29期

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附常崔
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1 中国农学通报 202,28(29):20-24 Chinese Agricultural Science Bulletin 着床前小鼠孤雌囊胚及正常囊胚上 Wnt-3a 的差异表达研究林皓, 王灏, 刘石磊, 刘振伟 2, 刘云海, 倪和民, 郭勇 ( 北京农学院动物科学技术学院, 北京 02206; 2 满洲里出入境检验检疫局, 内蒙古满洲里 02400) 摘要 : 为了研究 Wnt-3a 在小鼠着床前, 孤雌囊胚和正常胚胎上的表达差异情况采用激光扫描共聚焦显微技术和半定量 RT-PCR 检测方法, 对孤雌囊胚和正常囊胚上 Wnt-3a 的表达以及分布情况进行定性和定量的检测利用激光扫描共聚焦显微技术检测发现 : 在着床前的小鼠孤雌囊胚和正常囊胚上都有 Wnt-3a 蛋白质的表达, 且只在滋养层细胞中表达 ; 通过半定量 RT-PCR 检测发现 : 着床前小鼠孤雌胚胎与正常胚胎相比,Wnt-3a 的转录水平没有显著性差异所以 Wnt-3a 在着床前小鼠孤雌胚胎和正常胚胎中都有表达 ; 而且其转录水平在这 2 种胚胎中没有显著性差异关键词 : 小鼠 ; 孤雌胚胎 ;Wnt-3a; 激光共聚焦 ; 半定量 RT-PCR 中图分类号 :S84 文献标志码 :A 论文编号 : Expression of Wnt-3a on the Pre-implantation of Both Mouse Parthenogenetic and Normal Embryos Lin Hao, Wang Hao, Liu Shilei, Liu Zhenwei, Liu Yunhai, Ni Hemin, Guo Yong ( College of Animal Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 02206; 2 Manzhouli Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Manchurian Inner Mongolia 02400) Abstract: This experiment was aimed to investigate the expression of Wnt-3a on the pre-implantation of both mouse parthenogenetic and normal embryos. In this study, Wnt-3a protein and mrna be detected and analyzed by laser scanning confocal microscope and semi-quantitative RT-PCR. The results of laser scanning confocal microscope were shown that Wnt-3a protein was only detected on trophoblast cell of both normal and parthenogenetic embryos. The results of semi-quantitative RT-PCR were shown that the transcription level of Wnt-3a have no distinct difference between normal and parthenogenetic embryos. Collectively, it could be concluded that there was expression of Wnt-3a on both normal and parthenogenetic embryos, and there existed no distinct difference of transcription level between normal and parthenogenetic embryos. Key words: mouse; parthenogenetic embryo; Wnt-3a; laser scanning