中 国 修 复 重 建 外 科 杂 志 01 年 月 第 6 卷 第 期 153 胞 移 植 为 基 础 的 心 肌 再 生 性 治 疗 是 修 复 受 损 心 肌 的 理 想 策 略 然 而 既 往 研 究 显 示, 成 体 干 细 胞 取 材 及 增 殖 困 难 且 干 细 胞 含 量 低, 使

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1 15 Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, February 01, Vol. 6, No. 人 羊 水 来 源 c-kit + 间 充 质 干 细 胞 的 生 物 学 特 征 和 心 肌 诱 导 分 化 白 静 1 王 一 茹 刘 丽 凤 陈 杰 王 禹 摘 要 目 的 探 讨 人 羊 水 来 源 c-kit + 间 充 质 干 细 胞 (c-kit + human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells,c-kit + HAFMSCs) 的 生 物 学 特 征 及 心 肌 诱 导 分 化 能 力 方 法 通 过 产 前 诊 断 或 自 愿 引 产 获 取 50 份 孕 中 期 羊 水 标 本, 经 流 式 细 胞 仪 分 选 c-kit + HAFMSCs,MTT 法 观 察 细 胞 增 殖 情 况, 并 通 过 流 式 细 胞 仪 细 胞 免 疫 化 学 染 色 观 察 行 细 胞 表 型 鉴 定 在 体 外 经 成 骨 及 成 脂 诱 导 分 化, 于 诱 导 培 养 后 1 d 采 用 von Kossa 染 色 观 察 钙 沉 积 颗 粒, 油 红 O 染 色 观 察 脂 滴 形 成 情 况 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 细 胞 经 5 氮 - 脱 氧 胞 苷 心 肌 诱 导 前 后,NKx.5 Tbx5 GATA-4 α-mhc 4 种 心 肌 特 异 性 基 因 表 达 情 况 结 果 经 流 式 细 胞 仪 分 选, 人 孕 中 期 羊 水 中 c-kit + HAFMSCs 含 量 约 为 贴 壁 细 胞 的 3.07% ± 1.03%; 体 外 增 殖 迅 速, 表 达 MSCs 表 面 标 志 CD9 CD44 CD73 CD90 CD105, 不 表 达 造 血 干 细 胞 表 面 标 志 CD34 CD45; 表 达 人 类 白 细 胞 抗 原 (human leukocyte antigen,hla)-abc, 不 表 达 HLA-DR 细 胞 免 疫 化 学 染 色 示 CD9 CD44 CD73 CD90 CD105 Oct-4 染 色 呈 阳 性,CD34 CD45 染 色 呈 阴 性 MTT 检 测 示 第 代 c-kit + HAFMSCs 具 有 相 似 的 生 长 曲 线 成 骨 和 成 脂 诱 导 培 养 后 1 d, 细 胞 内 有 钙 盐 沉 积 和 脂 滴 形 成 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 示, 心 肌 诱 导 后 14 d,nkx.5 Tbx5 GATA-4 α-mhc 4 种 心 肌 特 异 性 基 因 表 达 均 较 诱 导 前 明 显 增 加, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P < 0.05) 结 论 通 过 流 式 细 胞 仪 分 选 的 c-kit + HAFMSCs 在 体 外 可 以 诱 导 分 化 为 心 肌 样 细 胞, 可 能 成 为 心 肌 再 生 性 治 疗 的 种 子 细 胞 关 键 词 人 羊 水 来 源 c-kit + 间 充 质 干 细 胞 心 肌 细 胞 分 化 心 肌 再 生 性 治 疗 生 物 学 特 征 BIOCHARACTERISTICS OF c-kit + HUMAN AMNIOTIC FLUID-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS AND THEIR DIFFERENTIATION INTO CARDIOMYOCYTES IN VITRO/BAI Jing 1, WANG Yiru, LIU Lifeng, CHEN Jie, WANG Yu. 1 Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of General Hospital of Chinese PLA, Beijing, , P.R.China; Institute of Geriatric Cardiology, General Hospital of Chinese PLA. Corresponding author: WANG Yu, wangyuheart@yahoo.com.cn Abstract Objective To investigate the biocharacteristics of c-kit + human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells (HAFMSCs) and its capacity to differentiate into cardiomyocytes in vitro. Methods Fifty samples of human amniotic fluid were obtained