中 国 畜 牧 兽 医 卷 & %.-9%:9#06+! 0-1.:0&1:6#00*#00%0!.19;- -.09& #0.60%0+! 0&1:-10&09#0#96 )23(.9&-90.:1&9%9#000.& :#000&1:-!),-(+! 00-1

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1 中国畜牧兽医! " # )/ 对缺少内源性 )( 的绵羊早期胚胎体外发育的影响 李贺娟 秦国嵩 齐晓龙 盛熙晖 刘云海 郭 勇 倪和民 北京农学院 北京 摘 要 试验旨在探讨添加外源!.19+! 的稳定类似物 对缺少内源性前列腺素 + 的绵羊早期胚胎体外发育的影响 常规体外受精 通过在体外培养液中单独或联合添加前列腺素合成限速酶 23( 和 23( 的特异性抑制剂 )2 和 ) 观察 23( 和 23( 对绵羊早期受精胚胎体外发育的影响 添加抑制剂 ) 后 再协同添加不同浓度!.19 观察 +! 对绵羊早期体外胚胎发育的具体作用 并对孵化囊胚的细胞数进行分析 结果显示 在卵裂率和囊胚率方面 单独添加 ) 与同时添加 )2 和 ) 组间差异不显著 而与对照组间差异显著 添加 ) 后 再添加不同浓度的外源性!.19 可代替胚胎内源性 +! 的作用 基本消除 23( 抑制剂对绵羊早期胚胎体外发育的不利影响!.19 的浓度以? $ &.' 为宜 染色结果差异不显著 本试验结果表明 胚胎内源性 23( 对绵羊早期胚胎中 +! 的合成起主要调控作用 外源添加!.19 可补偿胚胎内源性 +! 的缺失作用 解除 ) 对 23( 的特异性抑制作用 最终促进绵羊早期胚胎的体外发育 关键词 前列环素 +! 绵羊 早期胚胎 体外发育中图分类号 ) 文献标识码 文章编号!"!)/ $'42&!&-&+(%"2$ &+(;$"'"9$6-$$ "$')( '!0-!%!(-.%),(#'! 4#-34%!0& 0.3-!)*.#! 0. *+('"*#9:;-90909%-909# ! 0-1.:0&1:00.&09 6#00-!).-%60%019-%.- +*#006#91)- )2 06-.:#9%9#0-99:623(-123(; #0.910 &0&10090.:99:9# (-23(0&1:00.&096#00 < !19; :99#0.910&0&909%-90 9# ! 0-1.:0&1:00.&096#00-!)*#010.9#;09#-99#010 ;010% #0.0--%0-.-9: ;009#0%1.:;9# )-9#-9;9#9# )-)2 *#010;010% ;009#0%1.:;9# )-91.% % ) %0! #01.060&1:010+! ;## 9-9-.:0.&-909# (#910-1.:0&1:00.&09-!) *# !.19;-? &.'9-%#;0% *#010.90&91-909#-90&1:0%023(.-:0- 收稿日期 基金项目 年度北京市教委北京市属高等学校创新团队建设与教师职业发展计划项目 体细胞转基因克隆肉牛新品系培育与利用 +(" 作者简介 李贺娟 女 天津人 硕士 助理研究员 研究方向 产科与胚胎工程,&-..#0-& 通信作者 倪和民 男 陕西大荔人 教授 硕士生导师 研究方向 产科与胚胎工程,&-.#0&-.:&

2 中 国 畜 牧 兽 医 卷 & %.-9%:9#06+! 0-1.:0&1:6#00*#00%0!.19;- -.09& #0.60%0+! 0&1:-10&09#0#96 )23(.9&-90.:1&9%9#000.& :#000&1:-!),-(+! 00-1.:0&1:-!)00.&09 前列腺素 19-%.-+ 家族是存在于动物和人体中的一类具有多种生理活性的不饱和脂肪酸 参与各种雌性生殖过程 包括排卵 受精 胚胎植入和分娩 世纪 年代由瑞典科学家 首先在人的精液中发现 前列环素 +! 是着床表达量最高的前列腺素 对胚胎植入起着重要作用 +! 是由花生四烯酸在环氧化酶 :.:%0-023( 的作用下生成 + 再在 + 合成酶作用下生成的 其中环氧化酶对于 + 的形成起着决定性作用 分为 23( 和 23( 两种 类型 目前关于 + 与哺乳动物胚胎发育的相关研究取得了一定进展 主要集中在小鼠等小型实 验动物上 ( 等研究显示小鼠输卵管和子宫诱导 23( 产生的 +! 