confocal microscope; semi-quantitative RT-PCR 0 引言孤雌生殖, 是指在没有精子参与的情况下, 卵母细胞在物理或者化学因素的刺激下发育为胚胎或完整个体的过程卵母细胞的孤雌激活, 是发育生物学的一个重要研究内容, 也是细胞核移植中的关键技术之 [] 一孤雌激活的方法在深入探索卵母细胞的相关生理反应, 了解精卵结合过程中激活动力学细胞周期阻滞的恢复的生理机制等相关问题中, 起到非常重要的作用有实验表明, 在小鼠中孤雌胚胎通常会在妊娠 [2-4] 第 0 天死亡, 在绵羊中孤雌胚胎通常会在妊娠第 2 基金项目 : 国家自然基金面上资助项目不同来源植入前期绵羊胚胎 IFNτ 差异表达及其体外诱导子宫上皮细胞 Galectin5 表达的研究 (307285); 国家自然基金面上资助项目 IFNτ 协调 galectin 5 对绵羊体外胚胎着床调节机制的研究 ( ) 第一作者简介 : 林皓, 男,986 年出生, 硕士, 研究方向 : 动物产科及胚胎工程通信地址 :02206 北京昌平区回龙观镇北农路 7 号北京农学院动科系,Tel: , linhaocau@63.com 通讯作者 : 郭勇, 男,963 年出生, 北京人, 教授, 研究方向 : 畜禽生殖生理与动物生物技术通信地址 :02206 北京昌平区回龙观镇北农路 7 号北京农学院动科学院,Tel: , y63guo@26.com 收稿日期 : , 修回日期 :

2 林皓等 : 着床前小鼠孤雌囊胚及正常囊胚上 Wnt-3a 的差异表达研究 2 [5] [6] 天死亡虽然 Kono 等通过对小鼠卵母细胞印记基因的修饰, 将孤雌胚胎的发育能力有所提高, 并且获得了成活的孤雌小鼠但是, 大多数通过孤雌激活发育到囊胚阶段的胚胎, 经移植入小鼠子宫后, 其着床率仍然非常低所以, 这些都说明了孤雌胚胎较正常胚胎在发育和着床过程中存在着某些缺陷近年来许多实验都证明,Wnt 蛋白家族成员对胚胎着床和子宫接受性的建立, 有着十分重要的作用 Wnt 基因家族编码一组长度为 350~400 氨基酸的分泌型糖蛋白, 含有 22~24 个半胱氨酸残基的保守序列这些糖蛋白从细胞中分泌出来, 在细胞间充当信使的作用 [7] Wnt 信号通路主要有 3 条,Wnt/β-catenin 信号通路 :Wnt 蛋白与 FZD 受体结合, 使激活的 β-catenin 向细胞核区聚集, 激活 TCF/LEF 转录因子, 来达到激活靶基因产生生物学效应的效果 ;Wnt/Ca 2 + 信号通路 : Wnt 蛋白与 FZD 受体结合, 通过 G- 蛋白介导, 使细胞内 Ca 2+ 离子浓度发生波动性变化 ;Wnt/Junkinase 信号通路 :Wnt 蛋白与相应受体结合, 激活 JNK 通路研究显示这些信号通路与胚胎的发育, 如原肠的发生, 心脏的发生, 保持干细胞的全能性肿瘤神经状况有着重 [8-2] 要联系近些年许多学者通过不同的试验证明 Wnt 蛋白家族成员还在胚胎着床以及子宫接受性的建立中起着重要作用其中,Wnt-3a 是 Wnt 蛋白家族中重要的成员之一, 其在胚胎着床的过程中就发挥着十 [3] 分重要的作用 Xie 等证明了 Wnt-3a 重组蛋白, 可以诱导活化的 β-catenin 在胚胎滋养外胚层细胞的细胞核中聚集, 从而提高过氧化物酶体激活受体 δ(pparδ) 基因和 c-myc 基因的表达同时可调节滋养层的分化 [4] 完成着床过程 ; 王灏等也证明了在小鼠子宫中, 小鼠孤雌胚胎和正常胚胎的着床位点上,Wnt-3a 的表达存在着差异由于 Wnt-3a 在小鼠胚胎着床的过程中发挥着重要的作用, 且在孤雌胚胎和正常胚胎的着床位点表达, 也存在着表达差异这就提示我们,Wnt-3a 的表达是否在着床前的小鼠孤雌胚胎和正常胚胎上也存在差异, 从而导致了孤雌胚胎发育潜力的低下, 以及较低的着床率本实验采用激光扫描共聚焦显微技术和半定量 RT-PCR 检测的方法, 对 4.5 天小鼠的上述 2 种胚胎上的 Wnt-3a 表达情况进行定性和定量的检测, 为揭示影响孤雌胚胎发育的原因奠定了研究基础材料与方法. 