from amniocenteses or voluntary termination of pregnancy and were expanded in vitro. c-kit + HAFMSCs were sorted by flow cytometry and were recultured in the same media. c-kit + HAFMSCs were amplified and identified, then exposed to osteogenic, adi pogenic, and myogenic media. The flow cytometry, and immunocytochemistry were used for identifying the cell phenotype, von Kossa staining for osteogenic differentiation, oil red O staining for adi pogenic differentiation, and real-time fluorescent quantitative PCR for the expressions of NKx.5, Tbx5, GATA-4, and α-mhc genes. Results After the selection procedure, the percentage of c-kit + HAFMSCs was 3.07% ± 1.03% of the total adherent cells. The cells expressed MSCs markers (CD9, CD44, CD73, CD90, CD105), and did not express hematopoietic stem cells markers (CD34, CD45). The cells were positive for human leukocyte antigen (HLA)-ABC, and negative for HLA-DR. They also expressed Oct-4, which characterized the undifferentiated stem cell state. The growth curves of c-kit + HAMFSCs at passages 5, 10, and 15 were similar. Li pid droplet was observed by oil red O staining and calcium deposition by von Kossa staining in the cells at 1 days after adi pogenic and osteogenic induction. The myocardium special gene expressions of Tbx5, Nkx.5, GATA-4, and α-mhc were significantly stronger after myogenic induction than those before myogenic induction (P < 0.05). Conclusion Selected c-kit + HAFMSCs by flow cytometry is a group of pure MSCs, which has potential to differentiate into cardiomyocytes and can be used as seeding cells for myocardium regeneration treatment. Key words c-kit + human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells Cardiomyocyte differentiation Myocardium regeneration treatment Biocharacteristic 作 者 单 位 :1 解 放 军 总 医 院 第 一 附 属 医 院 心 血 管 内 科 ( 北 京, ); 解 放 军 总 医 院 老 年 心 血 管 病 研 究 所 通 讯 作 者 : 王 禹, 教 授, 硕 士 生 导 师, 研 究 方 向 : 冠 心 病, wangyuheart@yahoo.com.cn 网 络 出 版 时 间 : :; 网 络 出 版 地 址 : net/kcms/detail/ r _003.html 缺 血 性 心 脏 病 已 经 成 为 老 年 人 最 主 要 致 死 性 疾 病 [1-3] 之 一 研 究 显 示, 心 肌 细 胞 的 再 生 能 力 极 其 有 限, 大 面 积 心 肌 梗 死 后 伴 随 大 量 心 肌 细 胞 坏 死, 经 药 物 治 疗 介 入 治 疗 以 及 各 种 器 械 辅 助 治 疗 后 仍 不 可 避 免 发 生 心 衰 心 衰 是 缺 血 性 心 脏 病 最 主 要 死 亡 原 因 以 细