对于胚胎的孵化和着床起着 重要的作用 -1: 等研究显示 与体内胚胎相比 哺乳动物体外胚胎发育迟缓主要是因为体外培养 液缺少输卵管的保护性环境 -% 等证实在培养液中添加 +! 的稳定类似物!.19 能够提高小鼠囊胚体外孵化率 且能够提高着床潜力和产仔率 选择性的 23( 抑制剂抑制了小鼠内源性 +! 的产生 进而抑制了胚胎的孵化 因此 前人研究证明 除输卵管和子宫外 小鼠着床前胚胎也能产生大量的 +! 对于胚胎的体外发育发挥重要作用 且它的稳定类似物能够有效地提高小鼠胚胎的孵化率和着床率 但是 +! 及其类似物对绵羊和牛等家畜早期受精胚胎的体外发育的影响研究较少 本试验通过在培养液中单独或联合添加 23( 和 23( 抑制剂 并协同添加不同浓度的!.19 旨在探讨 23( 和 23( 哪种酶诱导产生的 +! 对绵羊早期受精胚胎体外发育起关键作用 为揭示绵羊胚胎体内生长发育机制提供理论依据 材料与方法 8 材料 绵羊卵巢取自河北大厂屠宰场 绵羊鲜精取自北京市昌平盛世富民清真食品有限公司 8 主要试剂及配制 )2) 和!.19 均购自 2-:&- 公司 细胞培养液 *2" 购自 公司 胎牛血 清 = ) 购自 :2.0 公司 发情绵羊血清于绵羊发情当天用常规血清制备法自制 其余试剂均购自美国 )%&- 公司 在缓和的氮气环境中 将!.19 的溶剂乙酸甲酯蒸发 并迅速加入 <")3 制成 $ &.' 的母液 溶解 )2 和 ) 的 <")3 需要预先在惰性气体的环境中平衡 制成 $ &.' 的母液备用. 绵羊卵母细胞的采集与成熟培养从屠宰场采集的绵羊卵巢置于 含双抗的生理盐水中在 # 内运回实验室 经过处理后用切割法收集卵母细胞 在体视显微镜下挑选出细胞质均匀 卵丘细胞完整的卵母细胞 用洗卵液和成熟液各清洗两次后 将卵母细胞放入 ' 成熟培养液的小滴 每滴 枚 中 在 23 的饱和湿度的培养箱中进行体外成熟培养. 绵羊精子处理和卵母细胞的体外受精将成熟的卵母细胞用 透明质酸酶处理 除去部分颗粒细胞 移入受精滴中 取经上游处理的精子加入含卵子的受精滴中 精子密度为? 个 &' 置于 23 的饱和湿度培养箱中培养 #. 绵羊胚胎体外培养和分组 试验一 绵羊卵母细胞与精子共孵育 # 后 受精卵在洗卵液中洗 次 将外周颗粒细胞和精子冲洗掉 然后移入 个试验组的培养滴中 个试验组分别为 对照组为常规培养液 )2 组为培养液中添加 &.' )2 ) 组为培养液中添加 &.' ) )2D ) 组为培养液中添加 &.' )2 和 &.' ) 最后把培养滴放入 23 的饱和湿度培养箱中培养 隔天半量换液 # 统计卵裂率 统计囊胚率和完全孵化率 试验二 绵羊卵母细胞受精方法如试验一 然后移入 个试验组的培养滴中 个试验组分别为 对照组为常规培养液 ) 组为培养液中添加 &.' ))D? $ &.'!. 19 组为培养液中添加 &.' ) 后 再添

3 期 李贺娟等 +! 对缺少内源性 + 的绵羊早期胚胎体外发育的影响 加? $ &.'!.19)D? $ &.'!.19 组培养液中添加 &.' ) 后 再添加? $ &.'!.19)D? $ &.'!.19 组为培养液中添加 &.' ) 后 再添加? $ &.'!.19 每隔 # 观察胚胎的发育情况 统计囊胚率和完全孵化率 试验三 对试验二中各组的完全孵化的囊胚用荧光染料 进行染色 孵化胚胎经 + ) 清洗 次 转移到含 %&' 0#9 的 + ) 中 孵育 & 染色结束后 将胚胎洗涤 次 转移到载玻片上 再加上 ' 甘油于胚胎液滴上 用凡士林在载玻片四角点 个柱 盖上载玻片 在实体显微镜下小心按压盖玻片 使卵受压后稍微膨大但不至于破碎为宜 用指甲油封片 然后在荧光显微镜下用紫外线激发光 利用细胞计数器观察并记录孵化囊胚细胞数目. 统计分析胚胎发育率用 检验进行差异显著性分析 染 色结果用单因素方差分析进行检验 以 为差异显著性判断标准 结果与分析. 