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1 J South Med Univ, 204, 34(6): doi /j.issn 基 础 研 究 糖 尿 病 大 鼠 血 糖 波 动 模 型 的 建 立 吴 元 洁, 吴 元 波 2, 郑 书 国 3, 王 玉 凤, 刘 晓 丽, 张 晓 军, 吕 明 安 安 徽 中 医 药 大 学, 安 徽 合 肥 ; 2 安 徽 医 科 大 学 附 属 省 立 医 院, 安 徽 合 肥 23000; 3 皖 南 医 学 院, 安 徽 芜 湖 摘 要 : 目 的 探 讨 使 用 普 通 胰 岛 素 建 立 大 鼠 糖 尿 病 血 糖 波 动 模 型 方 法 雄 性 SD 大 鼠 随 机 分 成 正 常 组 和 模 型 组, 腹 腔 注 射 链 脲 佐 菌 素 建 立 糖 尿 病 模 型, 将 模 型 大 鼠 随 机 分 成 持 续 高 血 糖 组 和 波 动 血 糖 组, 血 糖 波 动 组 大 鼠 每 日 2 次 皮 下 注 射 普 通 胰 岛 素 或 灌 服 葡 萄 糖 诱 导 建 立 糖 尿 病 血 糖 波 动 模 型 观 察 大 鼠 一 般 情 况 体 质 量 一 日 5 次 血 糖 水 平 血 糖 日 平 均 水 平 (MBG) 日 平 均 血 糖 的 标 准 差 (SDBG) 最 大 血 糖 波 动 幅 度 (LAGE) 血 清 胰 岛 素 水 平 (FINS) 胰 腺 组 织 病 理 学 改 变 情 况 结 果 波 动 血 糖 组 和 持 续 高 血 糖 组 大 鼠 多 食 多 饮 多 尿 症 状 明 显 ; 大 鼠 体 质 量 在 不 同 时 间 的 差 别 有 统 计 学 意 义 (P<0.0), 组 间 体 质 量 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0.05) 血 糖 波 动 6 周 后, 持 续 高 血 糖 组 波 动 血 糖 组 大 鼠 血 糖 日 平 均 水 平 (MBG) 日 平 均 血 糖 的 标 准 差 (SDBG) 最 大 血 糖 波 动 幅 度 (LAGE) 明 显 高 于 正 常 组 (P<0.0), 血 清 胰 岛 素 水 平 低 于 正 常 组 (P<0.05); 波 动 血 糖 组 大 鼠 SDBG LAGE 明 显 高 于 持 续 高 血 糖 组 (P<0.0),MBG FINS 低 于 持 续 高 血 糖 组, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0.05); 成 模 的 糖 尿 病 大 鼠 胰 岛 萎 缩, 形 态 不 规 则, 分 布 较 为 稀 疏, 数 量 明 显 减 少, 其 中 以 波 动 血 糖 组 变 化 更 为 明 显 结 论 使 用 每 日 皮 下 注 射 2 次 普 通 胰 岛 素 或 灌 服 葡 萄 糖 的 方 法 能 成 功 制 作 出 糖 尿 病 大 鼠 血 糖 波 动 模 型 关 键 词 : 糖 尿 病 大 鼠 ; 血 糖 波 动 ; 动 物 模 型 ; 胰 岛 素 Experimental research on establishing a blood glucose fluctuation model in diabetic rats WU Yuanjie, WU Yuanbo 2, ZHENG Shuguo 3, WANG Yufeng, LIU Xiaoli, ZHANG Xiaojun, LÜ Mingan Anhui University of Chinese Medicine, Hefei , China; 2 Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University, Hefei 23000, China; 3 Wannan Medical College, Wuhu 24002, China Abstract: Objective To establish a blood glucose fluctuation model in diabetic rats. Methods Male SD rats were randomly divided into 2 groups, namely normal group and diabetes group. Rat model of diabetes was established by single intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) and then divided into sustained high blood glucose group and blood glucose fluctuation group. Rat model of blood glucose fluctuation was established by subcutaneous injection with regular insulin or gavaging of glucose twice daily in diabetic rats. The general condition, body weight, daily blood glucose levels of 5 different times, daily average blood glucose (MBG), standard deviation of daily average blood glucose (SDBG), the