2 中 国 修 复 重 建 外 科 杂 志 01 年 月 第 6 卷 第 期 153 胞 移 植 为 基 础 的 心 肌 再 生 性 治 疗 是 修 复 受 损 心 肌 的 理 想 策 略 然 而 既 往 研 究 显 示, 成 体 干 细 胞 取 材 及 增 殖 困 难 且 干 细 胞 含 量 低, 使 得 自 体 细 胞 移 植 不 能 满 足 急 [] 性 心 肌 梗 死 的 最 佳 移 植 时 间 窗 胚 胎 干 细 胞 虽 然 具 有 良 好 的 增 殖 能 力 和 多 向 分 化 潜 能, 但 存 在 畸 胎 瘤 风 险 以 及 有 伦 理 学 争 议 哪 一 种 干 细 胞 更 适 合 心 肌 移 植 是 心 肌 再 生 性 治 疗 的 焦 点 近 来 研 究 发 现 羊 水 中 富 含 MSCs, 通 过 常 规 羊 膜 腔 穿 刺 术 获 取 少 量 羊 水, 极 少 伤 及 母 体 和 胎 儿, 取 材 简 便, 无 伦 理 学 争 议 本 研 究 通 过 流 式 细 胞 仪 分 选, 获 得 纯 化 的 人 羊 水 来 源 c-kit + 间 充 质 干 细 胞 (c-kit + human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells,c-kit + HAFMSCs), 探 讨 其 生 物 学 特 征 及 心 肌 分 化 能 力, 以 期 为 心 肌 再 生 性 治 疗 提 供 新 型 种 子 细 胞 1 材 料 与 方 法 1.1 主 要 材 料 及 试 剂 仪 器 通 过 产 前 诊 断 或 自 愿 引 产 获 取 50 份 孕 中 期 (16 ~ 8 周 ) 羊 水 标 本, 每 份 0 ml, 孕 妇 及 家 属 均 知 情 同 意, 并 获 解 放 军 总 医 院 第 一 附 属 医 院 医 学 伦 理 委 员 会 批 准 α-mem 培 养 基 青 霉 素 链 霉 素 马 血 清 (GIBCO 公 司, 美 国 );FBS(HyClone 公 司, 美 国 );Chang 培 养 基 ( Irvine Scientific 公 司, 美 国 );5 氮 - 脱 氧 胞 苷 成 脂 细 胞 诱 导 液 成 骨 细 胞 诱 导 液 (Sigma 公 司, 美 国 );Matrigel 胶 PE-CD44 PE-CD73 PE-CD90 PE- CD105 PE-CD9 FITC-CD34 FITC-CD45 FITC- 人 类 白 细 胞 抗 原 (human leukocyte antigen,hla)-abc FITC-HLA-DR Oct-4 抗 体 ( BD 公 司, 美 国 );RNA 提 取 试 剂 Trizol(Invitrogen 公 司, 美 国 ); 逆 转 录 试 剂 盒 实 时 荧 光 定 量 PCR 试 剂 盒 (Takara 公 司, 日 本 ) Cytomics FC 500 MPL 流 式 细 胞 仪 (Bechman Coulter 公 司, 美 国 );Fluoview fv1000 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 IX51 倒 置 相 差 显 微 镜 (Olympus 公 司, 日 本 ); 实 时 荧 光 定 量 PCR 仪 ( Applied Biosystems 公 司, 美 国 ); 全 自 动 定 量 绘 图 酶 标 仪 (Bio-Rad 公 司, 美 国 ); 离 心 机 (KuBota 公 司, 日 本 ) 1. c-kit + HAFMSCs 体 外 分 离 及 培 养 超 声 引 导 下, 行 羊 膜 腔 穿 刺 术 抽 取 无 菌 羊 水 0 ml 50 份 羊 水 标 本 经 4 冰 箱 运 送 至 实 验 室, h 内 室 温 下 以 离 心 半 径 13.5 cm r/min 离 心 5 min 弃 上 清, 将 沉 淀 用 α-mem 培 养 基 重 悬 后 加 入 0%FBS 18% Chang 培 养 基 B % Chang 培 养 基 C 1% 青 链 霉 素 及 1% 谷 氨 酰 胺 接 种 至 5 cm 培 养 瓶 中, 37 5%CO 及 饱 和 湿 度 孵 箱 内 培 养 每 3 ~ 4 天 换 液 1 次, 待 细 胞 贴 壁 80% 融 合 后 以 0.5% 胰 蛋 白 酶 和 1 mmol/l EDTA 消 化 传 代 倒 置 相 差 显 微 镜 观 察 原 代 及 传 代 细 胞 形 态 取 第 4 代 羊 水 贴 壁 细 胞, 弃 培 养 基,PBS 清 洗 次, 0.15% 胰 蛋 白 酶 消 化, 血 清 终 止 消 化 后 PBS 洗 涤 重 悬, 调 整 细 胞 浓 度 为 个 /ml 取 1 ml 单 细 胞 悬 液 装 入 离 心 管, 共 8 管, 每 管 加 入 0 μl 鼠 抗 人 单 克 隆 抗 体 CD117(c-kit), 充 分 混 匀, 避 光 室 温 孵 育 30 min, PBS 清 洗 次, 同 上 法 离 心 5 min, 重 新 制 成 细 胞 悬 液 0.5 ml, 流 式 细 胞 仪 分 选 将 c-kit + HAFMSCs 接 种 至 培 养 皿, 同 上 法 贴 壁 培 养 并 传 代 1.3 检 测 指 标 MTT 法 检 测 细 胞 增 殖 分 别 取 第 代 c-kit + HAFMSCs, 调 整 细 胞 悬 液 浓 度 为 个 /ml, 加 入 96 孔 板 中, 每 孔 100 µl 设 无 细 胞 的 对 照 组, 每 组 各 设 4 复 孔 37 5%CO 及 饱 和 湿 度 孵 箱 培 养, 至 细 胞 单 层 铺 满 孔 底 每 孔 加 入 0 µl MTT 溶 液 继 续 培 养 3 ~ 4 h 在 酶 联 免 疫 检 测 仪 490 nm 波 长 处 测 量 各 孔 吸 光 度 (A) 值 每 天 取 3 孔 检 测, 取 平 均 值, 连 续 观 察 8 d, 绘 制 生 长 曲 线 1.3. 