实验动物本实验选用 8~2 周龄性成熟, 体重为 28 g 左右的 ICR 系小鼠, 购自北京维通利华实验动物科技有限公司 [SCXK( 京 ) ] 饲养条件: 人工控温 22~ 26, 光照周期为 4 L:0 D, 自由饮水取食.2 实验试剂与器材兔抗鼠 Wnt-3a 多克隆抗体, 购自 Abcam 公司货号 :ab28472, 用抗体稀释液 :00 稀释 ;Triton X-00; 多聚甲醛 ;FITC 标记的二抗 ;Trizol,Invitrogen 公司 ; Taq PCR MasterMix,BioTEKE 公司 ; 琼脂糖 ;50 x TAE 普通光学显微镜 (Nikon,YS2-H); 电热恒温干燥箱 ( 北京科伟永兴仪器有限公司,0 型 ); 酸度计 (Thermo 公司,868); 电子天平 ( 北京赛多利斯仪器系统有限公司,BS24S); 激光共聚焦显微镜 (Fluoview 000);PCR 扩增仪 (Eppendorf); 水平电泳槽 ( 北京百晶生物技术有限公司 ); 凝胶成像系统 (Bio-Rad).3 早期囊胚的获得.3. 卵母细胞获得选择阴门淡粉色的雌性鼠, 通过腹腔注射孕马血清 (PMSG), 剂量为 0 IU/ 只,48 h 后注射人绒毛膜促性腺激素 (hcg), 剂量为 0 IU/ 只于 hcg 注射 8 h 后, 通过颈椎脱臼法处死小鼠, 并取出输卵管以 HEPES 为体外操作液, 在实体显微镜下撕开输卵管膨大部, 获得卵丘卵母细胞复合体 (COCs) 将 COCs 移入 0.% 的透明质酸酶中处理 ~2 min, 脱去卵丘细胞, 此时记为 0.5 天.3.2 孤雌激活及孤雌囊胚的获得将卵母细胞移入 7% 的乙醇激活液中, 激活 7 min, 然后在含 2 mmol/l 6-DMAP 的 CZB 培养液中洗 3 遍后, 移入 30 μl 的含 2 mmol/l 6-DMAP 的 CZB 培养液滴中, 放入 37 培养箱中继续激活 3 h 将卵母细胞移出, 在 CZB 培养液中洗 3 遍, 移入 CZB 培养液滴, 放入培养箱中培养 48 h 进行半量换液培养到第 4.5 天时, 从培养箱中移出, 在体式显微镜下观察胚胎, 选出孤雌囊胚.3.3 正常囊胚的获得选择阴门淡粉色的雌性鼠, 腹腔注射 PMSG, 剂量为 0 IU/ 只,48 h 后注射 hcg, 剂量为 0 IU/ 只与正常公鼠合笼, 次日早晨 8:00 检查母鼠阴道口是否有阴道栓将见栓母鼠分笼喂养, 记 0.5 天在第四天时采用颈椎脱臼的方法处死小鼠, 在无菌情况下取出子宫, 通过冲子宫得到正常受精囊胚.4 激光扫描共聚焦显微术检测孤雌囊胚和正常囊胚上的 Wnt-3a 表达.4. 胚胎的固定将各实验组胚胎收集后, 用含 0.% BSA 的 PBS 清洗 2 次, 在含 3.7% 多聚甲醛的 PBS 中固定 30 min, 用含 0.% BSA 的 PBS 清洗 3 次 ; 然后用含有 2.5% Tween 20 的 PBS 透化 5 min, 再用含浓度为 0.% BSA 的 PBS 清洗 3 次 ; 再用含有 0.02% NaN 3,

3 22 中国农学通报 0.%BSA 的 PBS 固定周以上.4.2 免疫染色及拍照将固定好的胚胎, 在室温下用含 3% BSA 的 PBS 液滴清洗 3 次, 每次 2 min, 在清洗间隙用含 0.% BSA 的 PBS 稀释一抗, 并做滴清洗好之后, 将其置于加入一抗的 PBS 液滴中, 放入暗湿盒中, 然后 4 孵育过夜第二天用含 0.% BSA 的 PBS 液滴清洗胚胎 3 次, 同样在清洗间隙用含 0.% BSA 的 PBS 稀释二抗 (FITC- 抗鼠抗体 ), 并做滴然后再将其置于加入二抗的 PBS 液滴中, 放入暗湿盒, 室温下孵育 l h 二抗染色完成后, 用含 0.% BSA 的 PBS 清洗 3 次, 用 PI 复染核染好核的细胞, 用抗衰减封片剂 (50% 甘油 +DABCO)2 µl 封片, 在激光共聚焦显微镜 60 倍镜下观察拍照保存照片.5 半定量 RT-PCR 检测孤雌囊胚和正常囊胚上的 Wnt-3a 转录水平的差异.5. 