 早洋麦#高 38 泰山 4 号豫麦 54 扬麦 Early piemium Gao38 Taishan-4 Yumai54 Yangmai158 # 阿夫济南 2 号泰山 5 号郑麦 9023 鄂恩 1 号 Funo Jinan-2 Taishan-5 Zhengmai9023 Een-1 洛夫林 10 #济南 9 号百农 3217 碧蚂 1 号川麦 Lovrin10 Jinan-9 Bainong3217 Bima-1 Chuanmai-22 南大 2419 # # 济南 13 博爱 7023 碧蚂 4 号繁 6 # Mentana Jinan-13 Boai7023 Bima-4 Fan6 欧柔#济南 16 内乡 5 号丰产 3 号绵农 4 号 Orofen Jinan-16 Neixiang-5 Fengchan-3 Miannong-4 碧玉麦济南 17 内乡 36 陕 229 绵阳 Quality Jinan-17 Neixiang36 Shan229 Mianyang-11 # 郑引 1 号鲁麦 1 号豫麦 2 号陕 7859 绵阳 St Lumai-1 Yumai-2 Shan7859 Mianyang-15 # 郑引 4 号鲁麦 12 豫麦 7 号陕优 225 绵阳 St Lumai-12 Yumai-7 Shanyou225 Mianyang-20 # # 北京 8 号鲁麦 14 豫麦 13 小偃 6 号绵阳 Beijing-8 Lumai-14 Yumai-13 Xiaoyan-6 Mianyang-26 京冬 8 号鲁麦 15 豫麦 17 小偃 22 五一麦# Jingdong-8 Lumai-15 Yumai-17 Xiaoyan22 Wuyimai 高优 503 鲁麦 21 豫麦 18 西安 8 号新克旱 9 号 Gaoyou503 Lumai-21 Yumai-18 Xi'an-8 Xinkehan-9 石家庄 54 鲁麦 23 周麦 9 号徐州 14 宁春 4 号 Shijiazhuang54 Lumai-23 Zhoumai-9 Xuzhou-14 Ningchun-4 冀麦 26 山农辐 63 豫麦 41 徐州 21 甘麦 8 号 Jimai-26 Shannongfu63 Yumai-41 Xuzhou-21 Ganmai-8 冀麦 30 Jimai-30 注 : 表示既是骨干亲本, 又是年推广面积超过 公顷的小麦品种 ; #表示小麦骨干 ( 重要 ) 育种亲本 ( 庄巧生,2003); 本研究选用年种植面积超过 公顷的小麦品种 56 份 ( 庄巧生,2003), 以及郑麦 9023 陕 229 小偃 22 宁春 4 号 泰山 4 号 泰山 5 号 鲁麦 12 高 38 高优 503 和陕优 225 等近年各生态区主推品种, 共计 66 份 选用了 9 份小麦育种骨干亲本中的育成品种, 其中有 4 份材料既是骨干亲本又是大面积推广品种 另外, 还扫描了 3 份重要育种亲本, 包括鲁麦 1 号 郑引 19

29 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 4 号和小偃 6 号 ( 详见表 2.1) 研究方法 基因组 DNA 的提取按照改进的 Devos 和 Gale(1992) 的酚 - 氯仿法提取全基因组 DNA, 具体操作如下 : 1) 取 2-3g 新鲜叶片, 加入液氮迅速研磨, 然后将粉末装入到 1.5mL 离心管中 ( 约占 1/3 管 ), 加入 900μl 65 预热的缓冲液 S ( ph8.5 Tris Cl 100mM,NaCl 100mM,pH8.0 EDTA 50mM, SDS 2%), 充分混匀 2) 将离心管置于 65 水浴中温浴 1.5-2h, 其间轻轻摇晃数次 3)8000rpm 离心 15min, 取上清液入另一 1.5mL 离心管, 加入 700μL 的酚 - 氯仿, 轻摇 10min 以上, 室温下 10000rpm 离心 10min 4) 将上清液转移到另一 1.5mL 离心管中, 加入等体积氯仿, 轻摇 10min 左右,10000rpm 离心 10min 5) 将上清液转移至另一个 1.5mL 离心管内, 加入 0.6 倍体积的异丙醇, 摇匀后静置一段时间, 勾出絮状 DNA 沉淀, 转入另一离心管中, 用 70% 的乙醇浸洗 2-3 次 ( 或 :10000rpm 离心 10min, 小心倒掉溶液, 最后将 DNA 转移到一新管中 6) 将 DNA 置于通风厨中通风干燥, 干燥后, 先加入 80μL TE, 加入 2µLRNaseA, 放在室温过夜消化, 纯化前再加入 620μL 1 TE, 再纯化 7) 加入等体积的酚 - 氯仿 (1:1), 轻摇 10min 以上, 于 10000rpm 下离心 10min 8) 取上清液, 加入等体积氯仿, 轻轻摇匀后, 于 10000rpm 下离心 10min 9) 取上清液, 加入 1/10 体积的 3mol/L 醋酸钠 (ph5.2), 混匀后加入 2 倍体积冰冷的无水乙醇 10) 轻轻摇匀后置于 -20 下 15-20min,10000rpm 离心 10min, 弃上清,DNA 用 70% 乙醇漂洗 2-3 次, 充分干燥后加入适量的 1 TE 溶解, 用作 DNA 原液 11) 用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量, 在 Smart SpecTM3000(BIO-RAD) 上测定浓度后, 取适量的 DNA 原液用 1 TE 稀释为 15-20ng/µL, 置于 4 备用, 并将剩下的 DNA 原液保存于 SSR 引物选取本研究选用分布于全基因组的 481 对 SSR 荧光引物 (ABI 公司合成 ) 其中包括 129 个 barc 引物 (Song et al.,2002;2005); 128 个 gwm 引物和 11 个 gdm 引物 (Röder et al.,1998; Pestsova et al.,2000); 99 个 wmc 引物 (Gupta et al.,2002); 75 个 cfd 引物和 19 个 cfa 引物 (Guyomarc'h et al.,2002;sourdille et al.,2003); 17 个 psp 引物 (Bryan 等,2003) 以及 3 个 gpw 引物 (Nicot et al.,2004) 引物的具体信息详见附表 1, 其在染色体上的位置, 主要参考日本 Kumogi 图谱 ( 部分引物根据 INRA 的物理图谱确定引物间的顺序 (Sourdille et al., 2004) 本研究选用的 SSR 引物均为随机挑选, 其多态性信息含量 (PIC) 从 0 到 , 不同 20

30 Percentage of Loci No. (%) 中国农业科学院博士学位论文 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 PIC 区间的位点个数详见图 PIC interval 图 2.1 本研究所用 SSR 在不同 PIC 区间的分布个数 Fig.2.1 The percentage of SSR loci in different PIC interval in this study 注 : 为本研究所用 SSR 引物在全文材料中的平均值 Note: The mean of PIC in total materials is PCR 扩增 PCR 反应在 PTC-225(MJ. Research, Inc) 型热循环仪上运行 扩增方法参照 Bryan 等人提供 的方法并略有改动 PCR 反应体系为 : DNA(20ng/µl) 2.0µL 10 PCR Buffer 1.0µL MgCl 2 (25mM) 0.8µL Primer(2µM) 1µL dntp (25µM) 0.12µL Taq 酶 (5U/µl) 0.12µL ddh2o 4.96µL TOTAL 10µL PCR 反应程序为 : 退火温度 (Tm) 随引物不同而不同 1) 94 5min 2) 94 45s 3) Tm 45s -0.5 /s 4) 72 45s +0.5 /s 5) go to 2 step 35 cycles 6) 72 10min 7) 10 10hr End 21

31 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SSR 引物筛选以及 PCR 扩增完成后, 在进行纯化之前, 一般需要进行聚丙烯酰胺凝胶电泳, 检测其扩增效果, 并对扩增结果进行分析, 以确定引物扩增目的片段的大致分子量范围, 为以后的基因型分析提供依据 PCR 扩增产物采用 6% 聚丙烯酰胺变性凝胶, 经银染 显影等程序, 得到扩增条带 主要试剂及溶液的配制 : (1) 10 TBE( 上槽液专用, 使用时稀释到 1 ) TrisBase 108g/L 硼酸 55g/L EDTA 7.43g/L (2) 6% Acrilamide 胶储存液 (6%PA 胶 ) 尿素 g Acri 114g 甲叉双丙烯酰胺 6g 10 TBE 100mL( 溶解后定容到 2000mL) (3) Loading Buffer 98% 甲酰胺 49mL 10mM EDTA 1mL(0.5M,PH=8.0) 0.025% 溴酚兰 0.125g 0.025% 二甲苯青 0.125g (4) 2% Repel Silane 490mL 氯仿 ( 分析纯 ), 加入 10mL 的 Repel Silane (5) 0.5% Binding Silane( 使用前现配 ) 2mL 95% 乙醇 0.5% 冰醋酸加入到 10μL 的 Binding Silane( 一块板的用量 ) (6) 1L 固定液 (10% 冰醋酸溶液 ) (7) 1L 银染液 ( 使用前现配 ) 1g AgNO3 1.5mL 37% 甲醛 1LH2O (8) 1L 显影液 30g/L Na 2 CO 3 冷却到 4, 使用前加入 1.5mL 37% 甲醛 200μL 10mg/mL 硫代硫酸钠制胶程序 : (1) 清洗平板与耳板 ; (2) 擦干耳板, 再用酒精擦拭 2 遍, 均匀地涂上 1.5mL 2%Repel Silane; (3) 擦干平板, 再用酒精擦拭 2 遍, 均匀地涂上 1.5mL 0.5%Binding Silane; (4) 组装起平板与耳板 ; (5) 灌胶, 可边灌边轻轻敲打耳板, 以便胶液均匀灌入, 并防止产生气泡 ; (6) 反向插入点样梳 电泳程序 : (1) 将胶板固定到电泳槽上, 分别加入上槽液和下槽液, 启动电泳仪, 预热 ; (2) PCR 产物于 95 变性 5min, 迅速置于冰水混合物中 ; (3) 清除气泡, 插入点样梳, 点入 5μL 样品 ; 22

32 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 (4) 当 Loading Buffer 带迁移至胶板地下缘时, 结束电泳 ( 约 1hr, 随扩增产物分子量大小而异 ) 显影程序 : (1) 脱色, 往脱色盒内倒入 1L 固定液, 轻摇至 Loading Buffer 带颜色褪去 ; (2) 清洗, 用蒸馏水清洗 10min, 中间换水一次 ; (3) 银染, 往银染盒内加入 1L 银染液, 轻摇 30min; (4) 冲洗, 用蒸馏水冲洗 5sec; (5) 显影, 将胶板快速转入盛有 1L 4 显影液的显影盒, 轻摇至出现带纹 ; (6) 定影, 放入固定液中, 轻摇 3~5min; (7) 清洗, 用蒸馏水清洗胶面至清洁 扩增产物的纯化与毛细管电泳检测扩增产物的纯化 : ABI3700 或 ABI3730 毛细管电泳对 DNA 的纯度要求非常严格, 必须对扩增产物进行去除残留盐分 蛋白质 去污剂 (SDS 等 ) 及 RNA 等的纯化处理 具体步骤如下 : (1) 选择不同颜色的荧光标记引物, 根据扩增产物分子量大小的不同, 混合纯化 取 2µL PCR 产物, 加入 3 倍体积的无水乙醇, 轻轻震荡混匀 2-3min,3000rpm 离心 30min; (2) 轻轻倒出液体, 倒置离心管片刻后,500rpm 离心 30-60s, 以甩干液体 ; (3) 加入 60µL70% 酒精, 轻轻振荡混匀 2-3min,3000rpm 离心 10min; (4) 轻轻倒出液体, 倒置离心管片刻后,500rpm 离心 30-60s, 静置 5min; (5) 加入 60µL dd H 2 O(dd H 2 O 的体积可根据荧光检测信号的强弱适当调整 ), 振荡混匀, 室温避光溶解 1h,4 保存备用 扩增产物的荧光检测 : (1) 取纯化产物 1µL 移入 96 孔上样板中 ( 纯化产物的用量可根据荧光信号的强弱适当调整 ; (2) 每个加样孔中再加入 9µL 甲酰胺和 0.18µL 内标, 充分振荡混匀, 离心将液滴甩到底部 ; (3) 将上样板 95 变性 5min, 迅速放入冰水中冷却 10min, 离心将液滴甩到底部, 在 ABI3700 或 ABI3730 上进行毛细管电泳 数据收集 : ABI3700 毛细管电泳结束后, 用 Genescan3.7 和 Genotyper3.7 两套软件进行样品原始数据的分析 ;ABI3730 毛细管电泳结束后, 用 Genemapper3.1 软件进行数据收集, 并根据引物筛选时确定的分子量范围及引物的基序进行条带分子量的确定 数据统计分析 本研究将 bp 数据转换成 0 1 数据, 采用 Ntsys2.10(Rohlf,2000) 软件进行主坐标分析 (Principal Coordinate Analysis,PCO 分析 ) 采用 PowerMarker3.25(Liu & Muse,2005) 软件进行等位变异 23