流 式 细 胞 仪 检 测 取 第 4 代 c-kit + HAFMSCs, 弃 培 养 基,PBS 洗 涤 次,0.15% 胰 蛋 白 酶 消 化, 血 清 终 止 消 化 后 PBS 洗 涤 重 悬, 调 整 细 胞 浓 度 为 个 /ml 取 1 ml 单 细 胞 悬 液 装 入 离 心 管, 共 9 管, 分 别 加 入 鼠 抗 人 单 克 隆 抗 体 PE-CD9 PE-CD44 PE-CD73 PE-CD90 PE-CD105 FITC-CD45 FITC- CD34 FITC-HLA-DR FITI-HLA-ABC 各 0 μl, 充 分 混 匀, 避 光 室 温 孵 育 30 min,pbs 洗 涤 次, 同 上 法 离 心 5 min, 重 新 制 成 细 胞 悬 液 0.5 ml, 流 式 细 胞 仪 检 测 免 疫 细 胞 化 学 染 色 观 察 取 第 4 ~ 6 代 c-kit + HAFMSCs,4% 多 聚 甲 醛 室 温 固 定 30 min, 分 别 滴 加 鼠 抗 人 单 克 隆 抗 体 Oct-4 PE-CD9 PE-CD44 PE- CD73 PE-CD90 PE-CD105 FITC-CD34 FITC-CD45, 同 时 以 滴 加 PBS 作 为 阴 性 对 照,4 过 夜, 滴 加 兔 抗 鼠 二 抗, 室 温 孵 育 0 min, 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 下 观 察 成 脂 诱 导 分 化 取 第 5 代 c-kit + HAFMSCs, 以 个 /cm 密 度 接 种 于 培 养 皿, 以 含 15%FBS 1% 青 链 霉 素 1 μmol/l 地 塞 米 松 1 μmol/l 3- 异 丁 基 -1- 甲 基 黄 嘌 呤 10 mg/ml 胰 岛 素 60 μmol/l 吲 哚 美 辛 的 L-DMEM 培 养 基 诱 导 培 养 1 d, 油 红 O 染 色 观 察 脂 滴 形 成 情 况 成 骨 诱 导 分 化 取 第 5 代 c-kit + HAFMSCs, 以 个 /cm 密 度 接 种 于 培 养 皿, 以 含 10%FBS 1% 青 链 霉 素 100 nmol/l 地 塞 米 松 10 μmol/l β 甘 油 磷 酸 盐 0.05 μmol/l 抗 坏 血 酸 - 磷 酸 盐 的 L-DMEM 培

3 154 Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, February 01, Vol. 6, No. 养 基 诱 导 培 养 1 d,von Kossa 染 色 观 察 深 棕 褐 色 钙 沉 积 颗 粒 心 肌 样 细 胞 体 外 诱 导 分 化 及 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 取 第 6 代 c-kit + HAFMSCs, 以 个 /cm 密 度 接 种 至 预 先 用 1% Matrigel 胶 铺 过 的 塑 料 培 养 皿 上, 用 含 10% 马 血 清 0.5% 鸡 胚 提 取 物 1% 青 链 霉 素 的 L-DMEM 培 养 基 培 养 1 h 后, 加 入 3 μmol/l 5 氮 - 脱 氧 胞 苷 继 续 培 养 4 h 再 以 去 除 5 氮 - 脱 氧 胞 苷 的 培 养 液 培 养, 每 3 天 换 液 1 次 于 诱 导 培 养 后 14 d, 采 用 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 诱 导 后 心 肌 细 胞 特 异 性 基 因 Tbx5 Nkx.5 GATA-4 及 α-mhc 表 达, 内 参 为 β-actin 引 物 序 列 退 火 温 度 见 表 1, 引 物 由 Invitrogen 公 司 合 成 1.4 统 计 学 方 法 采 用 SPSS13.0 统 计 软 件 进 行 分 析 数 据 以 均 数 ± 标 准 差 表 示, 组 间 比 较 采 用 独 立 样 本 t 检 验 ; 检 验 水 准 α=0.05 结 果.1 HAFMSCs 形 态 变 化 及 生 长 特 性 50 份 孕 中 期 羊 水 标 本 有 11 份 羊 水 细 胞 表 达 c-kit +, 分 选 的 细 胞 均 成 功 培 养 并 传 代 ;c-kit + HAFMSCs 的 分 离 效 率 为 % 最 初 从 羊 水 中 分 离 得 到 的 细 胞 在 培 养 皿 中 呈 悬 浮 状 态, 为 圆 形 多 角 形 或 不 规 则 形 ( 图 1 a) 原 代 培 养 3 ~ 7 d 后 均 有 细 胞 贴 壁, 早 期 贴 壁 细 胞 形 态 主 要 为 类 上 皮 样 梭 形 或 三 角 形 ( 图 1 b); 传 代 培 养 后 细 胞 形 态 逐 渐 均 一, 多 为 成 纤 维 样, 少 数 细 胞 为 上 皮 样, 成 簇 生 长 ( 图 1 c) 第 4 代 经 流 式 细 胞 仪 分 选 的 c-kit + HAFMSCs 呈 均 匀 的 成 纤 维 样, 排 列 有 序 ( 图 1 d) 经 流 式 细 胞 仪 分 选,c-kit + HAFMSCs 约 占 羊 水 贴 壁 细 胞 的 3.07% ± 1.03% c-kit + HAFMSCs 在 体 外 培 养 可 以 传 至 50 代 以 上, 且 未 发 现 自 分 化 现 象. MTT 法 检 测 细 胞 增 殖 第 代 c-kit + HAFMSCs 均 增 殖 迅 速, 具 有 相 似 的 生 长 曲 线 ( 图 ).3 流 式 细 胞 仪 检 测 c-kit + HAFMSCs 表 达 