胚胎的收集将两组囊胚在室温下用 PBS 洗 3 次, 放入 ml 离心管中, 每管中囊胚数为 00 枚左右, 收集后, 将离心管放入 -80 冰箱中保存备用.5.2 mrna 的提取向离心管中加入 ml Trizo 充分振荡, 室温静置 5 min 加入 0.2 ml 氯仿, 振荡 5 s, 离心 2000 r/min,5 min 取上清加入 0.5 ml 异丙醇, 室温静置 0 min, 离心 2000 r/min,0 min, 弃上清加入 ml 75% 乙醇, 轻轻洗涤沉淀离心 7500 r/min, 5 min, 弃上清晾干, 加入适量的 DEPC H 2O 溶解测 OD 260/OD 280 及 RNA 浓度.5.3 反转录反应按照 M-MLV 逆转录酶的 20 μl 标准反转录体系, 总 RNA 取 2 μg,oligo-dt (0 mg/l) 取 5 μl, 加 ddh 2O 补足至 7 μl,70 水浴 0 min, 冰骤冷 5 min 后, 加入 5 Buffer 4 μl dntp 2 μl RNasin μl M-MLV μl,37 反应 h.5.4 引物设计利用 Primer 5 软件对内参基因 (β-actin) 和目的基因 (Wnt-3a) 的引物进行设计, 其引物序列见表所有引物均由北京奥科鼎盛生物有限公司合成.5.5 PCR 反应体系为 cdna 2.5 μl,5 PCR buffer 2.5 μl, 双蒸水 7.2 μl,taq 聚合酶 0. μl, 上游引物 0. μl, 下游引物 0. μl 反应程序为:94 5 min 次表引物名称及序列引物名称 β-actin-f β-actin-r Wnt-3a-F 引物序列 (5`-3`) gctctattcccctccatcgtg cacggttggccttagggttcag cagcctcgtatgatagcc 目标片段大小 /bp 587 bp 345 bp Wnt-3a-R caggcagaagacagtcag 循环 ;94 40 s, s,72 30 s, 共 25 个循环 ; 72 0 min 次循环.5.6 PCR 产物检测取 PCR 产物 8 μl, 用浓度为.5% 的琼脂糖凝胶, 在 20 V 条件下电泳 30 min, 用溴化乙锭 (EB) 染色, 凝胶成像系统观察并保存结果.5.7 目标基因灰度值的测定实验中基因扩增产物电泳图的灰度值是采用 QUANTITY ONE 软件进行分析得到.6 数据处理实验中数据采用 SAS 9.0 中的 ANOVA 单因素方差分析方法进行统计学分析 2 结果与分析 2. 半定量 RT-PCR 检测孤雌囊胚和正常囊胚上的 Wnt-3a mrna 转录水平利用半定量 RT-PCR 的方法对孤雌囊胚和正常囊胚上的 Wnt-3a mrna 转录水平的检测, 结果见图 ~2, 图 2 是 β-actin 基因在小鼠孤雌囊胚和正常囊胚中扩增产物的电泳图图是 Wnt-3a 基因在小鼠孤雌囊胚和正常囊胚中扩增产物的电泳图通过对 Wnt-3a 基因扩增产物电泳图结果的分析, 可以得知在小鼠 4.5 天的正常囊胚和孤雌囊胚上都有 Wnt-3a mrna 的表达利用 Quantity one 软件, 对 3 次重复实验的电泳图进行分析, 得到 β-actin 基因扩增产物的灰度值以及 Wnt-3a 基因扩增产物的灰度值, 用 Wnt-3a 基因的灰度值与 β-actin 基因的灰度值相比得到相对灰度值, 见表 2 利用 SAS 9.0 软件中的单因素方差分析功能, 对所得到的相对灰度值进行统计分析, 结果表明两实验组间的相对灰度值差异不显著 (P>0.05) 也就说明, Wnt-3a 基因在孤雌囊胚和正常囊胚上的转录水平没有显著性差异 600 bp 500 bp M 2 3 M 2 3 β-actin 587 bp 400 bp 300 bp M:500 bp DNA Ladder;: 阳性组织 ( 小鼠肺脏 );2: 正常囊胚实验组 ;3: 孤雌囊胚实验组图 β-actin 基因和 Wnt-3a 基因扩增产物电泳图 wnt-3a 345 bp

4 林皓等 : 着床前小鼠孤雌囊胚及正常囊胚上 Wnt-3a 的差异表达研究 23 表 2 3 次重复实验 PCR 产物灰度值实验分组正常胚胎孤雌胚胎 Wnt-3a β-actin Wnt-3a/β-actin 激光扫描共聚焦显微术检测孤雌囊胚和正常囊胚上的 Wnt-3a 表达利用激光扫描共聚焦显微镜, 对孤雌囊胚和正常囊胚上 Wnt-3a 蛋白质的检测结果 ( 如图 2) 绿色为 Wnt-3a 的表达位点, 红色为 PI 复染的细胞核图片 A~A3 为阴性对照组 ; 图片 B~B3, 图片 C~C3 为孤雌囊胚实验组, 由检测结果可以得出 Wnt-3a 在孤雌囊胚上有表达, 且表达分布在主要存在于滋养层细胞上而内细胞团细胞上没有 Wnt-3a 蛋白的表达 ; 图片 D 至图片 D2, 图片 E 至图片 E2 为正常囊胚实验组, 由检测结果可以得出,Wnt-3a 在正常囊胚上有表达, 与孤雌囊胚实验组结果相似,Wnt-3a 