maximum amplitude of glycemic excursions (LAGE), fasting serum insulin (FINS) and pancreatic tissue pathology were observed. Results Rats in blood glucose fluctuation group and sustained high blood glucose group developed symptoms of polyphagia, polyuria and polydipsia. Though significant differences in body weight were observed at different time (P<0.0), no significant differences were found among the three groups (P>0.05). After 6 weeks of blood glucose fluctuation, MBG, SDBG and LAGE in blood glucose fluctuation group and sustained high blood glucose group were increased significantly than those in normal group (P<0.0), the level of FINS decreased markedly(p<0.05). SDBG and LAGE in blood glucose fluctuation group were higher than those in sustained high blood glucose group (P<0.0). Islet of diabetic rat became atrophy, irregular shape, sparse distribution, and decreased in number, and the changes were more obvious in blood glucose fluctuation group. Conclusion Rat model of blood glucose fluctuation can be successfully established by subcutaneous injection of regular insulin of gavage of glucose twice daily in diabetic rats. Key words: diabetic rats; blood glucose fluctuation; animal model; insulin 糖 尿 病 是 由 遗 传 和 环 境 因 素 相 互 作 用 而 引 起 的 一 组 代 谢 异 常 综 合 征 因 胰 岛 素 分 泌 胰 岛 素 作 用 或 两 者 同 时 存 在 缺 陷, 引 起 碳 水 化 合 物 蛋 白 质 脂 肪 水 和 电 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 (802626H276) Supported by National Natural Science Foundation of China (802626H276). 作 者 简 介 : 吴 元 洁, 硕 士, 副 教 授, 硕 士 研 究 生 导 师, anhuiwuyuanjie@26.com 解 质 等 的 代 谢 紊 乱, 临 床 以 慢 性 ( 长 期 ) 高 血 糖 为 主 要 共 同 特 征 近 年 研 究 表 明, 糖 尿 病 慢 性 并 发 症 的 发 生 与 发 展 不 仅 与 整 体 血 糖 水 平 增 高 有 关, 而 且 与 血 糖 波 动 密 切 相 [-2] 关, 血 糖 波 动 越 大, 慢 性 并 发 症 发 生 率 越 高 建 立 可 靠 稳 定 的 糖 尿 病 血 糖 波 动 动 物 模 型, 可 为 深 入 研 究 糖 尿 病 血 糖 波 动 发 病 机 制 及 临 床 治 疗 奠 定 基 础 国 外 文 献 关 于 糖 尿 病 波 动 血 糖 的 报 道 主 要 集 中 在 临 床 试 验 和 [3-4] 体 外 细 胞 试 验 方 面, 而 关 于 糖 尿 病 波 动 血 糖 模 型 的 报 [5-8] 道 甚 少 ; 国 内 文 献 报 道, 糖 尿 病 波 动 血 糖 模 型 的 建 立
2 772 J South Med Univ, 204, 34(6): 方 法 多 采 用 定 时 给 予 糖 尿 病 大 鼠 胰 岛 素 和 ( 或 ) 葡 萄 糖 进 行 诱 导 其 中, 胰 岛 素 葡 萄 糖 的 给 予 时 间 次 数 等 具 体 问 题 往 往 是 影 响 动 物 模 型 成 模 率 死 亡 率 的 重 要 因 素, 这 些 问 题 以 往 的 报 道 较 少 本 研 究 基 于 糖 尿 病 大 鼠 日 内 血 糖 波 动 特 点 及 大 鼠 血 糖 个 体 化 差 异 特 点, 每 日 择 时 给 予 糖 尿 病 大 鼠 2 次 胰 岛 素 或 葡 萄 糖, 建 立 日 中 血 糖 浓 度 大 幅 波 动 模 型 并 从 大 鼠 一 般 情 况 体 质 量 血 糖 血 清 胰 岛 素 水 平 胰 岛 组 织 病 理 学 改 变 等 方 面 进 行 了 综 合 评 价, 为 研 究 波 动 血 糖 对 糖 尿 病 的 影 响 提 供 一 定 的 实 验 依 据 材 料 与 方 法. 