MSCs 表 面 标 志 CD9 (99.90%) CD44(99.96%) CD73(97.0%) CD90 (99.90%) CD105(99.97%), 不 表 达 造 血 干 细 胞 表 面 标 志 CD34(0.05%) CD45(0.11%); 表 达 HLA-ABC (96.41%), 不 表 达 HLA-DR(0) 见 图 3.4 免 疫 细 胞 化 学 染 色 观 察 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 示,CD9 CD44 CD73 CD90 CD105 细 胞 表 面 荧 光 染 色 呈 阳 性,Oct-4 细 胞 核 荧 光 染 色 呈 阳 性 ( 图 4),CD34 CD45 染 色 呈 阴 性.5 成 骨 诱 导 分 化 及 成 脂 诱 导 分 化 成 骨 诱 导 1 d,von Kossa 染 色 可 见 深 褐 色 钙 沉 积 颗 粒 ( 图 5 a); 成 脂 诱 导 1 d, 油 红 O 染 色 示 细 胞 内 可 基 因 Gene β-actin Tbx5 Nkx.5 GATA-4 α-mhc 表 1 实 时 荧 光 定 量 PCR 引 物 序 列 及 产 物 长 度 Tab.1 The primers for real-time fluorescent quantitative PCR and product size 引 物 序 列 退 火 温 度 ( ) 产 物 长 度 (bp) Primer sequence Annealing temperature( ) Size(bp) 上 游 5'-TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3' 下 游 5'-GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC-3' 上 游 5'-ATTGCTGAAACCGAGAATGG-3' 下 游 5'-GCGCTCCTTGAGGTTGAAAAG-3' 上 游 5'-AGCACTTCTCCGCTCACTTC-3' 60 3 下 游 5'-CCGTGCACAGAGTGGTACTG-3' 上 游 5'-TCCCTCTTCCCTCCTCAAATTC-3' 下 游 5'-TCAGCGTGTAAAGGCATCTG-3' 上 游 5'-ATTGCTGAAACCGAGAATGG-3' 下 游 5'-GCGCTCCTTGAGGTTGAAAAG-3'

4 中 国 修 复 重 建 外 科 杂 志 01 年 月 第 6 卷 第 期 155 见 脂 滴 形 成 ( 图 5 b).6 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 c-kit + HAFMSCs 经 心 肌 细 胞 诱 导 后, 未 在 形 态 上 观 察 到 类 似 心 肌 样 细 胞 改 变, 也 未 见 有 搏 动 的 自 律 性 细 胞, 但 Tbx5 Nkx.5 GATA-4 及 α-mhc 4 种 心 肌 特 异 性 基 因 表 达 量 均 较 诱 导 前 明 显 增 加, 差 异 有 统 计 学 意 义 ( P < 0.05) 见 表 表 c-kit + HAFMSCs 经 心 肌 细 胞 诱 导 前 后 相 关 基 因 表 达 (n=5,x ± s) Tab. The myocardium special gene expression of c-kit + HAFMSCs before and after myogenic induction(n=5,x ± s) 组 别 Group Tbx5 Nkx.5 GATA-4 α-mhc 诱 导 前 Before 1.73 ± ± ± ± 0.63 induction 诱 导 后 After.358 ± ± ± ± 0.38 induction 统 计 值 Statistic t=4.498 P=0.011 t=10.08 P= t= P= t=4.187 P= 讨 论 大 面 积 心 肌 梗 死 后, 心 肌 再 生 能 力 不 足, 造 成 心 [4-5] 衰 心 衰 已 成 为 全 球 最 主 要 致 死 性 疾 病 之 一 研 究 者 们 试 图 寻 找 一 种 适 合 心 肌 再 生 性 治 疗 的 种 子 细 胞 [6] 003 年 Prusa 等 首 先 发 现 孕 中 期 羊 水 中 含 Oct-4 表 达 阳 性 的 细 胞, 提 示 羊 水 中 存 在 多 能 干 细 胞 后 来 一 系 列 研 究 均 证 实 人 羊 水 中 Oct-4 阳 性 细 胞 具 有 向 成 骨 细 胞 脂 肪 细 胞 成 肌 细 胞 内 皮 细 胞 神 经 [7-9] 细 胞 以 及 肝 脏 细 胞 分 化 的 潜 能 HAFMSCs 的 研 究 为 再 生 性 治 疗 领 域 开 辟 了 极 大 的 应 用 前 景 然 而, HAFMSCs 是 一 组 复 杂 的 细 胞 群 体 羊 水 中 的 细 胞 来 [10] 源 于 胎 儿 脱 落 的 各 种 组 织 细 胞 以 及 部 分 羊 膜 组 织 [11] Da Sacco 等 认 为 羊 水 中 除 了 多 能 干 细 胞 外, 还 可 能 存 在 多 种 器 官 的 祖 细 胞, 并 从 羊 水 c-kit + 细 胞 中 成 功 分 离 并 鉴 定 了 肾 脏 祖 细 胞 但 目 前 罕 见 从 羊 水 中 成 功 分 离 并 鉴 定 心 脏 祖 细 胞 的 报 道 007 年 De Coppi [8] 等 首 先 采 用 免 疫 磁 珠 法 