青光眼的基因治疗:问题与挑战

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刷郝
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1 述评青光眼的基因治疗 : 问题与挑战陈晓明作者单位 : 成都, 四川大学华西医院眼科中心 ( chenxm58@163.com) 摘要青光眼基因治疗的靶目标包括眼前节的小梁网和睫状体眼后节的视网膜神经节细胞等青光眼基因治疗的策略包括降眼压视神经保护及抑制滤过术后瘢痕形成等方面将目的基因导入小梁组织使房水排出阻力增加是一种理想的造模方法目前虽在青光眼基因治疗领域取得较大进展, 但在组织特异性启动子长时基因表达及副作用等方面尚存在着问题和挑战 ( 眼科,2007, 16: 2-5) 关键词青光眼; 基因疗法 Glaucoma gene therapy: obstacles and challenges CHEN Xiao-ming, West China Eye Center, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu , China Corresponding author: CHEN Xiao-ming, chenxm58@163.com Abstract Trabecular meshwork, ciliary body, retina and optic nerve will be the targets for glaucoma gene therapy. The strategies include lowering intraocular pressure, neuroprotection and preventing wound healing in glaucoma filtration surgery. Overexpression of certain gene(s) in trabecular meshwork to increase the resistance to aqueous humor outflow would be an ideal method to create an animal model of glaucoma. Even though great progress has been made in this field, significant challenges and obstacles, including lack of tissue specific promoter, problems in long-term gene expression and side effects, still remain to be resolved. (Ophthalmol CHN, 2007, 16: 2-5) Key words glaucoma; gene therapy 近年来, 青光眼发病的分子病理机制日益受到关注针对与青光眼发病相关的缺陷靶组织在分子水平上进行矫正的探讨, 已使青光眼基因治疗成为可能一青光眼基因治疗的靶组织 1. 眼表 : 靶组织为结膜组织, 针对滤过术后瘢痕形成所引起的手术失败 2. 眼前节 : 靶组织包括小梁通道和睫状体 ( 上皮和睫状肌 ) 近管结缔组织及 Schlemm 管内壁细胞是形成小梁通道房水排出阻力的主要部位肌动蛋白细胞骨架是调控细胞形态和细胞连接的重要蛋白, 该蛋白的状态及变化参与形成小梁通道的构形及对房水排出阻力肌动蛋白在灵长类动物和人类的小梁近管结缔组织及 Schlemm 管内壁细胞中有丰富的表达, 已成为目前降眼压治疗的靶蛋白 [1] 导入肌动蛋白调控基因是青光眼基因治疗发展的重要方向之一近年来小梁组织的转基因研究进展迅速研究表明, 腺病毒载体可成功地将外源基因导 [2] 入多种动物的小梁组织, 包括鼠兔狗和猴, 转基因表达时间多在 1~3 周除腺病毒外, 小梁细胞对单疱病毒和慢病毒载体也较为敏感 [3] 较其他眼部组织而言, 小梁组织转基因研究的优势是可以用前房角镜观察活体眼实时报告基因 ( 如绿色荧光蛋白基因 ) 的表达 [2] 1