实 验 动 物 Sprague-Dawley 大 鼠 65 只, 雄 性, 体 质 量 80± 20 g 由 安 徽 省 实 验 动 物 中 心 提 供 ( 动 物 质 量 合 格 证 号 :scxk( 皖 )20-002) 实 验 过 程 中 对 动 物 处 置 符 合 动 物 伦 理 学 要 求.2 试 剂 与 仪 器 链 脲 佐 菌 素 购 自 美 国 Sigma 公 司 ; 柠 檬 酸 (FW: 20.4) 及 柠 檬 酸 钠 (FW:294.0)( 天 津 市 津 宏 化 工 有 限 公 司 生 产 ); 柠 檬 酸 2. g 加 入 00ml 双 蒸 水 中 配 成 A 液, 柠 檬 酸 钠 2.94 g 加 入 00 ml 双 蒸 水 中 配 成 B 液 STZ 必 需 4 保 存 及 新 鲜 配 制 ; 血 糖 仪 及 同 批 号 血 糖 试 纸 ( 德 国 贝 朗 公 司 ); 普 通 胰 岛 素 ( 江 苏 万 邦 生 化 医 药 );25Ⅰ 胰 岛 素 放 免 试 剂 盒 ( 中 国 原 子 能 科 学 研 究 院 同 位 素 研 究 所 ).3 糖 尿 病 大 鼠 模 型 的 建 立 方 法 大 鼠 自 由 饮 水, 在 温 度 为 22, 相 对 湿 度 为 50% 的 饲 养 环 境 中 适 应 性 喂 养 周 随 机 取 5 只 作 为 正 常 组 (C), 其 余 大 鼠 禁 食 2 h 后, 用 现 配 的 柠 檬 酸 缓 冲 液 (0. mmol/l, ph 4.4) 溶 解 STZ 后, 配 成 % 浓 度, 按 50 mg/kg STZ 腹 腔 注 射 诱 发 糖 尿 病 注 射 STZ72 h 取 大 鼠 尾 静 脉 血, 用 血 糖 仪 测 定 随 机 血 糖 值,( 最 大 血 糖 值 为 33.3 mmol/l, 更 高 的 血 糖 值 仪 器 显 示 为 High, 这 种 情 况 血 糖 值 被 当 作 为 33.3 mmol/l), 造 模 0 d 血 糖 稳 定 后, 随 机 血 糖 水 平 6.7 mmol/l 为 造 模 成 功 的 大 鼠 作 为 糖 尿 病 模 型 组.4 糖 尿 病 大 鼠 血 糖 波 动 模 型 的 建 立 方 法 65 只 大 鼠,5 只 作 为 正 常 对 照, 剩 余 50 只 接 受 了 STZ 造 模, 随 机 血 糖 水 平 6.7 mmol/l 最 为 造 模 成 功 的 标 准, 按 造 模 成 功 率 80%, 有 0 只 大 鼠 未 成 模 型 取 糖 尿 病 模 型 大 鼠 40 只, 随 机 选 取 7 只 检 测 d 内 点 6 00 点 8 00 点 点 血 糖 值 然 后 将 糖 尿 病 大 鼠 随 机 分 成 持 续 高 血 糖 组 (SHG) 波 动 血 糖 组 (IG), 每 组 各 20 只,IG 组 大 鼠 每 周 检 测 2 次 早 8 00 和 晚 上 8 00 的 血 糖 值, 根 据 大 鼠 这 两 时 间 点 血 糖 值 的 高 低, 每 日 于 早 8 00 和 晚 上 8 00 分 别 皮 下 注 射 -3U 普 通 胰 岛 素 ( 血 糖 值 6.7 mmol/l), 或 灌 胃 葡 萄 糖 2 g/kg 体 质 量 ( 血 糖 值 <6.7 mmol/l) C 组 和 SHG 组 大 鼠 以 相 同 给 药 方 式 给 予 同 体 积 生 理 盐 水 共 计 6 周 实 验 末 次 给 药 后 禁 食 2 h, 各 组 大 鼠 以 戊 巴 比 妥 钠 溶 液 腹 腔 麻 醉, 腹 主 动 脉 抽 血, 离 心 取 血 清 保 存.5 指 标 观 察 及 检 测 方 法.5. 一 般 情 况 观 察 观 察 各 组 大 鼠 精 神 状 态, 毛 色, 体 质 量, 进 食, 尿 量 等 每 周 测 量 体 质 量 次.5.2 糖 尿 病 大 鼠 日 血 糖 变 化 规 律 糖 尿 病 大 鼠 血 糖 波 动 模 型 建 立 前, 检 测 糖 尿 病 大 鼠 d 内 点 6 00 点 8 00 点 点 血 糖 值, 描 绘 血 糖 变 化 趋 势 曲 线.5.3 各 组 大 鼠 日 5 次 血 糖 水 平 及 量 化 血 糖 稳 定 性 指 标 检 测 每 周 次, 测 d 内 血 糖 水 平, 并 描 绘 血 糖 波 动 6 周 后 各 组 大 鼠 d 内 血 糖 变 化 趋 势 曲 线 用 血 糖 日 平 均 水 平 (MBG) 日 平 均 血 糖 的 标 准 差 (SDBG) 最 大 血 糖 波 动 幅 度 (LAGE, 日 内 血 糖 最 高 值 与 最 低 值 之 差 ) 量 化 各 组 血 糖 稳 定 性, 计 算 血 糖 波 动 6 周 后 各 组 大 鼠 MBG SDBG LAGE 值.5.4 空 腹 血 清 胰 岛 素 (FINS) 检 测 采 用 放 免 法.5.5 胰 腺 HE 检 测 试 验 结 束 后 将 大 鼠 处 死, 剖 腹, 取 出 胰 腺 组 织, 经 0% 中 性 甲 醛 液 固 定, 常 规 石 蜡 包 埋, 4 μm 切 片, 行 HE 染 色 光 镜 下 观 察 胰 腺 形 态 学 变 化.6 统 计 学 分 析 采 用 SPSS20.0 软 件 进 行 统 计 各 组 量 化 血 糖 稳 定 性 指 标 血 清 胰 岛 素 数 据 进 行 正 态 分 布 检 验, 符 合 正 态 分 布 用 单 因 素 多 水 平 设 计 定 量 资 料 的 方 差 分 析, 并 进 行 方 差 齐 性 分 析, 方 差 齐 用 LSD 检 验, 方 差 不 齐 用 Tamhane's T 2 检 验, 数 据 以 均 数 ± 标 准 差 表 示 ; 非 正 态 分 布 进 行 多 个 独 立 样 本 非 参 数 检 验, 数 据 以 中 位 数 (M) 与 四 分 位 间 距 (Q) 表 示 大 鼠 各 周 体 质 量 大 鼠 d 血 糖 变 化 用 重 复 测 量 设 计 定 量 资 料 的 方 差 分 析 各 种 检 验 的 显 著 性 水 平 设 定 为 P< 结 果 2. 