下部做清洗液滴 (HTF) 4 发育培养皿 :35mm( 进口 ) 皿, 培养密度 :10embryo/40ul 3 操作步骤 A. 体内成熟的 MⅡ 期卵母细胞收集准备 48h later 13-18h later 雌鼠颈椎脱臼致死,75% 酒精消毒背部, 从背部剪下两侧卵巢及输卵管迅速置于预热的

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1 Mouse In Vitro Fertilization (IVF) 南京爱贝生物科技有限公司提供全套 EasyCheck 小鼠体外受精 胚胎冷冻 胚胎移植试剂与耗材 提供小鼠胚胎玻璃化冷冻 精子冷冻 IVF ICSI 输卵管胚胎移植 非手术法子宫胚胎移植等技术培训及视频资料 客服 : 小鼠胚胎生产方法 (IVF PA SCNT) 一 小鼠卵母细胞体外成熟 小鼠 GV 期卵母细胞体外成熟液 (Tan Jin-He et al,2008) Component Company /500mL /100mL TCM-199 Gibco 450ml 90ml FCS(10%) Gibco 50ml 10ml 17 β-estradiol Sigma 0.5g 0.05g Sodium pyruvate Sigma 12.1g 0.242g FSH(0.05IU/ml) 25 IU 5 IU LH (0.05IU/ml) 25 IU 5 IU EGF(10ng/ml) 5000ng 1000ng 备注 :1 体外成熟密度 :30 oocytes/100ul maturation medium 二 小鼠卵母细胞体内成熟及体外受精 (IVF) 1 实验材料 1 雌性和雄性小鼠 : 昆明白,6-8 周龄,12 光照, 温度 20-25, 自由采食和饮水 2 耗材与设备 :1ml 注射器, 眼科剪, 眼科镊 3 试剂 :PMSG/ECG,HCG, 体外受精液 HTF,KSOM-AA 胚胎培养液 2 培养皿准备 (IVF 前 1 天下午准备并在培养箱里平衡过夜 ) 1 鲜精采集皿 :1ml HTF(35mm 国产 ) 2 卵子采集皿 :1ml HTF 或 HEPES-KSOM(35mm 国产 ) 3 体外受精皿和清洗用培养皿 :60mm( 进口 ) 皿 ---- 上部做受精液滴 (HTF),

2 下部做清洗液滴 (HTF) 4 发育培养皿 :35mm( 进口 ) 皿, 培养密度 :10embryo/40ul 3 操作步骤 A. 体内成熟的 MⅡ 期卵母细胞收集准备 48h later 13-18h later 雌鼠颈椎脱臼致死,75% 酒精消毒背部, 从背部剪下两侧卵巢及输卵管迅速置于预热的 HFM 在体视镜下用 1ml 注射器 (1 号针头 ) 将输卵管刺破, 释放出 COCs 用口吸管将 COCs 置于 100ul 0.1%Hya 消化去除卵丘细胞 ( 体视镜下观察 ) MII 期卵母细胞经 HFM 液滴洗涤 3 次, 移入 HTF 受精液中, 置于 CO2 培养箱培养 1h 备用 (10embryo/50ul) B. 采集小鼠精液进行 IVF MII 期卵母细胞准备好之后, 颈椎脱臼致死雄鼠 75% 酒精消毒背部, 剪开背部取出附睾尾及输精管迅速置于预热的获能液 HTF 中, 剪 5-7 下, 使精子上浮并获能 30min~1h 用移液器取 10~20ul( 依精液浓度而定 ) 精液于受精液中共同孵育 6 小时 倒置显微镜下挑选排出 PB2 或有 2PN 的受精卵经 KSOM 培养液洗涤几次, 移入 KSOM 培养 液 ( 平衡 4h 以上 ) 继续培养 此时计为 0h, 统计受精率 观察, 记录体外受精和发育情况 三 小鼠体内受精原核期胚胎获取 (In Vivo) 48h later 腹腔注射 10IU HCG, 立即与雄鼠按 1:1 比例合笼交配 次日早晨检查雌鼠是否有阴道栓, 有阴栓者表明已成功交配 22h post-hcg 将有阴栓的雌鼠颈椎脱臼致死,75% 酒精消毒背部, 从背部剪下两侧卵巢及输卵管迅速置于预热的 HFM 液中 在体视镜下用 1ml 注射器 (1 号针头 ) 将输卵管刺破,zygote 释放出来