从 羊 水 中 分 离 得 到 c-kit + HAFMSCs, 并 且 发 现 这 种 细 胞 同 时 表 达 MSCs 及 胚 胎 干 细 胞 标 记,90% 细 胞 Oct-4 表 达 呈 阳 性 提 示 c-kit + HAFMSCs 可 能 较 所 有 成 体 干 细 胞 更 原 始, 部 分 学 者 认 [1-13] 为 其 处 于 胚 胎 干 细 胞 和 成 体 干 细 胞 的 中 间 阶 段 c-kit 是 一 种 受 体 蛋 白, 它 在 配 子 发 生 黑 素 形 成 以 [14] 及 造 血 中 扮 演 重 要 角 色 c-kit 通 常 在 胚 胎 干 细 胞 及 [1,15] 原 始 生 殖 细 胞 中 表 达, 一 些 研 究 已 经 显 示 出 c- kit + [11,15-19] 干 细 胞 的 临 床 应 用 潜 力 本 研 究 通 过 流 式 细 胞 仪 分 选,50 份 孕 中 期 羊 水 标 本 中 11 份 羊 水 细 胞 表 达 c-kit +, 分 选 的 细 胞 均 成 功 培 养 并 传 代 ;c- kit + HAFMSCs 分 离 效 率 为 % 本 研 究 中 c- kit + HAFMSCs 约 占 羊 [8] 水 贴 壁 细 胞 的 3.07% ± 1.03%, 与 De Coppi 等 报 道 相 似 提 示 流 式 细 胞 仪 是 一 种 简 便 快 速 且 分 离 效 率 较 高 的 c- kit + HAFMSCs 分 选 方 法 本 研 究 通 过 细 胞 贴 壁 培 养,c-kit + HAFMSCs 可 图 1 HAFMSCs 形 态 学 观 察 a 新 分 离 获 得 的 羊 水 细 胞 ( 倒 置 相 差 显 微 镜 00) b 原 代 培 养 3 ~ 7 d ( 倒 置 相 差 显 微 镜 100) c 第 5 代 HAFMSCs( 倒 置 相 差 显 微 镜 100) 1d c-kit + HAFMSCs ( 倒 置 相 差 显 微 镜 100) 图 第 代 c-kit + HAFMSCs 生 长 曲 线 Fig.1 Morphological characteristics of HAFMSCs a Isolated amniotic fluid cells (Inverted phase contrast microscope 00) b Primary HAFMSCs after being cultured for 3-7 days (Inverted phase contrast microscope 100) c The 5th passage HAFMSCs (Inverted phase contrast microscope 100) 1d c-kit + HAFMSCs (Inverted phase contrast microscope 100) Fig. The growth curves of c-kit + HAFMSCs at passages 5, 10, and 15

5 156 Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, February 01, Vol. 6, No. 图 3 流 式 细 胞 仪 检 测 c-kit + HAFMSCs 表 面 标 志 表 达 a CD9 (99.90%) b CD44 (99.96%) c CD73 (97.0%) 1d CD90 (99.90%) e CD105 (99.97%) f CD34(0.05%) g CD45 (0.11%) h HLA-ABC (96.41%) i HLA-DR(0) 图 4 免 疫 细 胞 化 学 染 色 观 察 a CD9 阳 性 ( 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 00) b CD44 阳 性 ( 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 00) c CD73 阳 性 ( 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 00) 1d CD90 阳 性 ( 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 00) e CD105 阳 性 ( 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 00) f Oct-4 阳 性, 蓝 色 为 细 胞 核 染 色, 绿 色 为 Oct-4 染 色 ( 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 1 000) 图 5 c-kit + HAFMSCs 多 向 分 化 能 力 检 测 a 成 骨 诱 导 1 d(von Kossa 染 色 00) b 成 脂 诱 导 1 d( 油 红 O 染 色 00) Fig.3 Flow cytometry analyses of c-kit + HAFMSCs markers a CD9 (99.90%) b CD44 (99.96%) c CD73 (97.0%) 1d CD90 (99.90%) e CD105 (99.97%) f CD34 (0.05%) g CD45 (0.11%) h HLA-ABC (96.41%) i HLA-DR (0) Fig.4 Immunocytochemical staining of c-kit + HAFMSCs markers a