一 般 情 况 造 模 后 SHG 组 IG 组 大 鼠 精 神 萎 靡, 行 动 迟 缓, 对 外 界 反 应 迟 钝, 毛 色 无 光 泽, 易 脏, 进 食 减 少, 饮 水 量 尿 量 增 加, 尿 液 腥 臊 味 加 重, 部 分 大 鼠 尿 路 感 染, 皮 肤 出 现 破 损 溃 疡 脓 肿, 其 中,IG 组 症 状 更 加 明 显, 部 分 大 鼠 出 现 白 内 障 表 现 波 动 6 周 后,C 组 大 鼠 死 亡 2 只,SHG 组 IG 组 大 鼠 各 死 亡 7 只 2.2 血 糖 波 动 前 后 不 同 时 间 各 组 大 鼠 体 质 量 变 化 ( 表 ) 重 复 测 量 两 因 素 的 方 差 分 析 检 验 结 果 显 示 :C 组 SHG 组 IG 组 大 鼠 组 间 体 质 量 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>
3 Blood glucose (mmol/l) Blood glucose (mmol/l) J South Med Univ, 204, 34(6): 表 血 糖 波 动 不 同 时 间 各 组 大 鼠 体 质 量 变 化 Tab. Influence of blood glucose fluctuation on body mass in rats (Mean±SD, g, n=3) Group 0 week 2 weeks 4 weeks 6 weeks Control ± ± ± ±52.03 SHG 26.77± ± ± ±72.25 IG ± ± ± ±34.5 SHG: Sustained high blood glucose group; IG: Blood glucose fluctuation group. 0.05); 而 各 组 大 鼠 在 不 同 时 间 之 间 的 体 质 量 差 别 有 统 计 学 意 义 (F=27.09,P<0.0) 表 可 看 出, 血 糖 波 动 造 模 开 始 时,IG 组 体 质 量 持 续 上 升,4 周 达 高 峰, 然 后 下 降 SHG 组 从 血 糖 波 动 造 模 开 始 时 间 至 2 周, 体 质 量 亦 持 续 上 升,2 周 至 4 周 体 质 量 变 化 较 平 缓,4 周 后 体 质 量 又 持 续 上 升 C 组 体 质 量 呈 持 续 增 加 2.3 血 糖 波 动 实 验 前 糖 尿 病 大 鼠 日 血 糖 变 化 ( 图 ) 血 糖 波 动 实 验 前 选 取 7 只 糖 尿 病 大 鼠, 检 测 日 血 糖 变 化,5 点 时 间 血 糖 均 数 变 化 趋 势 图 可 看 出 糖 尿 病 大 鼠 在 血 糖 处 于 较 高 水 平, 血 糖 在 8 00 后 呈 下 降 趋 势, 在 2 00 降 至 低 点, 然 后 呈 逐 步 上 升 趋 势, 日 内 血 糖 平 均 水 平 值 最 高 点 在 20 00, 血 糖 平 均 水 平 值 最 低 点 在 Time point 图 糖 尿 病 大 鼠 日 内 血 糖 特 征 Fig. Intraday variation of blood glucose in diabetic rats. 2.4 血 糖 波 动 6 周 后 各 组 大 鼠 日 5 点 时 间 血 糖 变 化 及 MBG SDBG LAGE( 图 2, 表 2) 图 2 可 看 出,IG 组 血 糖 在 8 00 较 高, 然 后 呈 下 降 趋 势 至 0 00 血 糖 降 至 最 低, 之 后 血 糖 持 续 上 升 至 8 00 达 高 峰, 然 后 下 降 在 日 内 形 成 2 个 明 显 的 血 糖 波 动 高 峰 和 低 谷 SHG 组 血 糖 变 化 趋 势 较 IG 组 相 对 平 缓, 在 8 00 最 高, 然 后 下 降, 至 0 00 血 糖 降 至 最 低, 之 后 持 续 呈 上 升 趋 势 至 达 最 高 C 组 日 内 血 糖 变 化 幅 度 最 小, 基 本 保 持 稳 定 低 值 单 因 素 多 水 平 方 差 分 析 显 示 : 与 C 组 比 较,SHG 组 IG 组 大 鼠 MBG SDBG LAGE 明 显 升 高, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0.0); 与 SHG 组 比 较,IG 组 大 鼠 SDBG LAGE 明 显 增 高,MBG 降 低, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0.0) Time point 图 2 血 糖 波 动 6 周 后 各 组 大 鼠 日 5 点 血 糖 变 化 趋 势 图 Fig.2 Intraday variation of blood glucose in diabetic rats after 6 weeks of blood glucose fluctration. 