33 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 数和多态性信息含量 (PIC) 等基本统计量的运算分析, 并利用该软件计算等位变异频率 材料 间的遗传距离 在 Mega4.0 软件 (Tamura et al.,2007) 中进行 NJ(Neighbor Joining) 树的构建 每个基因座多态性信息含量用 PIC(Polymorphism Information Content) 表示, 采用 PowerMarker 3.25 软件进行运算 (Liu & Muse,2005) PIC = 1- l j 1 2 p ij 计算 ; 群体遗传多样性 (Ht) k 用多个基因座 PIC 平均值表示, 即 Ht= PIC i / k, 其中 k 表示所检测的基因座总数 (Nei,1973) i 结果与分析 我国小麦大面积推广品种及骨干亲本的遗传多样性分析 本研究选取我国小麦大面积推广品种 66 份 骨干 ( 重要 ) 育种亲本 13 份进行 481 个 SSR 位点的扫描分析, 其中 8 份材料既作为骨干 ( 重要 ) 育种亲本又被大面积推广利用, 所以供试材料共 71 份 虽然优秀的品种 ( 系 ) 往往被用于新一轮杂交亲本, 但并非所有的大面积推广材料都能成为骨干 ( 重要 ) 育种亲本, 也不是所有的骨干材料都能成为生产上的优秀品种 因此, 本研究分别对这两类群体进行了 DNA 分子水平上的比较研究 在 71 份供试材料中共检测到 3476 个等位变异, 大面积推广品种和骨干亲本分别检测到 3417 个和 1930 个等位变异 大面积品种每个位点的平均等位变异数分别为 7.10 个, 变幅为 1~22 个 ; 骨干亲本为 4.01, 变幅为 1~10 个 两者的遗传多样性指数 (Ht) 分别为 , 变幅 0~0.9188; , 变幅 0~ 主坐标 (PCO) 聚类分析表明, 大面积推广品种和骨干亲本交叉分布, 且向各个方向发散较好, 表明两者遗传基础较为宽广 ( 图 2.2A) 而且大面积推广品种和育种骨干亲本没有形成各自独特的组群, 说明两者之间不存在本质的区别, 即一个品种能否被大面积推广利用或能否成为骨干亲本, 不是由全基因组水平的广泛差异决定的 既是大面积推广品种又是骨干亲本 ( 或重要育种亲本 ) 的小麦品种, 如 1( 阿勃 ) 3( 阿夫 ) 5( 南大 2419) 10( 北京 8 号 ) 23( 鲁麦 1 号 ) 48( 碧蚂 4 号 ) 53( 小偃 6 号 ) 和 62( 繁 6) 都有自己独特的发散方向 ( 图 2.2A), 与其他材料相比的遗传距离相对较远 另外, 还可看出, 骨干亲本之间的平均遗传距离大于大面积推广品种间的平均遗传距离 为了更清晰地展示骨干亲本之间的遗传关系, 进一步对 13 份骨干亲本进行了 PCO 聚类分析 ( 图 2.2B), 结果表明, 这些材料分别聚在不同的方向上, 且距离中心原点的距离较大, 其相互之间存在较高的遗传异质性 这可能与材料份数少有一定的关系, 但从图 2.2A 和 B 的 X Y 和 Z 三个坐标轴来看, 图 2.2A 在三个坐标轴的值分别为 , 而图 2.2B 却达到 , 这表明骨干亲本之间的确存在较大的遗传距离 24

34 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 A 图 2.2 我国小麦大面积推广品种和育种骨干亲本的主坐标分析 A: 全部供试材料 ;B: 骨干亲本 Fig.2.2 The PCO analysis of cornerstone breeding parents and the varieties cultivated in large-scale based on 481 SSR loci. A: total materials; B: cornerstone breeding founders 注 : 表示大面积推广小麦品种 ; 表示骨干亲本 Note: is the symbol for varieties cultivated in large scale; is the symbol for cornerstone breeding founders of wheat 25 B

35 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 我国小麦育种骨干亲本与大面积推广品种的 Neighbor Joining 聚类分析 为了探讨大面积推广品种与育种骨干亲本间的遗传关系, 我们对这些材料用 Nei 氏距离 (Nei, 1973) 进行了 NJ 聚类分析 ( 图 2.3) 结果显示, 供试材料可划分为 6 组, 每一组中至少有一个骨干亲本 系谱分析表明, 每一组中骨干亲本和大面积推广品种之间均存在密切的血缘关系, 相同省份的品种基本聚在一起 聚类结果显示,A 组由两个遗传关系相对较远的两个分支组成, 大分支主要由来自山东和河北的品种组成, 该分支上的骨干亲本为碧蚂 4 号 北京 8 号 南大 2419 及早洋麦 另一分支的材料主要由来源于河北省的冀麦 26 冀麦 30 冀麦 38 和京冬 8 号及来自陕西省的陕 7859 组成, 其骨干亲本为洛夫林 10 B 组的材料除宁春 4 号及骨干亲本阿勃和欧柔外都来源于山东省 该分支又分为两个小分支, 一支为矮孟牛及其衍生的济南 16 鲁麦 15 及鲁麦 23, 另一支为含有阿勃和欧柔血统的材料 C 组主要由含小偃麦血统的品种组成, 包括小偃 6 号及其衍生的小偃 22 陕 229 郑麦 9023 以及含八倍体小偃麦血统的高优 503 等, 但丰产 3 号不属于该系统 划分为同一类群的新克旱 9 号和鄂恩 1 号与本组主体材料的遗传关系较远 D 组的品种主要来源于四川省和江苏省, 其中来源于四川省的材料都是繁 6 的后代 含阿夫血统的扬麦 5 号和扬麦 158 以及阿夫的系选品种博爱 7023 与阿夫聚在一起, 遗传关系较近 E 组主要由郑引 4 号血统的材料组成, 除陕优 225 外, 其他均是河南省的品种, 来自同一组合的郑引 1 号和郑引 4 号遗传关系最近, 豫麦 41( 温麦 4 号 ) 和温麦 6 号遗传关系也较近 F 组主要由含南大 2419 血统的内乡 5 号 徐州 14 与地方品种选系内乡 36 聚在一起 ; 五一麦及其衍生的甘麦 8 号聚在一起 从分支之间的遗传关系看, 代表四川及江苏省材料的分支 D 和代表河南省材料的分支 E 首先聚到一起, 与其他分支上材料距离较远 这两个分支内部的材料间遗传关系很近, 系谱分析显示, 绵阳 15 和绵阳 20 均为绵阳 11 系选品种, 博爱 7023 为阿夫系选品种 ; 来自分支 E 的材料均为郑引 4 号的后代或亲代 ( 郑引 1 号 ), 因此, 来源于这两个省的大面积推广材料遗传基础比较狭窄, 急待进一步拓宽 另外, 分支 A B 和 F 的遗传关系相对较近, 其材料主要来源于山东 河北 北京等省份, 这几个分支所用的骨干亲本较多 比如山东省的小麦材料分为 3 个派系, 一个是来源于阿勃 欧柔等的泰山号系列品种, 一个是来源于矮孟牛的系列品种, 还有一个是来源于碧蚂 4 号 北京 8 号的济南号系列品种 上述结果表明每一批大面积推广品种的形成都与一个或数个育种骨干亲本的出现密不可分, 突破性亲本的出现是推动品种更新换代的内在动力 26

36 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 图 2.3 大面积推广品种和骨干亲本基于 Nei 距离的 Neighbor Joining 聚类图 Fig.2.3 Unrooted Neighbor-Joining tree of varieties cultivated in large-scale and cornerstone breeding parents based on Nei s distance 注 : 红线为骨干亲本 ; 黑线为大面积推广品种 ; 为碧蚂 1 号和碧蚂 4 号 ; 为郑引 1 号和郑引 4 号 Note: Red line indicate the CBP; black line indicate the VSW; stand for BM-1 and BM-4; stand for St and St 我国小麦大面积推广品种及育种骨干亲本的系谱分析 基因组水平的分析结果往往需要追根求源从系谱上进一步证实, 因此, 本研究对这些品种进行了系谱分析, 并将大部分材料绘制到了系谱图上 ( 图 2.4) 系谱是以闻名世界的组合瑞梯(Reiti, 意大利地方品种 )/ 威尔赫明那 (Wilhelmine, 荷兰 )// 赤小麦 (Akagomughi, 日本 ) 开始的, 系谱分析表明, 除了我国小麦育种早期所用本地优良的地方品种燕大 1817 成都光头 蚂蚱麦等, 其他骨干亲本多来自于这一血统, 如南大 2419 阿夫 阿勃 五一麦 西农 6028 欧柔 洛夫林 10 以及重要育种亲本郑引 4 号 矮孟牛和小偃 6 号等 由此可见, 这一组合对我国小麦育种做出了巨大贡献 另外, 从系谱图中可以看出, 每一个骨干亲本都会派生一批大面积推广品种, 这与图 2.3 NJ 无根树分析结果是完全一致的 另外, 从系谱图还可看出, 骨干亲本除衍生大面积推广品种之外, 又是新一代骨干亲本的奠基者 例如从 1921 年开始推广的南大 2419, 衍生了阿夫 阿勃 欧柔 郑引 4 号等上世纪 50~80 年代小麦骨干亲本, 阿勃又衍生了洛夫林 10 号 矮孟牛, 郑引 4 号衍生了小偃 6 号等上世纪 80~90 年代的骨干亲本 与 66 份大面积推广品种间的遗传距离相比 (0.2127~0.6723), 13 份骨干亲本间的遗传距离 27

37 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 较大 (0.4310~0.6976)( 表 2.2), 与 PCO 聚类分析结果一致 ( 图 2.2) 另外, 分析多个来自相同组合的成对材料 ( 骨干亲本 大面积推广品种 ) 发现, 亲本碧玉麦与大面积推广品种碧蚂 1 号 ( 碧玉麦 / 蚂蚱麦 ) 的遗传距离为 , 与骨干亲本碧蚂 4 号 ( 碧玉麦 / 蚂蚱麦 ) 的遗传距离为 亲本碧蚂 4 号与大面积推广品种济南 2 号 ( 碧蚂 4 号 / 早洋麦 ) 的遗传距离为 , 与骨干亲本北京 8 号 ( 碧蚂 4 号 / 早洋麦 ) 的遗传距离为 ,; 亲本早洋麦与济南 2 号的遗传距离为 , 与北京 8 号的遗传距离为 作为南大 2419 第三代品种的郑引 1 号和郑引 4 号, 其与郑引 1 号的遗传距离为 , 与郑引 4 号的遗传距离为 从大面积品种来看, 亲本繁 6 与其一代品种绵阳 11 绵阳 20 和绵阳 15 的遗传距离分别为 :0.3633,0.3992,0.4289; 与其二代品种川麦 22 和绵阳 26 的遗传距离分别为 和 因此, 骨干亲本相对其他品种存在较高的遗传异质性, 成就一份骨干亲本需要对原有骨干亲本进行较大改造, 而成就一份超千万亩品种需做的改造则相对较弱 表 2.2 骨干亲本在 481 个 SSR 位点的遗传距离 Table 2.2 Genetic distance among different founder genotypes at 481 loci

38 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 成都光头 Chengduguangtou 碧玉麦 quality 川育 9 号 Chuanyu-9 五一麦 Wuyimai 济南 2 号 Jinan-2 西农 -64(4)43 选系 2 Xinong-64(4)43-s2 矮粒多 Ardito IBO-1828 瑞梯 Rieti 威尔赫明那 Wilhelmine 成都光头中农 28 Chengduguangtou Villa Glori, Mentana 偃大 24 Yanda-24 印度 824 NP-824 碧蚂 4 号 Bima-4 印度 824 NP-824 阿夫 Funo 苏联早熟 1 号 Sulianzaoshu-1 南大 2419, 敏塔那 Mentana IBO-1828 希望萨其尔 Hope Thatcher 泰山 1 号混合 ( 白火麦 + 碧玉麦 + 白芒麦 ) Taishan-1 Mix (Baihuomai+Quality+Baimangmai) 咸农 39 Xiannong-39 百农 3217 Bainong-3217 阿夫 Funo 丹麦 1 号 Danmai-1 西北 60 Xibei-60 内乡 5 号 Neixiang-5 阿勃 Abbondanza 丰产 3 号 82(9)2-1 Fengchan-3 山前麦 玛瑞亚 Sanra Maria 丰塔隆科 Fontarronco 济南 13 Jinan-13 山农辐 66 Shannongfu-66 高赖小麦 Gaolai wheat 鲁麦 23 Lumai-23 Tal 扬麦 1 号 Tal Yangmai 矮孟牛 Aimengniu 鲁麦 15 胜利麦 Lumai-15 Triumph 弗拉辛内托 405 Frassineto-405 奥托诺米亚 Autonomia Yumai21 Tal 山农辐 63 Tal Shannongfu-63 济南 16 Jinan-16 赤小麦 Akagomugh i Duri di Puglia Bavilla 中农 28 Villa Glori 达米亚诺 ( 反交 ) Damiano Duecentodieci 阿夫阿奎拉 Funo Aquila 博爱 7023 Boai-7023 阿桑 San Pastore 新萨其胜利麦 Marroqui-588 Newthatch 无芒 1 号 Triumph 阿勃玛拉 Wumang1 Abbondanza Mara 矮秆早繁 6 洛夫林 10 跃进 5 号杂种 Aiganzao Fan-6 Fronteria Lovrin-10 Yuejin-5 Hybrid 津丰 1 号胜利麦郑引 4 号郑引 1 号 Jinfeng-1 Triumph St St 肯尼亚绵阳 11 川麦 20 弗朗坦那 Kenya C9008 京冬 8 号孟县 F 2 Jingdong8 甘麦 8 号矮秆早 Mengxian-94 Mianyang-11Chuanmai-20 Frontana 辉县红 Ganmai-8 山前麦 Xi an-8 Huixianhong 孟县 201 偃师 4 号绵阳 20 绵阳 15 川麦 22 Mianyang-20 Mianyang-15 Chuanmai-22 欧柔蚰包 Mengxian-201 Yanshi-4 郑州 761 西安 8 号牛朱特豫麦 7 号 Xi an-8 Orofen Youbao Neuzucht 鲁麦 1 号 Yumai-7 豫麦 18 碧玉麦蚂蚱麦 Lumai-1 Yumai18 扬麦 4 号绵阳 26 Quality Mazhamai 矮丰 3 号 F Mianyang-26 山农辐 63 1 Yangmai-4 Aifeng-3 内乡 5 号 Shannongfu-63 百农 791豫麦 2 号 Neixiang-5 早洋麦 Early Piemium 辛石 3 号 Xinshi-3 石家庄 54 Shijiazhuang54 碧蚂 1 号 Bima-1 北京 8 号 Beijing-8 北京 Beijing 豫麦 13 早洋麦 Yumai-13 Early Piemium 阿玛 Ama Bainong791 Yumai-2 温选 1 号 Wenxuan-1 豫麦 2 号 Yumai-2 豫麦 21 偃大 7406 Yanda7406 豫麦 17 Yumai1 郑州 17 7 Zhengzhou17 65(14 ) 1 郑州 761 Zhengzhou76 1 百农 791 Bainong791 温麦 4 号温麦 6 号 Wenmai-4 Wenmai-6 扬麦 158 Yangmai-158 小偃 96 红宝石激发 Xiaoyan-96 小偃 6 号矮孟牛 V Xiaoyan-6 AimengniuV NS2761 F 1 阿夫 Funo 小偃 107 XiaoYan107 陕优 225 小偃 22 ShanYou225XiaoYan22 济南 9 号 Jinan-9 徐州 14 Xuzhou-14 陕 7859 Shan7859 扬麦 5 号 Yangmai-5 图 2.4 我国大面积推广小麦品种及育种骨干 ( 重要 ) 亲本的系谱图 ( 金善宝,1983; 庄巧生,2003; 王江春,2006) Fig.2.4 The pedigree sketch of wheat varieties cultivated in large scale and their cornerstone breeding parents 29