3 用口吸管 ( 移卵管 ) 将 zygote 置于 50ul 0.1%Hya 消化去除卵丘细胞, 再经 HFM 液滴洗涤 3 次 在体视显微镜下观察 zygote 形态, 挑选有 PB2 或 2PN 的形态正常受精卵置于 KSOM 培养液, 先在平衡 ( 平衡至少 4h 以上, 最好是 1 天的平衡时间 ) 过的培养液滴中洗涤几次然后再开始体外培养 微滴培养法 :10 个 embryo/20ul medium(lane 和 Gardner,1992) 观察 记录体外发育情况 (2-cell,4-cell,8-cell,morula 和 blastocyst) 四 小鼠卵母细胞孤雌激活 (PA) 参考 (Tan Jin-He et al,2008) 方案一 : 48h later 18h 雌鼠颈椎脱臼致死,75% 酒精消毒背部, 从背部剪下两侧卵巢及输卵管迅速置于预热的 CZB-H 在体视镜下用 1ml 注射器 (1 号针头 ) 将输卵管刺破, 释放出 COCs 用移卵针将 COCs 置于 50ul 0.1%Hya 消化去除卵丘细胞 将 MII 期卵母细胞移入 Ca 2+ -free CZB 中洗涤几次 MII 期卵母细胞在激活液 [Ca 2+ -free CZB+ SrCL 2(10 m M/L)+CB(5μg/ml)] 中激活 2.5h 倒置显微镜观察卵母细胞是否激活,1PN 或 2PN 表明成功激活 激活后的卵母细胞在平衡过的 KSOM 或 CZB 培养液中洗涤 3 次, 转移至 KSOM 或 CZB 液滴开始 IVC 观察, 记录胚胎体外发育情况 方案二 : 48h later 13h 雌鼠颈椎脱臼致死,75% 酒精消毒背部, 从背部剪下两侧卵巢及输卵管迅速置于预热的 CZB-H 在体视镜下用 1ml 注射器 (1 号针头 ) 将输卵管刺破, 释放出 COCs 用移卵针将 COCs 置于 50ul 0.1%Hya 消化去除卵丘细胞

4 将 MII 期卵母细胞移入 Ca 2+ -free CZB 中洗涤几次 MII 期卵母细胞在激活液 [Ca 2+ -free CZB+ SrCL 2(10 m M/L)+CB(5μg/ml)] 中激活 2.5h 紧接着在 CZB+2 mm /L 6-DMAP 培养 3.5h 倒置显微镜观察卵母细胞是否激活,1PN 或 2PN 表明成功激活 激活后的卵母细胞在平衡过的 KSOM 或 CZB 培养液中洗涤 3 次, 转移至 KSOM 或 CZB 液滴开始 IVC 观察, 记录胚胎体外发育情况 五 小鼠体细胞核移植 ( 克隆 ) 1 化学去核 ( 化学诱导和化学辅助去核 ) 小鼠超数排卵及 GV 期卵母细胞体外成熟 (IVM) ICR 雌鼠 (6-8 周龄 ) 腹腔 (IP) 注射 10IU PMSG( 时间 :8:00am) 46-48h later 颈椎脱臼致死小鼠, 取双侧卵巢于 H-CZB 中,30G 注射器刺破大的有腔卵泡 收集 COCs/NO 并在 H-CZB 液滴中洗涤几遍, 移入 IVM 皿 ( 平衡 4h 以上 ) 培养 5h, 培养密 度 :10-20 个 /50μl 卵母细胞去核和透明带消化体外成熟 5h 后, 机械吹吸 COCs 去除卵丘细胞 ( 没有用 Hya 消化去除卵丘细胞 ) 挑选 GVBD 卵母细胞 ( 体视镜能观察到 GVBD 吗?) 移入 DC(0.4μg/ml)+KSOM 培养 2h 移入 DC(0.4μg/ml)+CHX(50μg/ml)+ KSOM 培养 12h ( 时间太长, 尝试把时间缩短为 3h) 将排出 PB1 的卵母细胞移入 Pronase(5mg/ml) 消化约 2min 去除透明带 在 KSOM 液滴中洗涤 3 遍, 移入 KSOM 液滴,37,5%CO 2 培养 (15h) 待用 粘合和融合去核卵母细胞在 KSOM 中培养 15h 后 ( 尝试把时间缩短为 0~5h) 卵胞质移入 PHA (10μg/ml) + H-CZB 粘合液滴中,37,2min 移入 H-CZB 体细胞 ( 卵丘细胞 ) 液滴中, 拨动卵胞质使其与体细胞粘贴, 形成卵母细胞 - 体细胞 复合体