2.5 血 糖 波 动 6 周 后 各 组 大 鼠 FINS 含 量 ( 表 3) 经 多 个 独 立 样 本 比 较 的 Kruskal-Wallis H 检 验, 血 糖 波 动 6 周 后 C 组 SHG 组 IG 组 大 鼠 FINS 水 平 χ 2 = 4.673,P=0.00,3 组 大 鼠 FINS 水 平 总 体 分 布 存 在 显 著 性 差 异, 其 中 IG 组 大 鼠 FINS 水 平 最 低 ( 平 均 秩 4.5) SHG 组 IG 组 大 鼠 FINS 水 平 低 于 C 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0.05,P<0.0),IG 组 SHG 组 大 鼠 FINS 水 平 比 较, 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0.05) C SHG IG 表 2 血 糖 波 动 6 周 后 各 组 大 鼠 MBG SDBG LAGE 变 化 Tab.2 Changes in MBG, SDBG and LABG in rats after blood glucose fluctuation for 6 weeks (Mean±SD, mmol/l, n=3) Group MBG SDBG LAGE Control 5.77± ± ±0.28 SHG 29.83±.97** 2.58±0.85** 5.29±2.24** IG 22.3±5.97** 8.86±.63** 6.22±5.4** *P<0.05, **P<0.0 vs control; P<0.0 vs sustained high blood glucose group. MBG: Daily mean blood glucose; SDBG: The standard deviation of daily average blood glucose; LAGE: The largest amplitude of glycemic excursions. 表 3 血 糖 波 动 6 周 后 各 组 大 鼠 FINS 含 量 Tab.3 Levels of FINS in rats after blood glucose fluctuation for 6 weeks (Median±Quartile Range, μiu/ml, n=3) Group FINS Mean Rank Control 34.4 (52.84) SHG (5.02)* 20.5 IG (0.07)** 4.5 **P<0.0 vs control.
4 774 J South Med Univ, 204, 34(6): 各 组 大 鼠 胰 腺 组 织 形 态 学 变 化 ( 图 3) C 组 大 鼠 胰 岛 形 态 规 则 呈 圆 形, 数 量 较 多, 细 胞 核 呈 圆 形 蓝 色 着 染, 胞 质 丰 富 浅 粉 色 着 染, 胰 岛 表 面 有 一 层 纤 维 膜 包 裹, 与 外 分 泌 部 之 间 界 限 清 楚 ; 外 分 泌 腺 泡 细 胞 质 内 富 含 红 染 的 酶 原 颗 粒, 细 胞 核 呈 深 蓝 色 着 染 SHG 组 和 IG 组 大 鼠 均 可 见 胰 岛 萎 缩,β 细 胞 数 量 减 少, 颗 粒 脱 失, 空 泡 变 性, 部 分 β 细 胞 体 积 代 偿 性 增 大, 细 胞 凋 亡, 伴 有 毛 细 血 管 扩 张 充 血, 血 管 壁 增 厚, 周 围 结 缔 组 织 增 生 ; 外 分 泌 部 可 见 间 质 纤 维 增 生, 腺 泡 萎 缩, 萎 缩 部 导 管 扩 张, 亦 可 见 到 间 质 脂 肪 细 胞 异 位 沉 积 炎 细 胞 浸 润 等 现 象 其 中, 在 胰 岛 萎 缩 间 质 脂 肪 细 胞 异 位 沉 积 方 面, 波 动 血 糖 模 型 较 为 多 见, 在 胰 腺 腺 泡 萎 缩 方 面, 持 续 高 血 糖 组 较 为 多 见 C, Morphologically normal islets C2, Pancreas with normal number of islets IG, Atrophied Islets, with significantly decreased cell number and cell degranulation IG, Islets with cell hypertrophy and acinar atrophy IG, Artery wall thickening in pancreatic mesenchymal IG, Ectopic deposition of adipocyte in pancreatic mesenchymal IG, Hyperemia in pancreatic mesenchymal, accompanied by infiltration of inflammatory cells SHG, Atrophied Islet with significantly decreased beta-cells SHG, Some islets developed cell hypertrophy, degranulation, apoptosis, acinar cell atrophy and Interstitial fibrosis SHG, Infiltration of inflammatory cells in pancreatic interstitial tissue SHG, Vasodilation, congestion and vascular wall thickening in pancreatic interstitial tissue SHG, Ectopic deposition of adipocyte in pancreatic mesenchymal 图 3 各 组 大 鼠 胰 腺 组 织 形 态 学 Fig.3 Morphologic variations of rat pancreatics islets (HE, original magnification: 400). C: Control group; SHG: Sustained high blood glucose group; IG: Blood glucose fluctuation group. C2 (Original magnification: 00).