表达主要分布在滋养层细胞上, 而内细胞团细胞上没有表达实验结果表明,Wnt-3a 蛋白在着床前正常囊胚和孤雌囊胚上有表达, 且表达的分布情况相似, 都是在滋养层细胞上表达 A~A3: 阴性对照 ;B~B3: 孤雌囊胚 ;C~C3: 正常囊胚 ;Tr 滋养层 ;ICM 内细胞团图 2 激光扫描共聚焦检测 Wnt-3a 在孤雌囊胚和正常囊胚上的表达情况 3 结论本实验利用激光扫描共聚焦显微术和半定量 RT-PCR 技术, 对着床前小鼠正常囊胚和孤雌胚胎上 Wnt-3a 蛋白表达和 mrna 转录水平进行了检测激光扫描共聚焦检测结果表明, 在正常囊胚和孤雌囊胚上都有 Wnt-3a 蛋白的表达, 且只在滋养层细胞上进行表达的通过半定量 RT-PCR 检测结果显示, 正常囊胚和孤雌囊胚上 Wnt-3a 基因的转录水平不存在显著

5 24 中国农学通报 [5] 性差异, 这与 Liu 等的实验结果相同这表明在胚胎着床前期,Wnt-3a 基因的转录水平不是对孤雌胚胎生长发育造成影响的主要因素 4 讨论近些年许多学者通过不同的实验证明,Wnt 蛋白家族成员与胚胎着床以及子宫接受性的建立有重要作 [3] 用 Xie 等通过实验表明, 一旦抑制 Wnt-3a 蛋白的表达, 将使得 Wnt-3a 诱导激活型 β-catenin, 在滋养层细胞核内聚集受到阻碍, 这样会导致正常胚胎着床能力下降通过实验对小鼠胚胎着床前后的胚胎源 Wnt-3a 的检测, 证明其从胚胎 2- 细胞时期到着床后期都有持续表达, 并且在着床窗口期 ( 囊胚期 ) 有高表达本实验通过利用激光扫描共聚焦显微术, 对 4.5 天时小鼠囊胚检测, 发现 Wnt-3a 蛋白在 2 种类型的胚胎, 即正常胚胎和孤雌胚胎上都有表达, 这与上述实验的结果相吻合在本实验中还发现,Wnt-3a 蛋白主要是在滋养层细胞上表达, 而在胚胎的内细胞团细胞上没有检测到 Wnt-3a 蛋白的表达滋养层细胞和内细胞团细胞, 是在囊胚阶段分化出的 2 种类型的细胞, 其中内细胞团细胞在胚胎着床后经过分裂分化, 最终会形成发育为身体的各个组织器官 ; 而滋养层细胞经过分裂分化, 最终发育为胚外结构, 如胎盘组织等胎盘组织是胎儿和母体进行营养物质和废物交换的重要场所, 是胎儿正常发育过程的必要保证故可以认为 Wnt-3a 蛋白对胚胎的着床和发育有着重要的作用 [6] Harwood 等证明,Wnt-3a 在 4 细胞时, 有时表达有时不表达, 而在桑葚胚和囊胚期一直都有表达 ; [7] Kemp 等用 RT-PCR 的方法证明了 Wnt-3a 在囊胚期高表达, 但是当胚胎着床后的第 5.5 天和 6.5 天时, 表达 [5] 量下降 ;Liu 等运用全基因扫描技术检测了着床前孤雌胚胎和正常胚胎上基因表达的差异情况,Wnt-3a 不存在于所检测到的 759 个表达有差异的基因当中这一全基因组扫描结果与本实验结果吻合本实验利用半定量 RT-PCR 方法对 4.5 天时正常胚胎和孤雌胚胎上 Wnt-3a 基因的转录水平进行检测, 同样发现 Wnt-3a 基因的转录水平在 2 种类型的胚胎中不存在差异但 [4] 是, 王灏等的实验结果表明, 正常囊胚和孤雌囊胚在着床的第 5.5 天和 6.5 天时存在有差异据此可以推断, 孤雌胚胎较正常胚胎发育过程中出现的缺陷, 有可能是由于 Wnt-3a 在着床后期胚胎上的转录水平和表达水平的差异所造成的, 而并非是在胚胎的着床前期参考文献 [] 陈大元. 受精生物学 - 受精机制与生殖工程 [M]. 北京 : 科学出版社, [2] Surani M A, Barton S C. Development of gynogenetic eggs in the mouse: implications for parthenogenetic embryos[j].science,983, 222(4627): [3] Surani M A, Barton S C, Norris M L. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis[j].nature,984,308(5959): [4] Surani M A, Kothary R, Allen N D, et al. Genome imprinting and development in the mouse[j].dev Suppl,990: [5] Hagemann L J, Peterson A J, Weilert L L, et al. In vitro and early in vivo development of sheep gynogenones and putative androgenones [J].Mol Reprod Dev,998,50(2): [6] Kono T, Obata Y, Yoshimzu T, et al. Epigenetic modifications during oocyte growth correlates with extended parthenogenetic development in the mouse[j].nat Genet,996,3():9-94. [7] 赖巧红.Wnt 信号转导途径与胚胎着床 [J]. 国外医学计划生育分册,2005,3(24):6-9. [8] Reya T, Clevers H. Wnt signalling in stem cells and cancer[j]. Nature,2005,434(7035): [9] Veeman M T, Axelrod J D, Moon R T. A second canon. Functions and mechanisms of beta-catenin-independent Wnt signaling[j].dev Cell,2003,5(3): [0] De Ferrari G V, Moon R T. The ups and downs of Wnt signaling in prevalent neurological disorders[j].oncogene,2006,25(57): [] Reya T, Duncan A W, Ailles L, et al. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells[j].nature,2003,423 (6938): [2] Miyabayashi T, Teo J L, Yamamoto M, et al. Wnt/beta-catenin/CBP signaling maintains long-term murine embryonic stem cell pluripotency[j].proc Natl Acad Sci U S A,2007,04(3): [3] Xie H, Tranguch S, Jia X, et al. Inactivation of nuclear Wnt-beta-catenin signaling limits blastocyst competency for implantation[j].development,2008,35(4): [4] 王灏, 李贺娟, 尹燕云, 等.Wnt3a 在小鼠孤雌胚胎及正常胚胎早期着床部位的表达变化 [J]. 中国实验动物学报,200,8(6): [5] Liu N, Enkemann S A, Liang P, et al. Genome-wide gene expression profiling reveals aberrant MAPK and Wnt signaling pathways associated with early parthenogenesis[j].j Mol Cell Biol, 200,2(6): [6] Harwood B N, Cross S K, Radford E E, et al. Members of the WNT signaling pathways are widely expressed in mouse ovaries, oocytes, and cleavage stage embryos[j].dev Dyn,2008,237(4):099-. [7] Kemp C, Willems E, Abdo S, et al. Expression of all Wnt genes and their secreted antagonists during mouse blastocyst and postimplantation development[j].dev Dyn,2005,233(3):

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