5 卵母细胞 - 体细胞复合体移入融合液 ( 无 Ca) 中平衡 2min, 立即转入电击槽电极间 交流电 5v/mm,3μs 对复合体进行排队 (10 个 / 批 ), 接触面平行于两电极间 施加直流电脉冲 (92V/mm, 70us, 2 次 ), 静置 1min 复合体在 KSOM 液滴中洗涤 2 遍, 快速移入 KSOM 液中培养 20~30min 后检查融合情况 将成功融合的复合体移入 Ca 2+ -free CZB+ CB(5μg/ml) 中培养 3h( 防止电刺激后排出 PB2 极体, 化学激活 促进体细胞的重编程 ) 将融合后培养 3h 的复合体移入激活液 [Ca 2+ -free CZB+ SrCL2(10 m M/L)+CB(5μg/ml)] 培养 6h 无透明带重构胚体外培养激活后的重构胚在 KSOM 液滴中洗涤 2 遍后, 移入 WOW 体系培养 (10 个 microwells/well, embryo density: 10 个 /500μl) 2 手工去核 小鼠超数排卵及 MⅡ 期卵母细胞收集 ICR 雌鼠 (6-8 周龄 ) 腹腔 (IP) 注射 10IU PMSG( 时间 :5:00pm) 46-48h later 16-18h later 颈椎脱臼致死小鼠, 取双侧卵巢于 H-CZB 中, 在体视镜下用 1ml 注射器 (1 号针头 ) 将输卵 管膨大部刺破,COCs 团块和 NO( 自然裸卵 ) 释放出来 将 COCs 移入 0.1% 透明质酸酶静置 2min, 去除卵丘细胞, 收集卵母细胞和卵丘细胞并在 H-CZB 液滴中洗涤几遍后, 移入 H-CZB 待用 卵母细胞透明带部分消化和手工去核挑选排出 PB1 的卵母细胞置于 H-CZB 液滴中 将排出 PB1 的卵母细胞移入 Pronase(5mg/ml) 消化部分透明带 ( 要保证消化后极体还存在 ), 注意控制消化时间 (20 个 / 次 ) 快速将透明带部分消化的卵母细胞移入体外操作液 CB(5μg/ml)+ H-CZB 液滴中, 用胚胎分割刀沿 PB1 方向将卵母细胞 1/3 切除, 卵胞质移入 H-CZB 液滴待用 将切割后的卵胞质移入 Hoechst33342/33258(5μg/ml) 染色 5-10min, 在 UV 光下观察记录去核率 ( 可以省略 ) 粘合和融合手工去核卵胞质移入 PHA (10μg/ml) + H-CZB 粘合液滴中,37,2min

6 移入 H-CZB 体细胞 ( 卵丘细胞 ) 液滴中, 拨动卵胞质使其与体细胞粘贴, 形成卵母细胞 - 体细胞 复合体, 再将复合体转入 H-CZB 液滴中, 等待融合 卵母细胞 - 体细胞复合体和另一半卵胞质移入融合液 ( 无 Ca) 中平衡 2min(10 个 / 批 ) 迅速将复合体和另一半卵胞质移置融合槽的北面和南面, 交流电 5v/mm,3μs 对复合体进行排 队 (10 个 / 批 ), 接触面平行于两电极间, 同时将另一半胞质与复合体粘贴构成 三明治 形状 ( 当心拨掉体细胞 ), 最后, 施加直流电脉冲 (92V/mm, 70us, 2 次 ), 静置 1min 将复合体快速移入 KSOM 液滴中洗涤几遍, 并培养 1-3h( 促进体细胞核重编程 ), 检查融合情况 化学激活 将培养 1-3h 成功融合的重构胚移入激活液 [Ca 2+ -free CZB+ SrCL2(10 m M/L)+CB(5μg/ml)] 培养 6h( 开始记录培养的日期 )

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