39 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 来自相同组合的骨干亲本和大面积品种的遗传组成分析 为了探讨小麦育种骨干亲本和大面积推广品种在基因组水平的异同, 我们对来自相同亲本组合的碧蚂 1 号 碧蚂 4 号 ( 碧玉麦 / 蚂蚱麦 )( 庄巧生,2003) 及郑引 1 号 郑引 4 号 (Mara x San Pastore)( 进行了全基因组等位变异组成分析 在 PIC<0.4 的位点中, 随着 PIC 的增大, 两组品种出现非优势等位变异的位点数增加的趋势 其中, 大面积推广品种碧蚂 1 号和郑引 1 号随着 PIC 的增大, 首先出现非优势等位变异, 碧蚂 4 号和郑引 4 号出现非优势等位变异位点 PIC 高于碧蚂 1 号和郑引 1 号, 非优势等位变异数分别为 : 碧蚂 1 号 24 个 碧蚂 4 号 18 个 ; 郑引 1 号 16 个 郑引 4 号 12 个 ( 图 2.5) 来自同一组合的骨干亲本含有的优势等位变异数多于大面积推广品种, 育成年代较早的碧蚂 1 号 碧蚂 4 号组 (50 年代中至 60 年代初 ) 拥有的优势等位变异数少于育成年代较晚的郑引 1 号 郑引 4 号组 (70 年代 )( 庄巧生,2003) PIC 低 高 碧蚂 1 号碧蚂 4 号郑引 1 号郑引 4 号 图 2.5 碧蚂 1 号 碧蚂 4 号及郑引 1 号 郑引 4 号在 PIC<0.4 位点的等位变异组成分析 Fig.2.5 Allele compositions at loci with PIC<0.4 of BM-1, BM-4 and St , St 注 : 绿色为优势等位变异, 黄色为非优势等位变异, 白色为缺失 Note: Green indicate the major allele of each locus; Yellow indicate the other allele; White indicate missing 2.3 讨论 种质遗传基础的拓宽是育种工作的基础 大面积推广小麦品种和育种骨干亲本分别在小麦的生产和育种历史上扮演着非常重要的角色 ( 庄巧生,2003) 本研究通过 SSR 标记, 比较了小麦大面积推广品种和育种骨干亲本内部材料间的遗传关系及相互之间的遗传组成差异, 试图从基因组水平总结小麦育种历史, 以更好的服务于未来的小麦育种 研究结果表明, 既为育种骨干亲本, 又被大面积推广利用的小麦品种, 相对其他品种具有更高的遗传异质性 ( 图 2.2A), 从全基因组水平来看, 育种骨干亲本相互之间的遗传差异大于所有材料之间的平均值 PCO 分析表明,13 份育种亲本都有自己独特的辐射方向, 且呈排斥趋势 ( 图 2.2B), 表明历史上总结出的育种骨干亲本各有各的特色, 其相互之间的遗传距离较大 另外, 南大 2419 推出 20 年后, 作为其后代的阿勃和其姊妹系达米亚诺衍生的阿夫能够继续成为育种骨干亲本, 除了阿勃 阿夫自身产量及抗病等性状比较突出外, 还可能与它们和南大 2419 之间已经产生了足够大的异化有关 因此, 已有的骨干亲本之间遗传关系较远, 这一历史事实给我们以很大的启示, 即突破性材料的创造, 首先在拓宽遗传基 30

40 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 础上下功夫 而且, 由于我国小麦育成品种在育种选择过程中, 遗传多样性下降比较严重 ( 郝 晨阳等,2005), 因此, 育种工作应始终坚持育种材料遗传基础的拓宽 种质创新是育种取得突破的前提 关键种质的发现 创造和利用, 是育种工作取得突破的基础 ( 图 2.3) 大量的育种事例证明优异种质的创新与评价利用对作物育种工作起着决定性的作用 例如,80 年代前后作为骨干亲本利用的矮孟牛在短短 26 年内就育成了 13 个小麦品种, 其中 4 个品种的年种植面积超过了一千万亩 ( 李晴祺,1998) 从图 2 也可看出, 矮孟牛及其后代单独聚成一类, 而且与其他品种的遗传关系则较远, 这表明矮孟牛独树一帜的特点, 是小麦育种材料的一次突破 寻根求源, 矮孟牛是在高水平上将矮秆与多抗 高产 熟期适中这些难以结合的育种目标性状融为一体, 克服了矮秆常与晚熟 早衰 多病 高产性能差相联系的技术难题, 同时, 具有配合力好 遗传传递力强 含有利显性基因多等良好的遗传特点, 这样就有利于高产 稳产新品种的选育 ( 李晴祺,1998) 矮孟牛的创新是种内具有突出优点的 偏材 和 良材 相结合的典型 种质的创新还需扩大利用小麦的野生近缘植物 人工合成种及地方品种, 挖掘其隐藏优异基因 目前品种审定过程中要求参试品种比对照增产 3~5%, 而川麦 42 的产量在多年区域实验中比对照增产 20% 左右 ( 廖杰等,2007), 是最近几年西南地区育成的突破性品种, 该品种产量的重大突破就是源于硬粒小麦 - 节节麦人工合成种 (SynCD768/SW3243// 川 6415) 的创制及应用 因此, 主动 耐心地进行资源创新研究, 对育种和生产不但具有重要的现实意义及长远的战略意义 目前, 小麦核心种质和微核心种质的建立为资源创新奠定了良好的材料基础 ( 郝晨阳等 2008), QTL 高代回交体系的建立为利用微核心种质 人工合成种及野生四倍体小麦, 创造突破性育种材料提供了成熟的方法体系 (Tanksley and McCouch,1997;Zamir,2001;Liu et al.,2006) 骨干亲本与新品种选育 骨干亲本容易出品种的原因, 可从育种家亲本选配原则中得知一二 庄巧生先生 (2003) 根据国内外长期育种实践总结出亲本选择经验 : 用于杂交的两个亲本品种 ( 材料 ), 其综合性状水平应该尽可能的高或好, 两亲本的平均值 ( 如能量化 ) 应尽可能的高或好 ; 两亲本不能有共同的缺点 ; 两亲本的互补性要强 ; 两亲本性状 ( 特别是产量构成因素 ) 的一般配合力要好 如何从基因组水平来理解和认识呢? 从图 2.2 可看出, 不同的小麦骨干亲本之间遗传关系比较远, 各具有自己的特色, 而且新一代骨干亲本的形成往往建立在原有的骨干亲本基础之上 ( 图 2.4) 表现在性状上可能是一份育种材料除了综合性状比较好 ( 骨干亲本传递给新一代骨干亲本的性状 ) 以外, 必须有自己非常优异的性状 ( 平均值非常高 ), 是某个性状上的偏材 ; 同时, 只有与其他材料遗传关系远, 与其他材料互补的等位基因才比较多, 提高了理想基因型出现的机会, 表现为一般配合力比较高 另外, 从同一组合骨干亲本和大面积品种的遗传组成看, 骨干亲本拥有的优势等位变异比大面积品种的多, 非优势等位变异往往出现在遗传多样性比较高的位点 31

41 第二章我国小麦大面积推广品种与骨干亲本的分子评价 上 ( 图 2.5) 虽然优势等位变异对某个性状来说并不都是优异等位变异, 但这些等位变异在物种适应性 驯化及选择过程的某个阶段被较多的保留下来, 应该有一定的生物学意义或对人类是有益的 (Wright and Gaut,2004;Doebley et al.,2006; 张学勇等,2006), 更多的优势等位基因表现在性状上可能是优良性状多, 不良性状少 另外, 育种过程中的骨干亲本偏向选择 ( 待发表 ), 也证明了骨干亲本优异性状的遗传传递力比较强 总之, 骨干亲本的基因组学基础与其表现出的性状是基本一致的, 解析育种家选择亲本性状在基因组水平留下的 痕迹, 可为将来小麦的分子设计育种奠定基因组学基础 32

42 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代的染色体保守遗传区段浅析 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代染色体保守遗传区段浅析 摘要 : 对阿勃和郑引 4 号及其后代材料进行全基因组扫描, 结果表明 :( 1) 育种中存在很强的偏向选择 : 阿勃的后代材料尤其第一 二代材料, 多为阿勃基础上的修修补补 ; 而郑引 4 号的保守遗传信息在 4 个世代相差不是太大, 但第一 二代材料的保守遗传信息远低于阿勃, 可能与这两个骨干 ( 重要 ) 育种亲本被推广利用的麦区有关 (2)PCO 聚类分析表明这两套材料为相互独立的群体 ; 但是在 21 个连锁群找到的 V 字形选择谷在这两套材料间的一致性非常好 阿勃和郑引 4 号在全基因组水平的一致性检测研究为这一 矛盾 找到了答案, 即在 PIC 比较低的位点, 阿勃和郑引 4 号共享的等位变异比较多, 两者的后代材料也高频率的保留了亲本的等位变异 ; 而在 PIC 比较高的位点, 阿勃和郑引 4 号携带的等位变异不一定一致, 但是引物在两套材料间都显示了较高的多态性信息含量, 其反应出来的 SSR 位点特点是一致的 已有关键基因和主效 QTLs 多定位在 V 字形选择谷, 表明这些选择谷可能与重要农艺性状有关 (3) 本研究根据现有群体对小麦基因组的连锁不平衡进行了探讨, 结果表明 A 基因组的连锁不平衡程度最强, 而 B 基因组的连锁不平衡程度最弱, 可能与 A 基因组经历了很强的选择压及 B 基因组供体拟斯卑尔脱山羊草的异花授粉习性有关 结合 5D 染色体引物个数对检测选择谷影响的模拟, 建议在进行小麦全基因组关联分析时, 标记间的遗传距离最好控制在 5cM 以内 前言 我国小麦育种生产实践表明, 有 16 个亲本品种在杂交育种中起着骨干作用, 由它们衍生的品种数目较多, 对小麦生产贡献较大 如蚂蚱麦 燕大 1817 江东门 成都光头 蚰子麦 碧蚂 4 号 北京 8 号 西农 6028 五一麦 南大 2419 欧柔 阿夫 阿勃 早洋麦 洛夫林 10 和墨巴 66 等都衍生了许多品种, 此外, 一些重要育种亲本郑引 4 号 山前麦等也都衍生了大量品种 ( 金善宝,1983; 庄巧生,2003) 第二章的研究表明, 骨干亲本不但派生了一批批大面积推广品种, 同时又是新一代育种骨干亲本的奠基者 那么, 骨干亲本这一小麦中的 精华 究竟对育种贡献了什么? 如何从基因组水平来理解呢? 传统育种主要选择综合性状好 没有严重缺点 配合力好的亲本, 且两亲本的性状互补性要强 因此, 育种的骨干亲本或重要育种亲本应该都具有较多的优异农艺性状, 且其具有较高的遗传传递力, 易被育种家选择而保留下来 ; 具有较少的不良农艺性状, 且容易被其他品种弥补 作物在长期进化过程中, 除自然选择外, 还经历了两次大的人工选择, 即人工驯化选择和育种选择, 使栽培种与野生种之间 现代品种与古老的地方品种之间在群体遗传结构及性状上形成了很大的差异 ; 在基因组中, 一些承受强选择作用的基因在群体中的多样性显著降低, 同时这些基因附近区域的遗传多样性也明显下降, 产生较强的选择牵连效应 育种家对优异性状的选择会在基因组上留下痕迹, 由于选择牵连效应的影响, 靶基因两侧一定基因组区段内的遗传多样性必定降低 连锁不平衡性增加 等位变异发生偏分布 (Flint-Garcia et al.,2003; 张学勇等,2006; 游光霞和张学勇,2007) 因此, 我们可以通过研究后代材料保留骨干亲本的染色体区段, 去寻找历史选择的 标签 ( 如图 3.1) 33

43 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代的染色体保守遗传区段浅析 因此, 本研究选用郑引 4 号 阿勃及其衍生品种两套材料进行对比分析, 通过全基因组 481 个 SSR 位点的扫描, 分析衍生后代中保留骨干亲本的染色体区段, 探讨骨干亲本易出品种的可 能原因 图 3.1 骨干亲本保守遗传区段研究思路示意图 Fig. 3.1 The sketch map for studying the conserved chromosome region from cornerstone breeding parents 3.1 材料与方法 实验材料 郑引 4 号 (St2422/464) 及其后代材料 110 份, 阿勃及其衍生材料 134 份 ( 表 3.1, 详见附表 2) 这两个重要亲本均为 60 年代初到 70 年代末小麦育种上应用的重要育种材料 阿勃主要在西北春麦区和西南冬麦区推广使用, 其在西北春麦区表现综合性状好, 适应性广, 具有高产 抗锈病的突出优点, 但存在晚熟 口松 品质较差的缺点 它既是大面积推广品种 ( 其最大年推广面积 公顷,1960 年 ), 又是著名的骨干亲本, 衍生了 200 多个品种 ( 张学勇等, 2001; 庄巧生,2003) 郑引 4 号属弱冬性, 秆矮 ( 株高约 75~80cm) 抗倒伏 小穗较多 长方, 多花多实, 抗锈病性好, 除对 70 年代流行条锈小种免疫外, 对叶锈病 秆锈病也有一定抵抗能力, 缺点是晚熟 叶片干尖较重 熟相差 籽粒不饱满, 仅在河南省南部地区生产上有过小面积种植 但该品种具有许多突出优点, 是我国重要的育种亲本, 尤其在黄淮冬麦区育成了许多优异品种 ( 图 3.2) 因此, 这两套材料代表了不同的生态类型 另外, 本研究还纳入了 56 份年推广面积大于 公顷的小麦品种,47 份与阿勃或郑引 4 号及后代杂交的亲本,15 份其他育成品种及 3 份地方品种 ( 表 3.1; 附表 2) 34