CD9 + (Laser scanning confocal microscope 00) b CD44 + (Laser scanning confocal microscope 00) c CD73 + (Laser scanning confocal microscope 00) 1d CD90 + (Laser scanning confocal microscope 00) e CD105 + (Laser scanning confocal microscope 00) f Oct-4 +, nucleus was stained blue and Oct-4 was stained green (Laser scanning confocal microscope 1 000) Fig.5 Adipogenic and osteogenic differentiations of c-kit + HAFMSCs a Osteogenic induced for 1 days (von Kossa staining 00) b Adipogenic induced for 1 days (Oil red O staining 00) 以 在 塑 料 培 养 皿 生 长, 形 态 均 一, 为 成 纤 维 样 表 达 MSCs 表 面 标 志 CD9 CD44 CD73 CD90 CD105, 不 表 达 造 血 干 细 胞 表 面 标 志 CD34 CD45; 表 达 HLA-ABC, 不 表 达 HLA-DR 细 胞 核 Oct-4 表 达 呈 阳 性 本 研 究 中 c-kit + HAFMSCs 可 以 向 成 脂 成 骨 细 胞 分 化, 提 示 c-kit + HAFMSCs 是 MSCs 的 一 类 亚 型, 具 有 间 充 质 细 胞 分 化 能 力 ; 其 生 长 曲 线 未 见 平 台 期, 第 代 细 胞 均 具 有 相 似 的 生 长 曲 线 本 研 究 组 培 养

6 中 国 修 复 重 建 外 科 杂 志 01 年 月 第 6 卷 第 期 157 的 1 株 c-kit + HAFMSCs 已 经 传 至 50 代, 细 胞 形 态 一 致, 未 发 现 自 分 化 现 象 国 外 学 者 对 c-kit + HAFMSCs 的 端 粒 长 度 进 行 测 定, 结 果 显 示 传 至 0 ~ 50 代 的 细 胞 端 粒 长 度 基 本 一 致, 且 对 第 50 代 细 胞 进 行 核 型 分 [8] 析, 显 示 其 核 型 稳 定 这 些 研 究 提 示 c-kit + HAFMSCs 具 有 极 强 的 自 我 更 新 能 力, 并 且 能 够 稳 定 维 持 未 分 化 状 态 本 研 究 通 过 5 氮 - 脱 氧 胞 苷 体 外 诱 导 c-kit + HAFMSCs 向 心 肌 细 胞 分 化, 虽 然 未 在 细 胞 形 态 学 上 观 察 到 类 似 心 肌 样 细 胞 的 改 变, 也 未 见 有 搏 动 的 自 律 性 细 胞 出 现, 但 是 经 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 发 现 诱 导 后 Tbx5 Nkx.5 GATA-4 及 α-mhc 4 种 心 肌 细 胞 特 [0] 异 性 基 因 表 达 均 增 加 Yeh 等 通 过 与 乳 鼠 心 肌 细 胞 共 培 养 诱 导 HAFMSCs 分 化, 采 用 人 特 异 性 线 粒 体 抗 原 作 为 HAFMSCs 的 示 踪 标 记, 荧 光 免 疫 检 测 显 示 α-actin 和 c-tnt 出 现 在 荧 光 阳 性 细 胞 中, 表 明 共 培 养 的 HAFMSCs 分 化 为 心 肌 样 细 胞 上 述 不 同 的 诱 导 方 式 均 提 示 c-kit + HAFMSCs 具 备 部 分 向 心 肌 样 细 胞 分 化 的 能 力 综 上 述,c-kit + HAFMSCs 具 有 良 好 的 生 物 学 特 征, 无 自 分 化 现 象 ; 流 式 细 胞 仪 是 一 种 简 便 快 速 的 分 选 方 法 ;c-kit + HAFMSCs 体 外 诱 导 培 养 具 有 向 心 肌 样 细 胞 分 化 的 潜 能, 可 能 成 为 心 肌 再 生 性 治 疗 的 种 子 细 胞 然 而, 其 临 床 应 用 还 需 更 深 入 研 究 4 参 考 文 献 1 Jeremy L, Herrmann, Aaron M, et al. Cell-based therapy for ischemic heart disease: a clinical update. Ann Thorac Surg, 009, 88(5): Beltrami AP, Urbanek K, Kajstura J, et al. Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction. N Eng J Med, 001, 344(3): Kajstura J, Ubannek K, Perl S, et al. Cardiomyogenesis in the adult human heart. Circ Res, 010, 107(): Lloyd-Jones D, Adams RJ, Brown TM, et al. Executive summary: heart disease and stroke statistics 010 update: a report from the American Heart Association. Circulation, 010, 11(7): 顾 东 风, 黄 广 勇, 河 江, 等. 