5 J South Med Univ, 204, 34(6): 讨 论 文 献 报 道 用 于 制 造 血 糖 波 动 的 糖 尿 病 模 型 有 单 纯 腹 腔 注 射 大 剂 量 STZ( 多 为 50 mg/kg 以 上 ) 和 高 脂 联 合 小 剂 量 腹 腔 注 射 STZ 两 种 方 式 [5-8], 高 脂 联 合 小 剂 量 腹 腔 注 射 STZ 形 成 的 动 物 模 型 类 似 2 型 糖 尿 病 特 点, 较 单 纯 腹 腔 注 射 大 剂 量 STZ 而 言, 血 糖 水 平 低, 且 对 高 脂 依 [9-0] 赖 性 强, 研 究 发 现 高 脂 诱 导 时 间 太 短 或 者 STZ 剂 量 太 小 都 不 易 诱 导 大 鼠 成 模,STZ 诱 导 成 功 后 若 停 用 高 脂 饲 料, 空 腹 血 糖 5~7 d 后 又 会 恢 复 正 常 基 于 波 动 血 糖 模 型 血 糖 波 动 的 幅 度 及 模 型 的 成 膜 率 和 死 亡 率 综 合 考 虑, 本 试 验 选 择 一 次 注 射 STZ 造 成 血 糖 相 对 较 高 的 糖 尿 病 模 型, 参 考 文 献 [] 采 用 50 mg/kg STZ, 一 次 性 腹 腔 注 射 诱 发 糖 尿 病 模 型, 以 血 糖 稳 定 0 d 后, 随 机 血 糖 水 平 6.7 mmol/l 作 为 糖 尿 病 大 鼠 模 型 成 功 的 标 准, 成 模 率 为 80% 模 型 大 鼠 出 现 进 食 量 饮 水 排 尿 明 显 增 多, 毛 色 无 光 泽, 精 神 萎 靡, 行 动 迟 缓 等 糖 尿 病 症 状 关 于 波 动 血 糖 模 型 的 建 立, 有 直 接 根 据 糖 尿 病 模 型 大 鼠 空 腹 血 糖 变 异 系 数 (FBG-CV) 的 水 平, 将 FBG-CV [2] 水 平 较 高 者 视 为 波 动 血 糖 模 型 但 由 于 糖 尿 病 大 鼠 日 内 血 糖 波 动 幅 度 并 非 很 大, 因 此, 多 数 文 献 报 道 的 波 动 血 糖 模 型 则 采 用 定 时 给 予 糖 尿 病 大 鼠 胰 岛 素 和 ( 或 ) 葡 萄 糖 进 行 诱 导 由 于 啮 齿 类 动 物 进 食 具 有 不 定 时 性, 与 人 的 饮 食 规 律 有 本 质 的 不 同, 单 纯 给 予 胰 岛 素 有 发 生 低 血 糖 的 风 险, 而 实 验 过 程 中 发 现 单 纯 口 服 给 糖, 血 糖 波 动 幅 度 又 往 往 偏 小 因 此 本 实 验 采 用 择 时 给 予 适 量 胰 岛 素 ( 血 糖 值 高 时 ) 或 灌 胃 葡 萄 糖 ( 血 糖 值 低 时 ) 的 方 式 造 模, 既 能 保 证 血 糖 波 动 的 幅 度, 亦 能 兼 顾 血 糖 个 体 化 的 差 异, 有 效 避 免 低 血 糖 的 发 生 关 于 胰 岛 素 的 时 间 次 数, 目 前 研 究 尚 未 统 一, 有 次 /d( 未 明 具 体 时 间 ) [3-4] [8] 次 [7] [5, 5] 次 注 射 未 定 次 数 等 为 达 到 良 好 的 造 模 效 果, 本 实 验 根 据 糖 尿 病 大 鼠 日 内 血 糖 波 动 特 点 确 定 胰 岛 素 d 时 间 与 剂 量, 考 虑 到 大 鼠 昼 伏 夜 动 的 生 活 习 性, 选 择 日 个 时 间 段 监 测 血 糖 变 化, 结 果 显 示 糖 尿 病 大 鼠 在 血 糖 处 于 较 高 水 平,2 00 降 至 最 低, d 内 血 糖 平 均 波 动 幅 度 不 大, 血 糖 最 高 点 与 最 低 点 差 别 在 0 mmol/l 之 内 以 这 种 日 内 血 糖 波 动 规 律, 实 验 选 择 血 糖 高 值 处 给 予 胰 岛 素, 根 据 普 通 胰 岛 素 皮 下 注 射 的 药 动 学, 0.5 h 开 始 起 作 用,2~3 h 达 作 用 高 峰, 造 成 了 0 00 与 血 糖 的 降 低, 改 变 了 DM 大 鼠 的 血 糖 波 动 曲 线, 使 得 LAGE 增 加, 形 成 了 d 中 血 糖 浓 度 大 幅 波 动 模 型 这 样 在 血 糖 高 值 给 予 胰 岛 素, 既 能 在 日 内 形 成 2 个 明 显 的 血 糖 波 动 高 峰 和 低 谷, 同 时 也 尽 可 能 避 免 了 低 血 糖 风 险 实 验 中 发 现 大 鼠 血 糖 有 个 体 化 差 异, 尤 其 是 8 00, 部 分 大 鼠 血 糖 会 偏 低, 因 此, 实 验 每 周 随 机 检 测 2 次 8 00 和 8 00 的 血 糖 值, 并 根 据 其 个 体 化 的 差 异 确 定 给 予 胰 岛 素 或 葡 萄 糖 的 剂 量, 在 形 成 波 动 血 糖 的 同 时, 尽 可 能 减 少 了 大 鼠 的 死 亡 率 胰 岛 素 剂 型 剂 量 的 选 择, 文 献 报 道 多 选 择 普 通 速 效 胰 岛 素 或 超 短 效 胰 岛 素 类 似 物 诺 和 锐, 一 次 剂 量 有 20 