44 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代的染色体保守遗传区段浅析 材料信息 Group of Varieties 阿勃及后代 Abbodanza and its descendants 郑引 4 号及后代 St2422/464 and its descendants 超千万亩品种 表 3.1 本研究供试材料 Table 3.1 Varietal groups included in the genotyping survey Varieties cultivated ever more than 66.7x10 4 hm 2 annually 对照亲本 Parents crossed with Abbodanza or St2422/464 其他育成品种 Other modern varieties 地方品种 Landraces 总计 Total 注 : 其中有些材料分别在不同的组, 可能出现交叉 Note: Some lines may cover two groups 份数 No 研究方法 SSR 数据的获得同第二章研究方法 数据统计分析 PIC 曲线绘制各个 SSR 位点的 PIC 利用 PowerMarker3.25 软件计算, 用 CurveDraw1.0 软件进行 PIC 曲线的绘制 遗传图谱绘制采用 MapDraw 软件 遗传信息一致性检测为了避免等位变异绝对长度遗传一致性检测造成的影响, 本研究采用标准等位变异长度进行材料间遗传信息的比较分析 (Vigouroux et al.,2003), 采用的公式为 : 标准等位变异长度 = ( 实际等位变异长度 - 平均值 )/ 标准差 并采用 Structure2.1 软件进行群体结构分析及 Q 参数的运算 本研究所用小麦群体的 LD 估计采用 Tassel2.0 软件计算 r 2 和 D (Flint-Garcia et al.,2003), 运行 Link. Diseq. 程序, 进行连锁不平衡估计 连锁不平衡分为染色体内连锁不平衡和染色体间连锁不平衡, 本研究计算了 A 35

45 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代的染色体保守遗传区段浅析 B D 基因组染色体内和染色体间的连锁不平衡及全基因组的染色体内连锁不平衡 将染色体 间标记的遗传距离定为 250cM 并根据 5D 染色体的标记个数, 进行模拟, 计算遗漏的 V 字形选择信号的数目, 来探讨选择牵连效应的最小遗传单位 注 : Note: 图 3.2 阿勃及郑引 4 号后代在全国的分布 Fig.3.2 The distribution region of the derivatives of Abbondanza and St in China 代表约 7 份阿勃后代材料, 图形的大小表示材料份数的多少 stands for about 7 accessions and the small one means less than 7 lines from Abbondanza 代表约 7 份郑引 4 号后代材料 ; 十大麦区见附表 2 标注 stands for about 7 derivatives of St ; 3.2 结果与分析 阿勃衍生材料与郑引 4 号衍生材料为两个相互独立的群体 对 134 份阿勃及其衍生后代 110 份郑引 4 号及其衍生后代进行主坐标 (PCO) 分析表明, 这两套材料比较明显的分为两组, 群体间材料有一定交叉, 但交叉很少, 说明两者为相互独立的群体 ( 图 3.3) 同时, 由该图可看出, 郑引 4 号及其衍生品种在 PCO 图上比较集中的聚到一起, 而阿勃及其衍生品种向各个方向的发散比较好, 其遗传多样性水平高于郑引 4 号组 计算各自的遗传多样性指数, 郑引 4 号及其衍生品种为 0.50; 阿勃及其衍生品种为 0.53, 与聚类图结果一致 36

46 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代的染色体保守遗传区段浅析 图 3.3 阿勃 郑引 4 号及其衍生后代的主坐标分析 Fig.3.3 A PCO analysis, based on genotype at 481 SSR loci, reveals that descendants of Abbondanza and St2422/464 form two separate sub-populations. 注 : 粉红色表示郑引 4 号及其衍生后代 ; 浅绿色表示阿勃及其衍生后代 Note: Pink: St2422/464 descendants; Light green: Abbondanza descendants 阿勃及郑引 4 号在全基因组水平上的保守遗传信息研究 阿勃所衍生的第一代 第二代品种的遗传信息与阿勃的遗传信息一致性非常高 ( 图 3.4 A; 表 3.1), 表明在育种过程中, 育种家选中的后代材料并非两亲本遗传信息 1/2 的简单相加, 而是有所偏好, 选中的后代材料更接近骨干亲本 其第三代 第四代品种保留下来的遗传信息, 除了为亲本间共有的非常重要的遗传信息外, 从阿勃保留下来的遗传信息也应该是其精华所在 阿勃第二代与第三代保留阿勃遗传信息的比例落差较大 ( 图 3.4 A), 推测原因, 阿勃的第三 四代品种主要由其衍生的第二代品种洛夫林 10( 系谱 : 阿勃 / 胜利麦 // 无芒 1 号 ) 所衍生, 洛夫林 10 又是上世纪八 九十年代的骨干亲本, 肯定存在突出的 好于原有骨干亲本的地方, 洛夫林 10 的遗传信息可能受无芒 1 号的影响较大 因此, 本研究统计的阿勃的第三 四代品种的遗传信息保留阿勃的信息较少 37

47 Q (membership coefficient) Q (membership coefficient) 中国农业科学院博士学位论文 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代的染色体保守遗传区段浅析 郑引 4 号的后代材料都较大比例地保留了其遗传信息, 其中第一 二代保留下来的遗传信息比第三 四代保留的多 但是其第二代品种保留郑引 4 号的信息远小于阿勃的第二代品种, 这可能与育种单位的育种力量有关 郑引 4 号主要在黄淮冬麦区被广泛用作育种亲本, 由于该麦区的育种力量比较强, 育种家手头上往往也有比较优异的育种材料, 因此, 其后代材料的优异性状来自郑引 4 号和其他亲本的比例基本相当 而阿勃主要在西北春麦区和西南冬麦区推广及用作骨干亲本, 由于自身适应性非常好 且其综合性状也好, 而且基本满足当时的生产实际要求, 因此, 许多材料是在阿勃遗传基础上的修修补补, 无须大动 TyepI TypeII Type I Type II Abbodanza GenI GenII GenIII GenIV 0.0 St4 Gen I Gen II Gen III Gen IV A B 图 3.4 阿勃 (A) 郑引 4 号 (B) 保守遗传的基因组信息 Fig. 3.4 The conserved genetic information from Abbondanza (A) and St2422/464 (B) 表 3.1 阿勃和郑引 4 号各世代的分组信息 Table 3.1 The membership coefficient of different gernerations of Abbondanza and St2422/464 阿勃 Material 类型 I TypeI 类型 II TypeII 材料份数 No. 郑引 4 号 Material 类型 I TypeI 类型 II TypeII 材料份数 No. AB ST G G G G G G G G 阿勃及郑引 4 号的保守遗传的染色体区段分析 阿勃及郑引 4 号衍生的后代都不同比例的保留着骨干亲本的遗传信息, 那么从骨干亲本保留下来的基因组信息究竟是什么呢? 我们对每个世代的材料在不同染色体上保留骨干亲本的等位变异比例进行了统计, 结果表明, 阿勃和郑引 4 号的可保守遗传染色体区段基本一致 在一些保留比例较高的位点, 阿勃和郑引 4 号的一致性非常好, 如 barc135,barc316,gwm415,cfd39, gwm291 等位点, 不同世代材料都高比例的保留了亲本的等位变异 ; 在保留比例比较低的位点, 如 wmc705,barc360,wmc713,barc141,gwm186, wmc327,barc319,gwm410 等位点, 两 38

48 Frequency(%) Frequency(%) 中国农业科学院博士学位论文 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代的染色体保守遗传区段浅析 套材料也基本一致 ; 另外, 有一些位点的保留比例在两套材料间相差较大, 如 barc122,barc117, barc56,gwm304,barc1,gwm126,wmc577 等位点, 分析存在差异的原因发现, 如果骨干亲本携带的是优异等位变异 ( 本研究中将 56 份超千万亩小麦品种的优势等位变异, 暂定为优异等位变异进行研究 ), 则后代材料保留骨干亲本优异等位变异的比例就非常高, 反之, 则在不同世代间被迅速替换, 而且在超千万亩品种中频率越高的等位变异, 被替换的速度越快 从整个染色体水平来看, 后代保留骨干亲本等位变异比例高的位点往往位于连锁群两端, 远离着丝粒 GenI GenII GenIII GenIV Loci 0 Loci B135 B122 B316 C705 B303 B117 B56 S304 B360 S415 B1 C713 B141 B330 S186 C327 B230 B319 C216 cfd39 C110 S126 C577 C524 C727 S291 S410 major Freq ab st Loci Gen I Gen II Gen III 3.9 barc135 barc barc316 wmc705 barc303 barc117 barc56 gwm304 barc360 gwm415 barc1 wmc713 barc barc gwm186 wmc327 barc230 barc319 wmc216 cfd39 wmc110 gwm126 0 wmc577 wmc524 wmc727 gwm291 gwm A B C D 图 3.5 阿勃和郑引 4 号在 5A 染色体上的保守遗传区段. A 为阿勃衍生的 4 个世代材料保留骨干亲本的比例 ;B 为阿勃和郑引 4 号在 5A 染色体的等位变异组成 ;C 为郑引 4 号衍生的 3 个世代材料保留骨干亲本的比例 ;D 为不同位点在 5A 连锁群的位置 Fig. 3.5 Changes in allelic frequency on chromosome 5A. A. Varieties derived from Abbondanza; B. Distribution of the SSR markers on 5A. and - indicate whether the alleles in the two founders are the same one or not with ones conveyed by the majority of the set of 56 widely planted varieties. C. Varieties derived from St2422/464; D. Genetic map of chromosome 5A. 39

49 Frequency of major allele 中国农业科学院博士学位论文 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代的染色体保守遗传区段浅析 不同保留比例 SSR 位点 PIC 在染色体上的分布 100% 80% 60% 40% 20% y = x R² = % PIC 图 3.6 SSR 位点优势等位变异与 PIC 间的关系 Fig. 3.6 The correlation between the frequency of major allele and PIC of SSR loci 2A 2B 2D 图 3.7 阿勃 ( 蓝色 ) 和郑引 4 号 ( 红色 ) 后代在小麦第二部分同源群上的 PIC 分布 Fig. 3.7 Selection sweeps across the homoeologous group 2 chromosomes in varieties derived from Abbondanza (red) and St2422/464 (blue) 40

50 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代的染色体保守遗传区段浅析 为了考察骨干亲本不同保留比例 SSR 位点的特点, 首先对不同 SSR 位点的优势等位变异与 PIC 间的关系进行了研究 随着 SSR 位点优势等位变异 ( 在所有等位变异中, 频率最高的等位变异 ) 的增高, 其 PIC 值在降低, 且达到高度相关 ( 图 3.6) 优势等位变异在材料中的分布频率越高,PIC 值越低, 就越偏离达尔文 平衡选择 中的等位变异分布, 即等位变异发生偏分布, 这可能源于物种适应 驯化或育种中的自然选择与人工选择 因此, 可通过 PIC 在染色体上的分布情况, 探讨发生选择的染色体区段 PIC 在 2A 2B 2D 上的分布是不均匀的, 在全基因组中的分布也是如此 将同一染色体上所有 SSR 位点的 PIC 值用线连起来, 就可看出每条染色体上都不同程度地出现了 V 字形谷 ( 图 3.7) 图 3.7 中的 Ht 虚线为每条染色体上 SSR 位点 PIC 的平均水平, 其中, 阿勃和郑引 4 号高度保守遗传的 SSR 位点的 PIC 比较低, 位于 Ht 线以下, 往往在 V 字形的谷底, 这些位点的等位变异都发生了一定程度的偏分布, 说明在小麦基因组进化过程中经历了不同程度的选择作用, 而且这一规律在阿勃和郑引 4 号两套材料中的趋势基本一致 根据选择牵连效应原理, V 字形选择谷附近极可能存在控制重要农艺性状的基因 阿勃和郑引 4 号在全基因组水平的一致性检测 PIC<0.20 Abbodanza-CS Abbodanza-St2422/ A PIC<0.30 Abbodanza-CS Abbodanza-St2422/ B Abbodanza-CS 0.30<PIC< Abbodanza-St2422/464 C PIC>0.55 Abbodanza-CS 6 4 Abbodanza-St2422/464 D 图 3.8 阿勃和郑引 4 号 阿勃和中国春在全基因组水平的一致性比较 Fig.3.8 The comparison of alleles shared by Abbondanza-St2422/464 and Abbondanza-CS 阿勃和郑引 4 号的后代材料在每条染色体的 PIC 曲线一致性非常好, 为了探讨可能的原因, 首先对阿勃和郑引 4 号在全基因组水平的共享等位变异的个数进行了研究 本研究采用了标准 41

51 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代的染色体保守遗传区段浅析 等位变异 (Vigouroux et al.,2003) 进行材料间的比较, 并选取中国春作对照 除等位变异在阿勃 - 郑引 4 号及阿勃 -CS 未能扩增的位点外, 参与比较的位点可分为 4 组 :PIC<0.2 的有 56 个, PIC<0.3 的有 88 个,0.3<PIC<0.55 的有 116 个,PIC>0.55 的有 253 个 研究结果表明, 在 PIC 比较低的位点 ( 图 3.8 A 和 B), 阿勃和郑引 4 号共享的等位变异数远高于阿勃和中国春共享的等位变异 ; 随着 PIC 值的增高, 阿勃和郑引 4 号间的差异等位变异数增多, 在 PIC>0.55 范围的 SSR 位点, 阿勃和郑引 4 号间及阿勃与中国春间共享的等位变异数大大降低 连锁不平衡估计 小麦是自交作物, 理论推测其连锁不平衡程度应该比较高 ; 但是在小麦的育种过程中, 小麦又被人为地进行了杂交, 因此, 其 LD 水平究竟多大, 有待于进一步研究 同时, 为了探讨寻找 V 字形选择信号所需要的标记密度, 本研究对 481 个 SSR 引物在所有供试材料中进行了连锁不平衡分析 研究结果表明, 全基因组水平的连锁不平衡程度远高于不同染色体组的, 其中 A 组的连锁不平衡程度最高, 可能经历的选择压也是最大的 ;B 组的连锁不平衡程度最低, 可能与 B 组的供体拟斯卑尔脱山羊草异花授粉习性有关 如果以 r 2 =0.1 为域值 (Zondervan & Cardon,2004),B 组的 LD 约为 15cM,D 组约为 25cM,A 组约为 60-70cM; 如果以 r 2 =0.2 为域值 ( 余建民, 私人通讯 ),B 组的 LD 约为 5cM,D 组约为 15cM,A 组无明显规律 ( 图 3.9) 图 3.9 小麦 A B D 染色体组及全基因组的连锁不平衡分析 Fig. 3.9 The LD analysis between each two markers from Genome A, B, D and whole genome 42