中 国 心 力 衰 竭 流 行 病 学 调 查 及 其 患 病 率. 中 华 心 血 管 病 杂 志, 003, 31(1): Prusa AR, Marton E, Rosner M, et al. OCT-4 expressing cells in human amniotic fluid: a new source for stem cell research? Hum Reprod, 003, 18(7): Wolbank S, Stadler G, Peterbauer A, et al. Telomerase immortalized human amnion- and adi pose-derived mesenchymal stem cells: maintenance of differentiation and immunomodulatory characteristics. Tissue Eng Part A, 009, 15(7): De Coppi P, Bartsch G Ir, Siddiqui MM, et al. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotechnol, 007, 5(1): Cabral AL, Anqelo PC, Leite HV, et al. Isolation, differentiation and biochemical aspects of amniotic fluid stem cell. Rev Assoc Med Bras, 008, 54(6): Prusa AR, Hengstschlager M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit, 003, 8(11): RA Da Sacco S, Sedrakyan S, Boldrin F, et al. Human amniotic fluid as a potential new source of organ specific precursor cells for future regenerative medicine applications. J Urol, 010, 183(3): Kim J, Lee Y, Kim H, et al. Human amniotic fluid-derived stem cells have characteristics of multi potent stem cells. Cell Prolif, 007, 40(1): Delo DM, De Coppi P, Bartsch G Jr, et al. Amniotic fluid and placental stem cells. Methods Enzymol, 006, 419: Fleischman RA. From white spots to stem cells: the role of the Kit receptor in mammalian development. Trends Genet, 1993, 9(8): Perin L, Sedrakyan S, Giuliani S, et al. Protective effect of human amniotic fluid stem cells in an immunodeficient mouse model of acute tubular necrosis. PLoS One, 010, 5(): e Arnhold S, Glüer S, Hartmann K, et al. Amniotic-fluid stem cells: growth dynamics and differentiation potential after a CD-117-based selection procedure. Stem Cells Int, 011, 011: Phermthai T, Odglun Y, Julavijitphong S, et al. A novel method to derive amniotic fluid stem cells for therapeutic purposes. BMC Cell Biol, 010, 11: Hauser PV, De Fazio R, Bruno S, et al. Stem cells derived from human amniotic fluid contribute to acute kidney injury recovery. Am J Pathol, 011, 177(4): Sieqel N, Rosner M, Unbekandt M, et al. Contribution of human amniotic fluid stem cells to renal tissue formation depends on mtor. Hum Mol Genet, 010, 19(17): Yeh YH, Wei HJ, Lee WY, et al. Cellular cardiomyoplasty with human amniotic fluid stem cells: in vitro and in vivo studies. Tissue Eng Part A, 010, 16(6): ( 收 稿 : 修 回 : ) ( 本 文 编 辑 : 王 雁 )