2~6 U 3 U/kg [7, 3, 5] 不 等, 胰 岛 素 在 临 床 上 作 为 糖 尿 病 治 疗 药 物 通 常 是 短 效 长 效 制 剂 联 用, 三 餐 前 以 短 效 制 剂 控 制 餐 后 高 血 糖, 并 以 长 效 制 剂 维 持 餐 间 及 夜 间 的 血 糖 水 平, 若 未 能 合 理 应 用 则 会 造 成 血 糖 波 动 从 而 给 人 体 带 来 不 利 后 果 因 此, 使 用 胰 岛 素 诱 导 血 糖 波 动 应 避 免 其 治 疗 作 用, 我 们 预 实 验 发 现, 中 长 效 胰 岛 素 在 降 糖 的 同 时, 能 使 一 日 血 糖 保 持 恒 定, 不 利 于 血 糖 波 动 的 形 成 因 此, 实 验 选 择 了 短 效 胰 岛 素 建 立 波 动 血 糖 模 型, 鉴 于 胰 岛 素 每 日 应 用 的 累 积 效 应 以 及 部 分 20 mmol/l 以 下 血 糖 者 有 回 复 正 常 的 可 能, 胰 岛 素 剂 量 不 能 过 大, 实 验 中 根 据 血 糖 的 高 低, 选 择 皮 下 注 射 短 效 胰 岛 素 ~3 U 研 究 结 果 表 明 造 模 6 周 后,IG 组 大 鼠 MBG 明 显 高 于 正 常 组,SDBG LAGE 明 显 高 于 C 组 和 SHG 组, 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P<0.0), 说 明 波 动 血 糖 模 型 制 作 成 功 有 研 究 表 明, 链 脲 佐 菌 素 诱 发 的 糖 尿 病 大 鼠 有 胰 岛 萎 缩,β 细 胞 数 量 减 少, 部 分 β 细 胞 体 积 代 偿 性 增 大, 以 及 胰 腺 间 质 血 管 壁 增 厚, 血 管 周 围 结 缔 组 织 增 生, 局 灶 性 [6] 腺 泡 萎 缩, 间 质 纤 维 增 生 等 胰 腺 病 变 对 于 型 糖 尿 病 模 型 而 言, 还 多 伴 有 β 细 胞 颗 粒 脱 失, 空 泡 变 性, 胰 岛 毛 细 血 管 扩 张 充 血 等 表 现 ;2 型 糖 尿 病 模 型 则 可 较 多 出 现 β 细 胞 凋 亡,β 细 胞 内 及 血 管 周 围 脂 肪 细 胞 异 位 沉 积 等 病 理 现 象 我 们 的 实 验 发 现 成 模 的 糖 尿 病 大 鼠 胰 岛 组 织 病 理 学 改 变 兼 有 型 和 2 型 糖 尿 病 的 胰 腺 病 变, 这 说 明 STZ 直 接 破 坏 胰 岛 β 细 胞, 使 β 细 胞 数 量 减 少, 其 可 能 导 致 胰 岛 素 分 泌 合 成 不 足, 使 血 糖 升 高, 从 而 产 生 糖 尿 病, 同 时 也 证 实 了 我 们 采 用 的 50 mg/kgstz 一 次 性 腹 腔 注 射 诱 发 糖 尿 病 模 型 的 方 法 并 非 是 绝 对 的 型 或 2 型 糖 尿 病 模 型, 而 是 两 者 兼 而 有 之 实 验 中, 大 鼠 体 质 量 在 不 同 时 间 的 差 别 有 统 计 学 意 义 (P<0.0) 血 糖 波 动 造 模 开 始 时,IG 组 大 鼠 体 质 量 持 续 上 升 至 4 周 达 高 峰, 然 后 下 降 ;SHG 组 体 质 量 缓 慢 上 升 ;C 组 体 质 量 呈 持 续 增 加 而 在 C 组 SHG 组 IG 组 大 鼠 体 质 量 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0.05) 我 们 亦 检 测 了 3 组 大 鼠 FINS 水 平, 发 现 在 血 糖 波 动 6 周 后 总 体 分 布 存 在 显 著 性 差 异 (P<0.0),SHG 组 IG 组 大 鼠 FINS 水 平 低 于 正 常 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0.05,P<0.0), IG 组 SHG 组 大 鼠 FINS 水 平 之 间 的 差 异 则 无 统 计 学 意 义 实 验 发 现 持 续 高 血 糖 模 型 大 鼠 体 质 量 变 化 与 胰 岛 素 作 用 并 不 同 步, 胰 岛 素 降 低 的 同 时 体 质 量 未 见 明 显 降 低, 推 测 以 50 mg/l STZ 造 模 诱 发 糖 尿 病 仅 能 破 坏 部 分 胰 岛 β 细 胞 与 之 比 较, 波 动 血 糖 模 型 大 鼠 血 清 FINS 水
6 776 J South Med Univ, 204, 34(6): 平 降 低 更 为 明 显, 造 模 过 程 中 体 质 量 呈 先 升 后 降 的 变 化, 考 虑 可 能 随 着 时 间 推 移,STZ 和 波 动 血 糖 损 伤 胰 岛 β 细 胞 的 综 合 效 应 增 强, 胰 岛 β 细 胞 破 坏 程 度 更 重, 导 致 残 存 胰 岛 细 胞 无 法 再 发 挥 代 偿 作 用, 而 使 血 糖 和 体 质 量 逐 渐 降 低 综 上 所 述, 定 时 给 予 糖 尿 病 大 鼠 胰 岛 素 或 葡 萄 糖 进 行 诱 导 建 立 的 血 糖 波 动 模 型 有 如 下 优 点 :() 血 糖 升 高 幅 度 明 显, 重 复 性 好 ;(2) 成 模 后 血 糖 值 较 稳 定 自 身 缓 解 较 少 ;(3) 以 糖 尿 病 大 鼠 日 内 血 糖 波 动 特 点 确 定 造 模 时 段, 能 提 高 模 型 成 功 率, 降 低 低 血 糖 风 险 ;(4) 根 据 血 糖 个 体 化 的 差 异 给 予 胰 岛 素 或 葡 萄 糖, 可 