52 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代的染色体保守遗传区段浅析 A 图 3.10 全基因组扫描工作最小遗传单位估计 Fig.3.10 The evaluation of the loci number needed in whole genome scanning B 为进一步探讨评估全基因组受选择程度所需要 SSR 位点的间隔距离, 我们以 5D 染色体为例进行 SSR 位点数的模拟 从 5D 染色体扫描的 42 个位点中, 间隔挑选 28 个 SSR 位点进行模拟, 结果如图 3.10 所示 在第一次模拟中, 有 4 个 V 字形选择谷完全丢掉, 如 Xbarc205 Xcfd101 Xgwm212 和 Xgwm565; 有两个位点的检测能力下降, 如 Xwmc318 和 Xwmc160 对其遗传距离进行分析发现,barc205 两侧的 gwm190 和 cfd57 间的遗传距离为 8.35cM cfd101 两侧的 Xbarc347 和 Xcfd12 间的遗传距离为 1.11cM Xgwm212 两侧的 Xgwm292 和 Xcfd29 间的遗传距离为 4.94cM Xgwm565 两侧的 Xbarc177 和 Xgwm654 间的遗传距离为 6.38cM; 而 Xwmc318 43

53 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代的染色体保守遗传区段浅析 两侧的 Xbarc44 和 Xcfd266 间的遗传距离为 1.76cM Xwmc160 两侧的 Xbarc322 和 Xcfd183 间的遗传距离为 3.02cM 在第二次模拟中, 有 3 个 V 字形选择谷完全丢掉, 如 Xbarc286 Xcfd157 和 Xcfd52; 有 1 个位点检测能力下降, 如 Xcfd12 Xbarc286 两侧的 Xcfd8 和 Xgwm639 间的遗传距离为 5.94cM Xcfd57 两侧的 Xgdm47 和 Xbarc347 间的遗传距离为 6cM Xcfd52 两侧的 Xbarc320 和 Xgwm292 间的遗传距离为 10.17cM; 而 Xcfd12 两侧的 Xcfd102 和 Xcfd101 间的遗传距离为 1cM 由此可见, 两位点间遗传距离超过 5cM 时, 选择谷就比较容易遗漏 ;1~5cM 的遗传距离能检测到选择作用, 但其强度相对较弱, 另外由于重组率的影响, 不同的染色体区段可能存在一定的差异 3.3 讨论 保守遗传的 SSR 位点在阿勃和郑引 4 号所衍生的两套材料间基本一致 保守遗传的 SSR 位点在阿勃和郑引 4 号两套后代材料间基本一致, 如果阿勃和郑引 4 号携带的是优异等位变异, 且该位点存在比较突出的优势等位变异, 则会被高度保守遗传 ; 如果携带的不是优势等位变异, 则骨干亲本等位变异的保留比例会逐代下降, 迅速被更优异的等位变异替换掉 但是由图 3.3 可看出, 阿勃衍生的后代材料与郑引 4 号的衍生材料在全基因组水平上显然为两个相互独立的群体 这与 PIC 曲线在两套材料间的高度一致性是否存在矛盾呢? 其实, 这两者之间并不矛盾, 阿勃和郑引 4 号两套后代材料的 PCO 聚类图是从全基因组水平上反应的材料与材料间的遗传关系, 郑引 4 号的后代材料发散方向一致, 比较集中的聚到一起, 阿勃的后代材料向相反的方向发散, 与郑引 4 号的后代材料遗传关系比较远 而每条染色体的 PIC 曲线图反应的是 SSR 位点的多态性信息含量, 由图 3.7 可以看出, 染色体上 SSR 位点的 PIC 分布是不均匀的, 形成了许多 V 字形选择谷 PIC 曲线在阿勃和郑引 4 号两套后代材料间吻合较好, 在 PIC 比较低的位点, 阿勃和郑引 4 号共享的等位变异比较多 ( 图 3.8), 两者的后代材料也高频率的保留了亲本的等位变异 ; 而在 PIC 比较高的位点, 阿勃和郑引 4 号携带的等位变异不一定一致, 但是引物在两套材料间都显示了较高的多态性信息含量, 其反应出来的 SSR 位点特点是一致的 V 字形选择谷与重要性状有关 选择牵连效应产生的显著降低靶位点及侧翼序列的多样性 增加该基因组区段的连锁不平衡性及使等位变异发生偏分布等三种效应往往在后代群体中保留一定的时间 因此, 通过对骨干亲本后代扫描找到的 V 字形谷附近应该存在控制重要性状的基因 (Rafalski & Morgante, 2004) 许多研究结果表明, 选择牵连作图的确是一种定位生态适应性相关基因及重要农艺性状的有效方法 如 Harr 等 (2002) 对果蝇 850Kb 范围内的 SSR 进行研究发现,3 个染色体区段存在明显的 Selection Sweep 现象, 其中对两个区段的序列分析表明, 出现这种现象的原因是对该区段附近一个生态适应性的有益突变的选择引起的 Vigouroux 等 (2002) 在利用 EST-SSR 44

54 第三章阿勃和郑引 4 号衍生后代的染色体保守遗传区段浅析 对玉米及其祖先大刍草的 501 个基因进行扫描时发现在 15 个存在选择信号的 SSR 中, 有 7 个已初步确定在其附近区域存在与玉米驯化或改良有关的 QTLs, 后来证实它们是与穗型 粒重相关的主效 QTLs 小麦已有关键基因和主效 QTLs 也证实了多数 V 字形选择谷的确与重要性状相关 已有的关键基因, 多数在选择谷附近, 如位于 2BS 的 Ppd-B1, 定位在 Xbarc349-Xgwm429-Xgwm148 附近 ; 位于 2DS 的 Ppd-D1, 定位在 Xgwm261-Xcfd53-Xwmc503 附近 (Turner et al.,2005) 位于 5AL 的 Vrn-A1, 定位在 Xwmc327-Xbarc230 附近 ; 位于 5BL 的 Vrn-B1, 定位在 Xgwm271-Xgwm408 附近 ; 位于 5DL 的 Vrn-D1, 定位在 Xcfd3-Xbarc230 附近 (Yan et al.,2004; Dubcovsky & Dvorak,2007) 位于 5DL 的 Q, 定位在 Xwmc216-Xcfd39-Xwmc110 附近 (Simons et al.,2006) 位于 6BS NAC 基因, 定位在 Xpsp3009-Xbarc198-Xgwm361 附近 ((Uauy et al., 2007;Dubcovsky 和 Dvorak,2007) 位于 4BS 的 Rht-B1 定位在 Xbarc292-Xcfa2091 附近 (Peng et al.,1999); 位于 2DS Rht8 定位在 Xgwm261-Xcfd53 附近 (Habash & Bernard,2007) Peng 等 (2003) 利用硬粒小麦和野生二粒小麦组建的群体进行驯化 QTLs 定位, 发现了 7 个驯化基因簇, 分别位于 1BL,2AL,3AL,5AL, 主要位于本研究所发现的 V 字形选择谷 Snape 等 (2007) 在 7 个环境中检测影响小区产量的主效 QTL-Xgwm445(2A), 该位点位于一个较大的选择谷 因此, V 字形选择谷之所以经历了选择, 是与其附近存在控制重要性状的基因密切相关的 寻找 V 字形选择信号所需最低标记密度的估计 LD 是进行关联分析的基础和前提, 其决定关联分析的精度和所选用标记的数量 密度及试验方案, 同时, 基因组区段的 LD 大小也反应了其受到选择的程度 不同物种的 LD 衰减距离不同, 同一物种不同群体 同一群体不同座位的 LD 衰减距离也不同 ( 杨小红等,2007) 人类 LD 研究相对较多, 一般认为其 LD 衰减距离在 60Kb 到 500Kb 之间 (Taillorr Miller et al., 2000) 植物中玉米的连锁不平衡研究较多, 玉米农家种的 LD 在 1Kb 左右 (Tenaillon et al., 2001), 具有广泛变异的自交系在 1.5Kb 左右 (Remington et al.,2001), 而优良自交系在 100Kb 以上 (Jung 等,2004) 玉米农家种可能存在较高的重组, 因此 LD 衰减距离非常小, 而优良自交系由于存在巨大的选择压而使其 LD 距离大大增加 对于自交物种拟南芥 大豆 大麦 小麦等 LD 的研究相对较少, 拟南芥的 LD 衰减距离在 1cM 或 250Kb 左右 (Nordborg et al.,2002); 大豆的 LD 为 2~25cM(Zhu et al.,2002); Kraakman 等 (2004) 的研究表明, 大麦的 LD 衰减距离小于 10cM; 小麦的 2D 染色体约为 1cM,5A 染色体的着丝粒区域的 LD 约为 5cM (Breseghehello & Sorrells,2006) 本研究通过两种方法来估测小麦的 LD 范围, 以 r 2 为衡量指标时,A B 和 D 基因组的 LD 存在较大差异 :B 基因组最小 5~15cM, 其次是 D 基因组 15~ 25cM,A 基因组最大为 50cM 以上, 这表明 A 基因组受到的选择压力可能更大 而模拟的方法显示, 标记之间的遗传距离大于 5cM 时, 选择谷被落掉的可能性较大 因此, 在进行小麦全基因组关联分析时, 标记间的遗传距离最好控制在 5cM 以内 45

55 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 摘要 : 本章首先对用于关联分析的农艺性状进行了不同年代的演变分析, 在半个多世纪的育种中, 小麦农艺性状发生了较大变化, 株高基本呈降低趋势, 尤以 70 年代降低幅度最大 ; 千粒重呈平稳持续上升趋势, 粒宽与千粒重的变化趋势相似 ; 有效分蘖呈减少趋势, 但变幅不太大 综合多个性状的表现,2000 年以后的小麦品种在多个性状上达到比较协调的水平 对这些表型数据进行相关性分析发现, 千粒重与粒宽 粒厚和粒长存在较高的相关性, 且达到非常高的显著性水平 ; 穗长和穗粒数达到较高程度的正相关 ; 籽粒蛋白质含量和淀粉含量 千粒重和容重达到较高程度的负相关 全基因组关联分析发现, 许多 V 字形选择谷是重要性状基因的集聚区 其中, 第二 五 六部分同源群上关联的性状比较多 第二部分同源群主要受 Ppd 基因及 Rht8 基因的影响, 关联上的性状主要为穗粒数 穗长 穗密度 株高等 ; 第五部分同源群影响的性状较多, 包括千粒重 粒形 株高 穗长及籽粒蛋白质含量和淀粉含量等 ; 第六部分同源群主要影响千粒重 粒形 成熟期 有效分蘖 穗长等性状 许多关联上的性状与已有基因和主效 QTLs 的结果基本一致, 关联分析与 QTL 作图互相补充 相互验证, 是进行农作物数量性状作图的有效途径 对部分关联位点等位变异的表型差异进行了分析, 结果表明, 多数优势等位变异为优异等位变异, 同时, 本研究还在遗传多样性较高的位点上明确了一些新的优异等位变异, 对小麦分子标记辅助育种奠定了选择基础 位于 2A 连锁群的 Xgwm445 位点的 186bp 在群体中的比例接近 20%, 是最近才受到较强选择的等位变异, 在现代育种中刚开始发挥作用, 在未来一段时间这一等位变异可能上升为优势等位变异 因此, 小麦地方品种 人工合成种或其野生近缘植物中可能蕴涵着更为优异的等位基因, 通过杂交 回交转移其优异基因可能是未来小麦育种取得突破的关键 前言 关联分析, 又称连锁不平衡作图, 是一种以连锁不平衡为基础, 鉴定某一群体内目标性状与遗传标记或候选基因关系的分析方法 近年来, 随着基因组学和分子生物学的迅猛发展, 植物基因组学研究已经呈现出由简单质量性状向复杂数量性状转移的趋势 关联分析最早由 Devlin 和 Risch(1995) 提出, 并在人类致病复杂性状研究中取得了巨大成就 (Sladek et al.,2007; Christopher et al.,2007) 因此, 应用关联分析方法发掘植物数量性状基因已成为目前国际植物基因组学研究的热点之一 随着分子生物学的快速发展, 高通量基因型的测定已经不再成为很大的困难, 标记 / 性状关联分析, 在很大程度上还依赖于更多表型性状的精准鉴定 本研究对多个田间农艺性状的测定, 探讨了不同性状间的相关关系, 并对不同年代间的性状演变进行了研究 同时通过 481 对 SSR 引物对 329 份小麦材料进行了基因型测定, 在此基础上进行了全基因组关联分析, 进一步探讨 V 字形选择谷附近的重要农艺性状, 为未来分子设计育种及分子标记辅助选择奠定基础 46