抑制剂 抑制剂 对绵羊受精胚体外发育的影响 由表 可知 )2 组的卵裂率 囊胚率与对照组相比差异不显著 说明抑制 23( 的合成对绵羊早期胚胎的体外发育没有影响 ) 组的卵裂率 囊胚率与对照组相比差异显著 与 &.')2D&.' ) 组相比差异不显著 说明单独添加 23( 的抑制剂和联合添加 23( 和 23( 两种抑制剂对绵羊早期胚胎的体外发育的作用相似 都有一定的抑制作用 而在囊胚孵化率方面差异均不显著 表 抑制剂 抑制剂 对绵羊受精胚体外发育的影响 '+!"(!"&$&'-$("$2@1$$+$'@1$$+$("$2 ($&'(2&!(&+(&-&+(% 组别 胚胎数 枚 卵裂率 囊胚率 囊胚孵化率 1 60&1: 2.0--% : #0.-9:91-90 对照组 291.% )2 组 )2% ) 组 )%1 - )2D) 组 )2D)%1 - 同列数据肩标不同字母表示差异显著 肩标相同字母表示差异不显著 下同!9#0-&0.&-.0;9# &0-% #.0;9#9#0-& &0-% *#0-&0-0.;. 培养液中添加抑制剂 后再添加不同浓度的 /( 对于绵羊囊胚的形成和孵化的影响由表 可知 培养液中添加 &.' ) 后 再添加? $ &.'!.19 囊胚率和孵化率与对照组相比差异不显著 与 ) 组相比差异显著 而添加 )D? $ &.'!.19 和 )D? $ &.'!.19 组的囊胚率和孵化率与对照组和 ) 组差异均不显著 但囊胚率和孵化率均高于 ) 组 其中 )D? $ &.'!.19 组囊胚率最高. 孵化胚胎的 % 染色结果由图 可知 培养液中添加 &.' ) 抑制剂孵化囊胚细胞数目与对照组差异不显著 说明添加 23( 抑制剂对于囊胚细胞数目没有影响 培养液中添加 &.' ) 后 再添加? $ &.'!.19 孵化囊胚细胞数目与对照组和 ) 组差异均不显著 各组平均每枚孵化囊细胞数目为 个 说明添加 23( 抑制剂后再添加? $ &.'!. 19 对于囊胚细胞数目没有影响

4 中 国 畜 牧 兽 医 卷 表 培养液中添加抑制剂 后再添加不同浓度的 /( 对绵羊囊胚的形成和孵化的影响 '+!"(!$!""'$(!/(!&'$''"$6!(&+('!'$6$"1 &$& 组别 胚胎数 枚 囊胚率 囊胚孵化率 1 60&1:.-9: #0.-9:91-90 对照组 291.%1 - - ) 组 )%1 - )D? $ &.'!.19 组 - )D? $ &.'!.19%1 )D? $ &.'!.19 组 - - )D? $ &.'!.19%1 )D? $ &.'!.19 组 - - )D? $ &.'!.19%1 常规培养组 ) 组 )D? $ &.'!.19)D? $ &.'!.19)D? $ &.'!.19 肩标不同字母表示差异显著 肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著 291.%1)%1)D? $ &.'!.19%1)D? $ &.'!.19 %1)D? $ &.'!.19%1!9#0-&0.&-.0;9# &0- % #.0;9#9#0-& &0-% 图 培养液中添加抑制剂 后再添加不同浓度 /( 对于绵羊孵化囊胚细胞核数目的影响 5$6.!"(!$!""'$(!/(&+!"$!('"+'("('!'$6 $$+$$"&$& 讨 论 前列腺素 + 在胚胎发育阶段发挥着多方面的作用 包括透明带脱落 孵化 囊胚液积累和滋养 层伸长 23( 作为前列腺素合成的终端限速酶 其同工酶 23( 和 23( 在生殖过程中起重要作用 研究表明 呈固有型表达的 23( 不受激素或感染等因素的诱导 主要参与细胞代谢平衡所需要的低水平 + 的合成 而诱导型 23( 主要参与许多生殖过程 包括排卵 受精 细胞增殖和分化等特 定时期 + 的合成 可被诱导 本试验在培养液中添加了 23( 的抑制剂 绵羊体外胚胎的卵裂率 囊胚率和囊胚孵化率明显降低 这与 +-1- 等在小鼠试验中添加 23( 抑制剂 ) 降低 胚胎发育率的结果相一致 -% 等研究也表明 培养液中添加 23( 抑制剂可降低小鼠囊胚孵化 率.&-- 等试验结果表明 23( 可调控胚胎着床过程中花生四烯酸乙醇胺, 水平 本试验培养液中添加 23( 抑制剂 ) 后 再添加不同浓度的!.19 恢复了绵羊早期胚 胎体外发育 这与 ' 等报道的培养液中添加 +! 类似物能提高小鼠胚胎卵裂率 促进囊胚的形成 提高囊胚的总细胞数 以及促进孵化等结果一致 本试验中添加抑制剂后再添加!.19 组的囊胚率和孵化率均高于对照组 试验结果进一步表明体外培养的胚胎产生的内源性 +! 是有限的 外源添加 +! 类似物能够促进绵羊囊胚形成和孵 化 这与王峰等在猪胚胎培养液中添加 +! 类似物!.19 促进囊胚发育结果相一致 囊胚分裂球的多少可能与预测哺乳动物体内胚胎植入率之间