减 少 造 模 过 程 中 的 死 亡 率 但 该 模 型 要 求 每 周 检 测 ~2 次 血 糖, 周 期 较 长, 实 验 成 本 加 大, 给 研 究 带 来 一 定 的 不 便, 这 也 是 此 类 造 模 方 法 尚 待 改 进 之 处 此 外, 在 STZ 剂 量 的 选 择 上, 如 何 合 理 兼 顾 血 糖 波 动 的 幅 度 模 型 的 成 膜 率 和 死 亡 率 以 及 成 膜 后 的 糖 尿 病 类 型, 亦 是 模 型 需 要 进 一 步 探 讨 的 问 题 参 考 文 献 : [] Kilpatrick ES, Rigby AS, Atkin SL. Effect of glucose variability on the long-term risk of microvascular complications in type diabetes [J]. Diabetes Care, 2009, 32(0): [2] 王 先 令, 陆 菊 明. 血 糖 波 动 对 糖 尿 病 预 后 及 其 慢 性 并 发 症 发 生 发 展 的 影 响 [J]. 国 外 医 学 : 内 分 泌 学 分 册, 2005, 25(3): 69-7, 73. [3] Chang CM, Hsieh CJ, Huang JC, et al. Acute and chronic fluctuations in blood glucose levels can increase oxidative stress in type 2 diabetes mellitus[j]. Acta Diabetol, 202, 49(Suppl ): S7-7. [4] Kim M, Chung H, Yoon C, et al. Increase of INS- cell apoptosis under glucose fluctuation and the involvement of FOXO-SIRT pathway[j]. Diabetes Res Clin Pract, 202, 98(): [5] 杨 智 勇, 张 微, 赵 晟, 等. 血 糖 波 动 对 糖 尿 病 大 鼠 心 肌 组 织 中 转 化 生 长 因 子 β 的 影 响 [J]. 陕 西 医 学 杂 志, 202, 4(4): [6] 金 可 可, 林 艳 红, 王 万 铁, 等. 血 糖 波 动 对 糖 尿 病 大 鼠 肾 小 球 内 皮 细 胞 和 肾 小 管 上 皮 细 胞 凋 亡 的 影 响 [J]. 中 国 病 理 生 理 杂 志, 2007, 23(3): [7] 李 素 娟, 刘 浩, 李 剑 敏, 等. 糖 尿 病 大 鼠 血 糖 波 动 对 肝 脏 功 能 及 超 微 结 构 的 影 响 [J]. 肝 胆 胰 外 科 杂 志, 20, 23(): 7-0. [8] 廖 洁, 雷 闽 湘, 陈 雄, 等. 血 糖 波 动 对 糖 尿 病 大 鼠 血 管 内 皮 依 赖 性 舒 张 功 能 的 影 响 [J]. 中 国 糖 尿 病 杂 志, 202, 20(2): [9] 何 清 华, 周 迎 生, 王 征, 等. 2 型 糖 尿 病 大 鼠 模 型 制 备 的 影 响 因 素 及 其 特 点 [J]. 中 国 实 验 动 物 学 报, 2007, 5(6): 425-9, 插 4. [0] 张 汝 学, 贾 正 平, 李 茂 星, 等. 实 验 性 2 型 糖 尿 病 大 鼠 模 型 的 建 立 和 评 价 (Ⅲ Ⅳ)- 血 脂 水 平 和 血 浆 糖 代 谢 相 关 激 素 的 变 化 [J]. 西 北 国 防 医 学 杂 志, 2008, 29(6): [] 黄 琛, 顾 志 峰, 曹 晓 蕾, 等. 型 糖 尿 病 大 鼠 模 型 建 立 及 稳 定 性 研 究 [J]. 现 代 检 验 医 学 杂 志, 2007, 22(3): [2]Wang JS, Yin HJ, Guo CY, et al. Influence of high blood glucose fluctuation on endothelial function of type 2 diabetes mellitus rats and effects of Panax Quinquefolius Saponin of stem and leaf[j]. Chin J Integr Med, 203, 9(3): [3] 周 冬 梅, 李 伟. 血 糖 波 动 对 型 糖 尿 病 大 鼠 肾 组 织 基 质 金 属 蛋 白 酶 9 和 金 属 蛋 白 酶 组 织 抑 制 剂 表 达 的 影 响 [J]. 中 华 肾 脏 病 杂 志, 20, 27(2): 30-. [4] 李 伟, 孙 娟, 殷 松 楼, 等. 血 糖 波 动 对 糖 尿 病 大 鼠 海 马 神 经 元 凋 亡 相 关 蛋 白 表 达 的 影 响 [J]. 基 础 医 学 与 临 床, 2009, 29(0): [5] 蔡 燕, 刘 翠 萍, 茅 晓 东, 等. 血 糖 波 动 对 糖 尿 病 大 鼠 胰 岛 素 释 放 和 胰 岛 素 敏 感 性 的 影 响 [J]. 南 京 医 科 大 学 学 报 : 自 然 科 学 版, 2009, 29(): [6] 潘 琳. 实 验 性 糖 尿 病 病 理 图 谱 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社, 2007: 20-. ( 编 辑 : 吴 锦 雅 )
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