56 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 4.1 材料与方法 实验材料 为了减小家系对群体结构的影响, 本研究将第三章描述的 329 份实验材料全部纳入全基因 组关联分析 ( 详见第三章 材料与方法 ; 附表 2; 游光霞,2006) 研究方法 SSR 数据获取研究方法同第二章 本试验所有供试材料均于 2006~2007 年间播种于河南省洛阳农科院旱地 每个小麦材料播种 2 行, 每行播种 40 粒小麦种子, 行长 2m, 行距 35cm 小麦农艺性状主要在 2 行内随机选取 5 株进行田间数据的调查及测度 另外, 本研究中 196 份材料于 2001~2002 播种于河南省洛阳农科院旱地, 播种情况同 2006~2007 年 本试验主要选取了 18 个量度性状, 包括有效分蘖 (Fertile Tiller) 穗长(Spike Length) 穗粒数 (Grain No.) 株高(Plant Height) 穗下节间长(the 1 st Internode Length) 抽穗期(Heading Period) 成熟期(Maturity Period) 千粒重(1000 Grain Weight) 叶绿素含量(Chlorophyll Content) 基部第二节壁厚(Thickness of the 2 nd Elongation) 小穗数(SpikeNo.) 穗密度(Spike Density) 容重(Volumetric Weight) 粒长(Seed Length.) 粒宽(Seed Width) 粒厚(Seed Thickness) 蛋白质含量(Protein content) 及淀粉含量 (Starch content) 其中, 灌浆中期的叶绿素含量采用 SPAD-502 叶绿素仪进行测定 ; 基部第二节壁厚采用游标卡尺测其内外直径获得 ; 粒长 粒宽分别摆 30 粒取其平均值 ; 粒厚采用游标卡尺 ( 最小单位为 0.02mm) 测得 ; 容重采用固定体积的容器 (130mL) 进行测定 ; 蛋白质含量和淀粉含量采用 DA7200 谷物近红外分析仪进行测定 数据统计分析 农艺性状的基本分析采用 SPSS12.0 软件进行农艺性状间的相关性分析, 选择 Pearson 相关系数 群体结构检测为了降低关联分析中的伪关联, 需要对所采用的群体进行群体结构检测 (Ewens & Spielman,1995) 采用 Pritchard 等 (2000) 的 Sturcture2.1 软件进行分析, 采用 Bayesian 聚类方法 将 K 赋值 1 到 10,Iteration 赋值 10, 因此, 共运行 100 次, 每个 K 值重复运行 10 次 根据每次运行的 Ln(p) 值, 估算 k(evanno 等,2005), 以此来判断群体是否存在群体结构 47

57 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 关联分析全基因组关联分析采用 Tassel2.0 软件 ( 的逻辑回归程序 Logistic 进行运算, 并考虑群体结构 将得到的关联位点, 运用 SPSS12.0 软件估算不同等位变异的效应 4.2 结果与分析 不同年代小麦主要农艺性状演变 在能查询到育成年代的 232 份材料中, 对不同年代 (50 年代前 及 2000 年以后 ) 小麦品种的 18 个农艺性状进行了方差分析, 结果表明, 株高是小麦育种中改良最大的性状, 其次是穗下节间 千粒重 有效分蘖 粒宽 成熟期及蛋白质含量等性状 ( 表 4.1) 对这几个性状在不同年代间的分布情况进行了统计 ( 图 4.1), 株高呈降低趋势, 由 50 年代以前的 130~140cm 降到现在的 70~80cm, 株高的降低主要在 70 年代,80 年代和 90 年代降低比较缓慢,2000 年以后小麦品种的株高保持在一个比较合适的范围内 (75~90cm) 穗下节间的变化与株高的变化趋势基本一致, 总体由 40~50cm 降到 20cm 左右 千粒重存在持续上升的趋势, 由 25g 左右上升到 40~50g, 且似乎每个阶段 ( 除 2000 年以后的品种 ) 都存在一个比较明显的增长趋势 有效分蘖变幅不是太大, 各个年代多数品种集中在 8~13 之间 籽粒宽度呈增长趋势, 与千粒重变化趋势基本一致 蛋白质含量先由高到低变化 (50~70 年代 ), 又由低到高变化 (70~90 年代 ), 这与不同时期小麦的育种目标密不可分, 早期小麦育种的主要目标是提高产量, 在追求大穗大粒的同时, 籽粒蛋白质含量表现为降低 ; 而最近的小麦育种把品质改良提到了重要的位置, 因此出现籽粒蛋白质含量提高的现象 综合多个性状的表现,2000 年以后的小麦品种在多个性状上达到了一个比较协调的水平 小麦不同农艺性状间的相关关系 农艺性状相关性分析表明, 小麦多个农艺性状间存在极显著的相关关系 ( 表 4.2) 所有检测性状中, 千粒重与与粒长 粒宽和粒厚均达到极显著中度正相关, 且相关系数较高, 表明小麦籽粒大小能反应千粒重的情况 ; 同时, 千粒重与容重和淀粉含量都达到极显著低度正相关关系, 与蛋白质含量达显著中度负相关关系, 表明小麦胚乳淀粉 蛋白质等不同成分的含量在一定程度上也影响着千粒重 ; 千粒重还与小麦植株基部第二节的茎秆壁厚达极显著低度正相关, 可能茎秆壁厚, 增加了植株抗倒伏能力, 从而反应到千粒重的提高上 ; 另外, 千粒重与穗密度也存在一定的相关关系 有效分蘖与株高 穗密度 蛋白质含量呈极显著低度正相关, 与穗长 穗粒数 千粒重呈低度负相关 它们之间可能不为相互影响的关系, 而是与历史上小麦的育种水平有关, 比如年代早一些的小麦品种往往表现出分蘖非常多, 株高高, 穗长很短, 穗密度比较高, 且原有的小麦品种由于籽粒比较小, 蛋白质含量相对含量可能比较高 48

58 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 穗粒数与基部第二茎节的臂厚呈极显著中度正相关, 与小穗数 叶绿素含量及成熟期呈极显著低度正相关, 穗粒数随着成熟期的延长而增高, 可能是通过减少小麦不孕小穗数来实现穗粒数的增高 另外其与穗密度呈极显著低度负相关 株高与穗下第一节间长呈极显著高度正相关, 与抽穗期 有效分蘖等达到极显著低度正相关 穗长与穗粒数有较高的极显著中度正相关关系, 表明在影响穗粒数的众多因素中, 穗长是一个比较重要的因素 另外, 它还与穗下节间长 基部第二节臂厚及粒长达到极显著低度正相关关系, 同时它与穗密度呈极显著高度负相关关系, 与有效分蘖呈极显著低度负相关 容重与淀粉含量达到极显著中度正相关, 与蛋白质含量达到极显著中度负相关 容重与粒宽 粒厚达极显著低度正相关, 而与粒长无相关关系 ; 容重与千粒重呈极显著低度正相关, 与穗长和小穗数呈极显著低度负相关 淀粉含量与蛋白质含量呈极显著高度负相关, 与抽穗期和成熟期呈极显著低度负相关 总之, 小麦的多个性状互相联系 ; 对这些性状进行测定有助于对小麦材料进行更深层次的评价 49

59 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 表 4.1 不同时期育成品种 18 个农艺性状的方差分析 Table4.1 ANOVA analysis of 18 wheat agronomic traits between different ages 方差来源自由度均方 F 值显著性 Sum of Squares df Mean Square F Sig. 有效分蘖 组间 E-05 Tiller 组内 总 穗长 组间 E-01 SpilkeLen 组内 总 穗粒数 组间 E-01 GrainNo 组内 总 株高 组间 E-23 Height 组内 总 穗下节间 组间 E-18 1 st stem 组内 总 抽穗期 组间 E-01 Heading 组内 总 成熟期 组间 E-04 Mature 组内 总 千粒重 组间 E-09 TGW 组内 总 叶绿素含量 组间 E-01 Chl 组内 总 壁厚 组间 E-03 StemTh 组内 总 小穗数 组间 E-01 SpikeNo 组内 总 穗密度 组间 E-01 Spike-p 组内 总 容重 组间 E-01 Cap Wei 组内 总 粒长 组间 E-02 GrainLen 组内 总 粒宽 组间 E-05 GrainWideth 组内 总 粒厚 组间 E-02 GrainTh 组内 总 蛋白质含量 组间 E-04 Protein Con. 组内 总 淀粉含量 组间 E-03 Starch Con. 组内 总

60 PC07 TGW07 FT07 PH07 FIL07 中国农业科学院博士学位论文 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 Age Age Age Age Age 图 4.1 不同时期育成品种株高 穗下节间长度 千粒重 有效分蘖 粒宽及蛋白质含量等性状的分布 Fig. 4.1 The distribution of PH07, FIL07, TGW07, FT07, SW07 and PC07 of cultivars bred at different periods 51

61 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 表 4.2 小麦 18 个农艺性状间的相关性分析 Table 4.2 The correlation analysis among 18 different agronomic traits in wheat 分蘖 穗长 穗粒数 株高 穗下节间抽穗期 成熟期 千粒重 叶绿素含量壁厚 小穗数 穗密度 容重 粒长 粒宽 粒厚 蛋白含量 FT07 SpL07 GN07 PH07 FIL07 HP07 MP07 TGW07 CC07 TE07 SN07 SD07 VW07 SL07 SW07 ST07 PC07 穗长 SpL07 Correlation Sig. (2-tailed) 5E-12. 穗粒数 GN07 Correlation Sig. (2-tailed) 1E E-22. 株高 PH07 Correlation 低度正相关, low positive correlation Sig. (2-tailed) 2E 中度正相关, middle positive correlation 穗下节间 FIL07 Correlation 高度正相关, high positive correlation Sig. (2-tailed) E E-56. 低度负相关, low negative correlation 抽穗期 HP07 Correlation 中度负相关, middle negative correlation Sig. (2-tailed) 高度负相关, high negative correlation 成熟期 MP07 Correlation Sig. (2-tailed) E E-15. 千粒重 TGW07 Correlation Sig. (2-tailed) 2E E E 叶绿素含量 CC07 Correlation Sig. (2-tailed) E-05 1E 壁厚 TE07 Correlation Sig. (2-tailed) E E-13 4E E E-05. 小穗数 SN07 Correlation Sig. (2-tailed) E 穗密度 SD07 Correlation Sig. (2-tailed) 2E-10 1E E E-14 1E E E-06 1E-06. 容重 VW07 Correlation Sig. (2-tailed) E E E 粒长 SL07 Correlation Sig. (2-tailed) E E E E E 粒宽 SW07 Correlation Sig. (2-tailed) E E E-07. 粒厚 ST07 Correlation Sig. (2-tailed) E E E E-18. 蛋白含量 PC07 Correlation Sig. (2-tailed) 4E E E-07 2E E E E 淀粉含量 SC07 Correlation Sig. (2-tailed) E-07 9E-08 2E E E-09 5E E-60 注 : 为 Pearson 相关系数 Note: correlation coefficient of Pearson 52

62 K 中国农业科学院博士学位论文 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 群体结构检测 在进行关联分析之前, 必须先进行群体结构检测 本试验利用 481 对 SSR 引物对 329 份材料进行了群体结构检测, 结果表明供试材料存在群体结构 在 K=3 时,10 次运行重复间的标准差最小, 重复性最好, k 值最高 ( 图 4.1) 因此, 本研究所有供试材料应分为 3 组 分别为 : 阿勃组, 郑引 4 号组及洛夫林 10 组 ( 图 4.2) 关联分析时, 将 K=3 时的群体结构信息输 K-value 入 Tassel 2.0 软件进行运算 图 4.2 利用 k 参数对群体结构的检测分析 Fig.4.3 The analysis of population structure based on k parameter Abbondanza- like Lovrin10- like St like 图 4.3 利用 Structure 软件对供试材料的分组信息 Fig. 4.3 The information of membership based on Structure software 全基因组关联分析 采用 481 对 SSR 引物对供试 329 份材料的 18 个数量性状进行了全基因组关联分析, 其中 8 个基本农艺性状数据分别于 2002 年和 2007 年在洛阳农科院采集, 另外 10 个性状于 2007 年在洛阳农科院采集 ( 表 4.3) 结果显示,18 个农艺性状在染色体上成簇分布, 每条染色体以控制几个农艺性状为主, 相同选择谷有相近的性状分布, 与同一位点关联的性状往往具有一定的 53

63 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 相关性 ( 图 4.4) 21 条染色体中,2A 2B 2D 4D 5A 5B 5D 6A 6D 和 7D 上分布的性状较多, 存在多个性状分布簇 Group 1:1A 主要分布有穗长 穗粒数 穗密度和株高等性状,1B 主要影响品质相关性状, 如蛋白质含量 淀粉含量及容重等 1D 染色体能够关联上位点比较少, 主要影响千粒重和株高等性状 Group 2:2A 主要有 4 个分布簇, 影响的性状依次为穗粒数 小穗数 ; 蛋白质含量 淀粉含量 千粒重及穗长 ; 株高 穗下节间 ; 株高 穗长及生育期等 2B 染色体多个分布簇影响千粒重, 该染色体以千粒重 穗粒数及粒长 粒厚等粒形相关性状为主 2D 染色体以穗粒数为主, 多个关联位点影响穗粒数性状, 尤其是 Ppd-D1 附近的位点, 由于 Ppd-D1 与 Rht8 紧密连锁, 因此这两个基因附近的位点影响着株高 穗长 穗粒数和穗密度 ; 但是 Ppd-D1 基因附近仅检测到一个与抽穗期关联的位点 2D 短臂上的另一个性状分布簇影响基部第二节间的壁厚, 与茎秆质量有关 Group 3:3A 染色体影响容重 有效分蘖和蛋白质含量等性状 3BL 近端粒处多个位点影响穗下节间长, 可能与抗旱性有关, 同时该性状簇还影响着基部第二节间的壁厚 ;3B 染色体的其他关联位点影响穗粒数 千粒重和粒形等 3D 染色体主要影响抽穗期 成熟期等性状 ; 另外还影响叶绿素含量和粒厚等性状 Group 4:4AL 近端粒处主要影响千粒重和粒宽等性状, 其他关联位点主要影响株高 成熟期等 4B 染色体多个位点影响千粒重, 同时也影响粒形相关性状 ; 另外, 多个位点影响抽穗期和成熟期等 4D 染色体主要影响粒厚等粒形相关性状, 另外还影响株高 穗下节间长 小穗数和有效分蘖等, 可能受 4D 短臂的矮秆基因 Rht10 的影响 Group 5:5A 既影响着产量性状又影响着品质性状, 同时还影响着适应性相关性状 该染色体多个位点影响穗粒数和千粒重, 在 5AL 近端粒处存在影响抽穗期和成熟期性状的基因簇, 主要在 Q 基因和 Rht12 基因之间, 同时存在多个位点影响蛋白 淀粉含量及容重 ; 另外, 在 Vrn-A1 与 Q 基因之间存在影响千粒重和粒形等性状的位点 5B 短臂影响性状较多, 主要有株高 穗长 穗密度 基部第二节间的壁厚及容重 ; 长臂近着丝粒处主要影响穗长 小穗数及穗密度 ; 长臂近端粒处主要影响蛋白质含量及容重 ; 另外, 在 Vrn-A1 基因附近存在影响株高的位点 Xgwm408 5D 主要有 5 个性状分布簇, 位于短臂的性状簇主要为粒形 千粒重和容重 ; 长臂 Vrn-D1 附近的两个性状簇主要为穗长 穗粒数 穗密度及穗下节间长等性状 ; 接下来的性状簇主要影响株高 穗下节间长 穗密度 穗粒数及蛋白质含量等 ;5DL 近端粒处的两个位点影响成熟期和粒形 Group 6:6A 着丝粒附近有两个性状分布簇, 主要影响千粒重 粒形 成熟期 有效分蘖 穗密度及穗长 穗下节间长等性状, 与 Snape(2007) 发现的小区产量的主效 QTLs 区域一致 ; 其短臂上存在影响穗粒数的位点 6B 染色体 NAC 基因附近位点影响千粒重和穗长等性状,6BL 的多个位点影响株高和成熟期等性状, 其中 Xgwm626 位点影响株高 穗长 穗粒数 穗密度 千粒重及粒长等性状 6D 染色体多个位点影响千粒重, 主要在着丝粒两侧区域与 Snape(2007) 的结果一致, 此外, 该染色体还影响着抽穗期 成熟期 株高 穗长及有效分蘖等性状 Group 7:7A 染色体性状主要集中在长臂末端, 主要影响穗粒数 粒形 千粒重及穗长等 54