5 期 李贺娟等 +! 对缺少内源性 + 的绵羊早期胚胎体外发育的影响 存在一定相关性 本试验各处理组孵化囊胚的细胞 数目差异均不显著 而王峰等试验表明 培养液中添加!.19 能增加猪囊胚细胞数目 原因可能是王峰等的试验只是在培养液里单独添加了!. 19 没有添加 23( 抑制剂 或者!.19 对于不同的物种作用有差异 国外有文献报道 +! 发挥作用主要通过 种跨膜受体!+ 细胞核受体 ++7% 和自分泌等方式 -% 等报道小鼠胚胎中 23( 源性的 +! 可能是通过激活 ++7% 的配位体起作用 配位体激活的 ++7% 和视黄醇类 ( 受体形成异源二聚体 这样与 ++7% 反应元件结合 激活基因转 录 目前 ++7% 调节的两种基因酶是 & 和磷酸肌醇激酶 +! 活化的 ++7% 能通过上调 & 来保护内细胞团!2" 抵抗氧化 使 +<8 和 9 通路隔离受损的磷酸纤维素 抵抗细胞调亡 进而增加囊胚的细胞数和促进孵化 但本试验结果显示各组孵化囊胚的细胞数目差异不显著 说明 +! 提高绵羊囊胚形成和促进孵化可能还有其他途径 小 结 本试验结果表明 外源添加!.19 能够代替胚胎内源性 +! 的作用 基本可以恢复 23( 抑制剂对绵羊早期胚胎体外发育产生的不利影响 说明 23( 催化花生四烯酸 经 + 合成酶作用生成的 +! 具有促进了胚胎发育的能力 但关于 ++7% 如何起作用还不是很清楚 关于 23( 作用生成的 +! 起作用的阶段存在不同的说法 还需要进一步的试验证明 参考文献 2'7#0.<E790&-* %-.91-9E' %!!)))*)#! )). 陈乐林 妊娠晚期子宫前列环素合成通路及其意义探讨 < 汕头 汕头大学 范衡宇 杨增明 前列腺素及其受体与哺乳动物的生殖 E 生理科学进展 沈 媛 黄 娜 刘 博 等 雌激素对奶牛输卵管组织 23( 和 23( 表达的影响 E 中国畜牧兽医 ( "*-4#(E,6096(-/:/# !++7%%-.%-9#;-:0& 1:&.-9-9:69&0E, ) %) -1: #9#0&-&&-.-.-9:9E "), ) -%E25 5 ).:E)+19-:.0 #-00&1:#-9#%9901& &19-.9:E, ) -%E2.:E)5 5 ) :. 0#-09#0& # &00&1:E, ) )%'& <-)809-.<:10%.-96,= 6-&.:6%1;9# (9#09011 %9# #&09--9-#& #0.-9:9;9#9#0.&-.09#0.& ;9# & '!=0609&0E") )#) 赵 薇 程丹玲 朱 辉 等 环氧化酶在生殖中的作用 E 哈尔滨医科大学学报 +-1-+'E- 8,-.-96:.:% %019-:.&010&.-9-90&1:00.&09-!)E&* /## -%E25 5 ).:E)09-.2:.:% %0 19-:. 0#-0 &00&1: #-9#%E, ).&--"+90.==0- "09-.--& &0.%23(-90&09-.&--0:10%.-91E)# )#! '2 '00" )0# :.0 #-0&00&1:00.&09-#-9#% &1:0.&01-.&0E!/! 王 峰 刘仲凤 史春荣 等!.19 对猪早期胚胎体外发育的影响 E 畜牧兽医学报 <1-+-/01= %.- 10%.-90 0& #00E), ) <+*- )"#-. ' : #09%-.%-9#;-:E") 'E4'00)#0.-< # :01& &0-9010%.-9E! )#')#) <-9-)7<0*-(09-.9#4-%100 01%",9##1:.-96 <.01 -.%-.99# # &-#01:E 8-%E;-%)E4E & %++7%1 &90.-9:9#-9#% &0E"), ) 责任编辑 晋大鹏

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