64 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 性状 7B 染色体 Rht9 基因附近未检测到株高性状, 其影响的性状主要为穗长 7D 染色体多个 位点影响小穗数, 存在 5 个主要的性状簇, 都有小穗数的关联位点 ; 第二个性状簇以粒形为主, 第三个性状簇以千粒重和穗密度为主 ; 第四个性状簇以穗长和株高为主 ; 第五个性状簇以容重 为主 表 4.3 本研究考察的农艺性状及所用代表符号 Table 4.3 Wheat agronomical characteristics investigated in this study and the symbols 简写 性状名称 性状英文翻译 测定年份 代表符号 FT07 有效分蘖 Fertile Tiller/ FT02 有效分蘖 Fertile Tiller/ GN07 穗粒数 Grain No/ GN02 穗粒数 Grain No / TGW07 千粒重 Thousand Grain Weight / TGW02 千粒重 Thousand Grain Weight / PH07 株高 Plant Height/ PH02 株高 Plant Height/ SpL07 穗长 Spike Length/ SpL02 穗长 Spike Length/ FIL07 穗下节间长 the first internode length/ HP07 抽穗期 Heading Period/ HP02 抽穗期 Heading Period/ MP07 成熟期 Maturity Period/ MP02 成熟期 Maturity Period/ SN07 小穗数 Spike No./ SN02 小穗数 Spike No./ SD07 穗密度 Spike Density/ CC07 叶绿素含量 Chlorophyll content/ SL07 粒长 Seed Length/ SW07 粒宽 Seed Width/ ST07 粒厚 Seed Thickness/ TE07 基部第二节壁厚 Thickness of 2nd Elongation/ PC07 蛋白质含量 Protein content/ < SC07 淀粉含量 Starch content/ > VW07 容重 volumetric weight/ 不同性状分布的染色体不同, 千粒重主要分布在 2B 4A 4B 5A 5D 6A 6B 6D 7A 7D 等染色体上, 粒形主要分布在 2A 2B 3B 4A 4D 5D 6A 6D 7A 7D; 穗粒数主要分布在 1A 2A 2B 2D 3B 5A 5D 6A 7D 染色体, 小穗数主要分布在 7D 染色体 ; 株高主要分布在 1A 2A 2D 4A 4D 5B 5D 6B 和 6D 染色体 ; 有效分蘖主要分布在 2A 2D 3A 4D 5A 和 5D 染色体 ; 株高主要分布在 1A 2A 2D 4A 4D 5B 5D 6B 和 6D 染色体, 穗长主要分布在 1A 2A 2D 5B 5D 6B 6D 7A 和 7B 染色体 ; 生育 55

65 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 < <> < <> < > > > <> 1A 1B <> 图 个农艺性状在全基因组的关联分析 Fig. 4.4 Whole genome association analysis of 18 agronomic characteristics 56

66 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 图 4.4( 续 ) < <> <> > <> > < < 1D 57 2A <>

67 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 Rht8 Ppd- D1 <> < <> Ppd- B1 < < > < 图 4.4( 续 ) 2B 58 2D <>

68 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 图 4.4( 续 ) < < 3A 59 3B

69 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 > <> <> 图 4.4( 续 ) 3D 60 4A

70 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 图 4.4( 续 ) Rht-B1 < <> 4B 61 4D <>

71 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 图 4.4( 续 ) <> < < Vrn-A1 Q Vrn- B1 <> Rht-12 5A 62 5B < <

72 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 图 4.4( 续 ) Vrn- D1 <> < < < <> 5D 63 6A

73 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 图 4.4( 续 ) NAC < 6B 64 6D

74 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 图 4.4( 续 ) Rht9 < < 7A < 65 7B <

75 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 图 4.4( 续 ) < < < > 7D 66

76 -Lg(p) 中国农业科学院博士学位论文 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 期主要分布在 2A 2D 3D 4A 4B 5A 6A 6B 和 6D 染色体 ; 品质相关性状主要分布在 1B 2A 2D 3A 5A 5B 和 7D 染色体 在所有农艺性状中, 育种家最关心的是产量三要素, 我们把有效分蘖 (FT) 穗粒数(GN) 和千粒重 (TGW) 在 2002 和 2007 两年中均检测到的关联位点进行了研究 ( 图 4.5) 由该图可看出, 在两年中均检测到的影响有效分蘖的位点比较少, 分布在第 2 和第 5 部分同源群, 可能受 Ppd,Vrn 等基因的影响 两年中均检测到影响穗粒数的位点多分布在第 2 和第 5 部分同源群, 另外, 部分同源群各有一个位点检测到与穗粒数的关联 千粒重在第 2,4,6 部分同源群均检测到两个位点 ; 另外,1D 5D 和 7A 连锁群各检测到一个千粒重关联位点 3.5 FT2007 FT2002 GN2007 GN2002 TGW2007 TGW A 1B 1D 2A 2B 2D 3A 3B 3D 4A 4B 4D 5A 5B 5D 6A 6B 6D 7A 7B 7D 图 和 2007 年效分蘖 穗粒数和千粒重的全基因组关联分析 Fig.4.5 Markers associated with fertile tillers (FT), grain number per spike (GN) and thousand grain weight (TGW) in two years field data 关联位点不同等位变异的性状比较 为了评价关联位点不同等位变异在育种中的价值, 本研究采用 SPSS 软件比较了第二同源群的选择谷不同等位变异间的表型性状差异 ( 图 4.6, 图 4.7, 图 4.8) 图 4.6, 图 4.7 分别由每个位点等位变异分布频率折线图和不同等位变异的表型性状柱状图组成, 由于在柱状图中展示多个性状且性状的单位不一致, 因此未在柱状图上标识单位 各性状的单位如下 :FT( 个 ) GN( 个 ) TGW(g) PH(cm) SpL(cm) FIL(cm) HP( 从播种到抽穗期的天数 ) MP ( 从播种到成熟期的天数 ) SN( 个 ) SD( 个 /cm) SL(mm/30 个 ) SW(mm/30 个 ) ST (mm) TE(mm) PC(%) SC(%) VW(g/130mL) 首先, 对 2A 的两个选择谷进行了详细分析 Snape 等 (2007) 的研究发现,Xgwm445 位点在 7 个环境中均检测到小区产量主效 QTLs, 本研究也关联到千粒重性状 由于其所处的选择谷与两侧标记相隔较远, 因此, 对该选择谷进行了单位点分析 ( 图 4.6) Xgwm445 的优势等位变异是 184bp, 该等位变异可能在驯化或育种中受到了较强的选择, 应与优异性状关联 但其与占群体约 20% 的 186bp 相比, 携带 186bp 的材料株高矮 千粒重高 成熟期早, 表现更为优异的性状, 这是否相互矛盾呢? 进一步对携带 186bp 的材料进行了分析, 结果发现, 在能找 67

77 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 到年代的材料中,70 年代的材料 3 份 ( 5%),80 年代 18 份 ( 22.8%),90 年代以后 16 份 ( 34%), 这表明,186bp 是最近才受到较强选择的等位变异, 在现代育种中刚开始发挥作用 对其地域来源分析发现, 这些材料主要来自河南省, 包括豫麦 18 豫麦 21 温麦 4 号 温麦 6 号 偃展 1 号 郑麦 9405 周麦 18 等 图 4.6 Xgwm445 位点不同等位变异的性状比较 Fig.4.6 Comparasion of agronomic characters with different alleles of Xgwm445 注 : 柱状图中数字为显著性水平 Note: the number on different bar indicate the significance of between the trait and the marker 另外, 对 2A 连锁群上的 Xbarc309 所在的选择谷进行了不同等位变异的性状比较 结果表 明, 位于选择谷谷底的 Xbarc309 位点的优势等位变异为 165bp, 其在群体中已接近固定, 携带 该等位变异的材料与其他类型相比较, 在两年点的试验中均检测到较多的有效分蘖, 而 2007 年的穗粒数少于其他类型, 穗长短, 穗密度高 ( 图 4.7B) 位于选择谷附近的位点 Xwmc296, 优势等位变异不突出, 在群体中不到 35%, 而且存在多个接近或超过 10% 的等位变异 综合多 个性状的信息, 认为株高较矮, 千粒重较高, 容重高 有效分蘖较多, 穗粒数多, 穗较长且穗 密度较高的 172bp 为比较优异的等位变异, 可能是正在经历选择的等位变异 ( 图 4.7A) 携带 该等位变异的材料也多是现代品种, 且有多份材料为优质麦 代表性的品种有 : 扬麦 158 小 偃 5 号 陕 213 小偃 168 山农 PH85-4 皖麦 6 号 陕优 225 豫麦 21 温麦 4 号 周麦 18 等 Xpsp3088 位点虽然在遗传图上在 2A 的长臂, 由于其关联的性状与 Xbarc309 较为相近, 故 在此一并做详细分析 ( 图 4.7C) 与该位点关联的性状主要为有效分蘖 穗长 穗粒数 株高 小穗数等性状, 其中携带 189bp 的材料虽然还不是优势等位变异, 但表现矮秆 穗大且多花多 实 有效分蘖较少 早熟等性状, 是一个优异等位变异, 其主要代表性品种为 : 繁 6 川麦 22 博爱 7023 绵阳 26 攀 小偃 5 号 小偃 6 号 优 陕 213 高优 503 山农 PH85-4 皖麦 6 号 陕优 225 小偃 22 豫麦 57 等, 也多为比较新的品种, 因此, 推测该等 位变异可能正在育种中经历选择 用 Xbarc309 两侧位点 Xwmc296 和 Xpsp3088 的优异等位变异 172bp-189bp 单倍型进行关联 分析, 结果如图 4.8 所示 携带 172bp 和 189bp 的材料, 与其他类型相比, 株高大大降低 有 68

78 Frequency 中国农业科学院博士学位论文 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 效分蘖也有所降低而小穗数增加 ; 与两个位点的优势等位变异单倍型相比, 株高降低 成熟期提前 穗长变短 蛋白质含量降低而淀粉含量和容重增高 综合以上分析, 可得出 Xbarc309 所在的选择谷主要控制着有效分蘖 穗长 穗粒数抽穗期等与适应性相关的性状, 推测 Ppd-A1 基因可能在附近或选择谷之内 Xwmc296 2E E E-15 1E SC07 VW07 GN07 GN02 PH07 PH02 MP SD07 A others 6E Xbarc E FT07 FT02 GN07 SpL07 SD TE07 B 69

79 Frequency 中国农业科学院博士学位论文 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 E-04 1E Xpsp FT07 FT02 SpL07 SpL02 SN07 SN02 0 GN07 GN02 PH07 PH02 HP02 C 图 4.7 V 字形选择谷不同等位变异的表型性状差异 A 为 Xwmc296,B 为 Xbarc309,C 为 Xpsp3088 Fig.4.7 The phenotype differences between different alleles of selective sweep of Xwmc296,Xbarc309 and Xpsp others B C E FT02 PH07 PH02 SN07 0 PH07 PH02 SC07 VW07 MP07 0 SpL02 FIL SN07 SN02 PC07 图 4.8 Xwmc296 与 Xpsp3088 优异等位变异单倍型的关联分析 Fig.4.8 Haplotype association analysis of Xwmc bp and Xpsp bp 4.3 讨论 小麦农艺性状向协调方向发展 农作物的驯化和选择过程中, 其农艺性状随着人类的需求及育种目标发生了很大的变化 20 世纪五 六十年代, 随着矮秆基因资源的发现和利用, 主要农作物 ( 小麦和水稻 ) 的产量曾大大提高, 即闻名遐尔的第一次绿色革命 (Conway,1999) 小麦中携带矮秆基因 Rht1 和 Rht2 基因的农林 10 号及携带半矮秆基因 Rht8 和 Rht9 的赤小麦的广泛利用大大促进了小麦矮化育种 (Worland,1998), 使得小麦株高变化非常大, 由 50 年代以前的 130~140cm 降到 70~80cm ( 表 4.1; 图 4.1) 千粒重总体呈持续上升趋势, 由 25g 左右上升到 40~50g, 当然不乏同一年 70

80 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 代的个别品种千粒重也有高有低 ; 对千粒重影响较大的粒宽变化趋势与千粒重的变化趋势基本相似 籽粒淀粉含量基本呈上升趋势而蛋白质含量呈 高 - 低 - 高 的变化趋势 从本研究所涉及的农艺性状情况看 2000 年以后的品种, 株高多数在 70~90cm, 穗下节间在 22~28cm, 千粒重在 43~48g, 有效分蘖在 5~10 个, 这一年代的品种在多个性状上达到了一个比较协调的水平 如何在性状的协调中取得产量和品质性状的突破是农作物育种要解决的重要问题 关联分析是进行数量性状定位的有效方法 关联分析是以连锁不平衡为基础鉴定某一群体内目标性状与遗传标记或候选基因关系的分析方法 (Flint-Garcia et al.,2003) 在人类复杂致病性状的研究中取得了较大成就, 通过 SNPs 全基因组关联分析将 I 型糖尿病定位在 IL2RA 区域 (Christophr et al.,2007), 并找到了一个新的 II 型糖尿病致病位点 (Robert et al.,2007) 随着模式植物全基因组测序的完成, 植物基因组学研究已经呈现出由简单质量性状向复杂数量性状转移的趋势, 应用关联分析方法挖掘植物数量性状基因已成为目前国际植物基因组学的研究热点之一 Thornsberry 等 (2001) 以候选基因策略研究了玉米花期和 dwarf8 基因间的关联, 这个预测的转录因子在小麦品种的 绿色革命 中扮演重要的角色 ( 小麦中的直向同源基因 ), 其拟南芥的直向同源基因在花期控制中起作用 Hansen 等 (2001) 最早进行全基因组关联分析, 应用 440 个 AFLP 标记, 在 sea beet 中关联到 2 个与春化基因 (B) 紧密连锁的标记 Kraakman 等 (2004) 用 236 个 AFLP 标记对春大麦品种进行了关联分析, 发现了 8 个与大麦产量关联 5 个与产量稳定性关联的 AFLP 标记 Breseghello 等 (2006), 通过 2D 和 5A 染色体的 18 个 SSR 标记对小麦籽粒性状进行了关联分析, 发现多个与籽粒宽度显著关联的位点 Zheng 等 (2008) 克隆了玉米高含油量基因 qho6, 而此前 Belo 等 (2008) 在用 8590 个标记对 553 个玉米自交系进行全基因组关联分析时在该基因附近发现了一个与玉米籽粒含油量强关联的位点 可见, 关联分析在植物数量性状作图中也逐步发挥重要作用 本文用 481 个 SSR 位点对 329 份小麦材料的 18 个性状进行了关联分析, 找到了影响这些性状的 V 字形选择谷 ( 图 4.4) 关联分析发现, 同一选择谷关联到的性状间多存在相关关系, 而且同一选择谷或相近选择谷的不同位点关联到的性状基本一致 如 1BL 相邻 2 个选择谷的多个 SSR 位点关联到蛋白质含量 淀粉含量及容重等品质相关性状 ;5AL 上一个选择谷的 4 个位点关联到抽穗期 成熟期等相关性状 ;5BS 末端两个选择谷的多个位点关联到株高 穗长 穗密度等性状 另外, 第 2 部分同源群上的光周期基因 Ppd-A1 Ppd-B1 和 Ppd-D1 基因对性状的影响比较明显, 这些基因附近的位点多影响穗粒数 株高 穗长等性状, 位于 2DS 紧密连锁的 Rht8 基因和 Ppd-D1 基因附近的选择谷对这些性状的影响更为突出 在千粒重的关联位点中,2A 上的 Xgwm445 及 6A 6B 6D 着丝粒两侧的位点与 Snape 等 (2007) 在多个环境中检测到的结果一致 因此, 基于 SSR 标记的全基因组关联分析与传统 QTL 互相补充, 相互验证, 是进行农作物数量性状定位的有效途径 71

81 第四章 V 字形选择谷 : 重要性状基因的集聚区 优势等位变异与优异等位变异 优势等位变异是指在群体中频率最高的等位变异, 是通过位点内不同等位变异频率的比较发现的, 是群体经受历史选择的结果 优异等位变异是指群体中携带这些等位变异的材料具有优异的表型性状, 优异等位变异与研究的群体 群体的年代及相应的育种目标密切相关 虽然优势等位变异对某个性状来说并不都是优异等位变异 ( 游光霞,2006), 但这些等位变异在物种适应性 驯化及选择过程的某个阶段被较多的保留下来, 应该有一定的生物学意义或对人类是有益的 (Wright & Gaut,2004;Doebley et al.,2006; 张学勇等,2006) 总结位于同一选择谷的不同位点的优势等位变异和优异等位变异发现, 在 V 字形选择谷底的位点, 其选择方向基本固定, 优势等位变异往往为优异等位变异, 而在 V 字形两侧的位点, 多数正在经受选择 2A 连锁群的 Xbarc309 位于选择谷的谷底, 其 PIC=0.1890, 优势等位变异 165bp 是优异等位变异, 在群体中接近固定 ; 而位于选择谷两侧的 Xwmc296 位点 (PIC=0.8017) 和 Xpsp3088 位点 (PIC=0.6907) 的优势等位变异并非其优异等位变异, 通过不同等位变异的性状比较, 发现 Xwmc bp 及 Xpsp bp 为相对优异的等位变异, 并对携带这些等位变异的材料进行了分析, 结果发现, 携带优异等位变异的材料多为近几年的材料 ( 图 4.7), 表明这些等位变异可能正在经受育种家或自然因素的选择 2B 连锁群 Ppd-B1 附近的选择谷 Xbarc349(PIC= ) 和 Xgwm429(PIC=0.7619) 已有比较明确的选择方向, 其优势等位变异就是优异等位变异 ( 附图 1, 附表 1) 2D 连锁群 Xwmc503(PIC=0.5752) Xcfd53(PIC=0.7538) 和 Xbarc297 (PIC=0.4900) 选择方向也非常明确, 而 Xgwm261(PIC=0.9053) 为不断经历选择的位点 ( 附图 2); 5D 连锁群的 Xgwm292(PIC=0.5971) Xgwm212(PIC=0.3401) 位点选择方向非常明确,Xgwm212 位点已趋于固定, 而 Xcfd29(PIC=0.8150) 正经历选择 ( 附图 3, 附表 1) 因此, 多数位点的优势等位变异为优异等位变异, 但多样性非常高的位点往往没有形成明确的选择方向 而 2A 连锁群的 Xgwm445(PIC=0.4032), 其优势等位变异 184bp 在群体中的比例达到了 70% 以上, 但该优势等位变异却不是最优异的等位变异, 在群体中接近 20% 的等位变异 186bp 表现比较优异的性状 对携带 186bp 的材料进行了分析发现,70 年代的材料 3 份 (5%),80 年代 18 份 (22.8%), 90 年代以后 16 份 (34%), 这表明,186bp 是最近才受到较强正向选择的等位变异, 在现代育种中刚开始发挥作用 对其地域来源分析发现, 这些材料主要来自河南省, 豫麦 18 豫麦 21 温麦 4 号 温麦 6 号 偃展 1 号 郑麦 9405 周麦 18 等都是其携带者 推测 186bp 在不久将成为群体内的优势等位变异, 这可能是更为优异等位变异的出现或重新发现的过程 因此, 优势等位变异和优异等位变异是相辅相成的, 多数优势等位变异为优异等位变异, 更为优异的等位变异的出现促使其在群体中上升为优势等位变异 这也暗示了从小麦地方品种 人工合成种或其野生近缘植物中重新发现更为优异的等位变异具有较高的可行性和必要性 (Tanksley & McCouch,1997;Fulliet et al.,2007; Zamir,2008) 72

82 第五章小麦分子设计育种初探 - 亲本选配 第五章小麦分子设计育种初探 - 亲本选配 摘要 : 根据选择牵连作用原理, 将 PIC<=0.4 作为筛选关键位点的标准, 通过一份材料与超千万亩材料中的优势等位变异的比较, 评价其在育种中的价值 ; 并通过材料间的互补情况进行亲本选配和后代组合预测 实验结果显示 : 阿勃 五一麦和矮孟牛 小偃 6 号这两个组合比较理想, 在以往育种实践中有很成功的例子, 前者选育出了甘麦 8 号 甘麦 23 等西北春麦区重要推广品种, 后者选育出 90 年代关中地区产量潜力第一的小偃 22 另外, 攀 / 矮孟牛 攀 / 矮丰 3 号也是互补性非常好的两个组合, 从本课题组从 F 2 群体中筛选到矮秆 大穗 多粒 饱满 早熟的单株, 同时, 根据这两组材料的特点及未能互补的位点, 建议将小偃 6 号 小偃 22 和郑麦 9023 纳入攀 / 矮孟牛, 将周麦 18 纳入攀 / 矮丰 3 号 同时对这一分子设计育种思路的优势 缺陷及未来的发展思路进行了初步探讨 前言 目前多数农作物的育种状态为 : 育种家可供利用的亲本材料有几百甚至上千份, 可供选择的杂交组合上万甚至更多 由于试验规模的限制, 一个育种项目所能配置的组合一般只有数百或上千, 育种家每年花费大量的时间去选择究竟选用哪些亲本材料进行杂交 ; 而对已配置的杂交组合, 早期选择一般建立在目测基础上, 由于环境对性状的影响, 在配制的杂交组合中, 一般只有 1% 左右的组合有希望选出符合生产需求的品种, 育种效率一般不到百万分之一 因此, 育种存在很大的盲目性和不可预测性, 育种工作很大程度上依赖于经验和机遇 ( 万建民,2006) Randy(1998) 在论述西北太平洋地区农业森林发展中提到 设计育种 这一概念,Peleman (2003) 比较系统地提出了分子设计育种 (Breeding by Design) 及具体实施方案, 试图通过渐渗系的建立及分子组装提高育种选择的准确性, 提高育种效率 但 Peleman(2003) 倡导的分子设计育种的实施方案将需要很大的人力和物力的投入, 如何使分子设计育种走近育种家呢? 本研究通过对阿勃 郑引 4 号骨干 ( 重要 ) 育种亲本及其后代材料的扫描, 根据选择牵连效应原理寻找关键的基因组区段, 并通过关联分析评价关键位点的优异等位变异 根据不同材料在这些关键位点的等位变异组成来评估一份材料的育种价值, 通过材料间的互补情况进行亲本选配及后代组合的选择, 从育种亲本选择和组合选配两个层面探析分子设计育种的新思路 5.1 材料与方法 实验材料 同第三章实验材料 ( 附表 2; 游光霞,2006) 73

83 第五章小麦分子设计育种初探 - 亲本选配 研究方法 根据选择牵连作用原理, 将 PIC<=0.4 作为筛选关键位点的标准, 如果与 56 份超千万亩材料在这些位点的优势等位变异相同, 则赋值为绿色, 不同则赋值为黄色, 未得到扩增产物的为白色 将每份材料在关键位点的颜色取值按照一定顺序排列起来, 就可看出一份材料在育种中的利用价值, 从而进行组合选配, 在此, 假定超千万亩材料中的优势等位变异为优异等位变异 5.2 结果与分析 通过比较不同材料在 125 个关键位点的等位变异与超千万亩材料中的优势等位变异的异同, 来评价一份材料在育种中的价值, 并通过不同材料在这些关键位点的互补情况, 进行亲本选配及组合预测 从图 5.1 可看出, 与本地麦 白花麦和中国春三个地方品种相比, 现代育成品种在关键位点拥有较多优异等位变异 五一麦 阿勃 郑引 4 号等骨干 ( 重要 ) 育种亲本在关键位点拥有的优势等位变异相对较多 另外, 有些位点从一而终都是绿色, 表明这些位点已经在群体中固定, 分子育种具体操作时, 可将这些位点去掉 从材料间的互补情况看, 阿勃和五一麦在绝大多数关键位点具有很好的互补性, 推测这两个材料进行组配, 可能比较易于选出理想材料 育种的实际情况是, 阿勃和五一麦单交选育出了 7 个品种, 包括大面积推广利用的甘麦 8 号 甘麦 23 等 ( 金善宝,1983; 庄巧生,2003) 矮孟牛 V 与小偃 6 号互补性也比较好, 仅在 3 个位点存在共同缺陷, 也已有育种实践证明这一组合 矮孟牛 V 的一个系 (775-1) 与小偃 6 号组配, 选育出了 90 年代关中地区产量潜力很高的小偃 22( 周阳,2004)( 图 5.1) 成功的实例说明这条路子可行 能否对现有材料进行组合选配及进一步预测呢? 攀 和矮孟牛 V 攀 和矮丰 3 号在多个关键位点的互补性比较好,2006 年笔者配制了杂交组合,2008 年在 F 2 代中, 由本实验室宿振起博士选出了矮秆 大穗 多粒 饱满 早熟的材料 ( 图 5.2; 图 5.3), 虽未到最终品种的产生, 但也初步证明了这两组材料的配合力比较好 进一步分析两组材料的特点, 攀 大穗大粒 多花多实非常突出, 每小穗粒数能达到 7~10 粒 ; 但也存在比较突出的缺点, 籽粒非常不饱满, 腹沟特别宽 深, 而且有效分蘖非常少, 难以直接用于生产 而矮孟牛 V 不但是优异的种质材料也是生产上比较理想的品种, 矮秆 多抗 高产 落黄好 株型比较理想, 但是籽粒品质不是太好, 这也是攀 无法弥补的 而且从图 5.1 也可看出, 还有五个位点的缺陷是这两个材料无法相互弥补的, 必须介入第三个材料, 小偃 6 号在这五个位点能弥补两者的缺陷, 而且具有较好的品质 另外, 郑麦 9023 和小偃 22 也有希望弥补这五个位点的缺陷,( 图 5.1) 因此, 建议将小偃 6 号 小偃 22 和郑麦 9023 纳入这一组合 矮丰 3 号是黄淮麦区第一批推广种植的冬性矮秆品种, 抗倒性特别突出, 亩穗数多, 经济系数高, 但因晚熟未能大面积推广利用, 但却被许多育种家用作杂交亲本 从图 5.3 看出, 攀 / 矮丰 3 号的 F 2 代出现许多穗形紧凑 穗粒数多 籽粒大且早熟性比较好的材料 而攀 和矮丰 3 号材料中 4 个位点的共同缺陷, 可由周麦 18 来弥补 74

84 第五章小麦分子设计育种初探 - 亲本选配 A B 图 5.1 不同材料在关键位点的等位变异取值 A: 按染色体排序 ;B: 按 PIC 由小到大排序 Fig.5.1 Comparison of alleles at key loci of cared materials with major allele of varieties cultivated in large-scale A: order on linkage group; B: 0<PIC< 讨论 基因组水平亲本选配及组合预测方法初步探讨 本研究所采用的思路和方法, 在国内外研究中尚未见报道 根据这种方法预测的杂交组合, 有两组在历史实践中已被证明 其中阿勃与五一麦在西北春麦区育成了许多品种, 包括甘麦 8 号 甘麦 11 甘麦 12 甘麦 23 甘麦 42 甘春 11 陇春 1 号 陇春 7 号和陇春 9 号等品种 其中, 甘麦 8 号较好地综合了五一麦和阿勃双亲的优良性状, 为春性, 植株基本形态和发育特 75