2 目前以小梁组织肌动蛋白为转基因治疗目标的降眼压基因正在研究之中此外, 用基质金属蛋白酶基因表达产物降解调节小梁区域的细胞外基质亦可调控房水流出的阻力, 降低眼压前房内注射单疱病毒载体可转导睫状体非色素上皮细胞 [2] 睫状体内皮产生房水, 是目前一些降眼压药物的效应组织, 但基因治疗尚未涉及已知房水中含有大量的小梁细胞调控因子, 可调节小梁通道房水排出阻力睫状体内皮具有神经内分泌活性, 可释放激素和活性肽因此, 调控这些睫状体内皮因子浓度亦可成为青光眼基因治疗的目标 3. 眼后节 : 主要是针对视网膜神经节细胞 (RGC) 死亡的神经保护基因治疗一些研究提示采用基因治疗可能防止和延缓 RGC 死亡如通过转基因方法导入凋亡抑制基因及神经营养因子等但由于这些研究是建立在视神经切断模型的基础之上, 与实际青光眼不尽相同, 所以这些结果还有待于在更接近于病理生理状态下的高眼压模型中进一步证实一般认为通过玻璃体注射是传送基因到达 RGC 的有效途径如注射腺病毒载体可有效转导 Müller 细胞表达目的基因而 Müller 细胞作为重要的神经营养因子的来源, 且可被病毒载体转导, 在今后通过加强表达神经营养因子来保护 RGC 的基因治疗中将起重要作用 [4] 二青光眼基因治疗的方案青光眼基因治疗的方案与青光眼常规治疗基本一致, 分述如下 : 1. 抑制滤过术后瘢痕形成 : 滤过手术是青光眼治疗最常用的手术方式手术后结膜伤口的愈合情况是手术能否保持长期成功的决定因素为了减少滤过泡和巩膜造瘘的瘢痕形成, 常联合应用抗代谢药物 ( 如 5- 氟尿嘧啶和丝裂霉素 ), 但有一定副作用 p 21 是细胞周期调节蛋白, 可干预滤过术后伤口的愈合过程研究表明将用腺病毒 p21 表达载体浸泡的海绵在滤过术中放置在结膜瓣下, 因其可抑制 DNA 合成和细胞生长, 从而抑制滤过术后伤口愈合和纤维增生, 且在动物体上未观察到类似于应用丝裂霉素所出现的副作用 [5] 2. 降低眼压 : 眼压是青光眼性视神经损伤的主要危险因素因此, 降眼压是治疗青光眼的主要手段小梁网通道房水引流占房水总排出量的 50%~75% 该通道中小梁近管结缔组织和 Schlemm 管内壁细胞的细胞骨架蛋白以及与之相关的细胞间连接细胞与其周围细胞外基质的连接决定了小梁通道的构形并形成对房水排出的阻力目前已证实某些化合物可降解肌动蛋白及相关细胞连结蛋白, 从而能增加眼房水流出, 降低眼压 Rho GTP 酶可调节肌动蛋白骨架和介导细胞多种生物学功能实验表明,Rho 激酶的显性抑制突变体对器官培养人眼前节房水排出通道有特殊效应, 可改善小梁网通道的房水流出 [6] 直接抑制 Rho [7] GTP 酶亦可增加房水排出 Liu 等研究表明, 腺病毒载体介导肉毒杆菌的外酶 C3 转移酶 (Rho GTP 酶的特异抑制蛋白 ) 转基因表达可降解人小梁细胞的细胞骨架和细胞黏附, 并显著提高房水引流此外, 抑制 Rho GTP 酶的下游效应器 Rho 激酶亦可增加器官培养猪眼人眼及活体鼠眼的房水排出 [8] 近年来, 通过抑制 Rho GTP 酶和 Rho 激酶等来调节小梁通道细胞肌动蛋白骨架构建已成为青光眼基因治疗的策略之一此外钙调结合蛋白 Myosin II ATP 酶抑制剂和蛋白激酶 C 也能增加小梁网途径房水排出 [9, 10] 钙调结合蛋白系一种潜在的肌动球蛋白 ATP 酶的抑制剂, 该基因过度表达可降解培养人小梁细胞的肌动蛋白骨架及细胞黏附, 形成肌动蛋白弯曲纤维网络 ; 同时, 还可增加器官培养猴眼的房水排出 [11] 目前采用药物抑制房水生成治疗青光眼有一定副作用将目的基因导入睫状体可能抑制房水生成 Liu 等将重组单疱病毒载体导入眼内, 在包括睫状肌非色素上皮细胞在内的一些眼组织中检测到报告基因表达 [3] 最近, 作为基因治疗的一种方法,RNA 干扰在抑制房水生成方面显示潜力局部滴用针对碳酸酐酶和肾上腺素受体基因的 sirnas 均可使兔眼压降低 [12, 13] 2

3 3 3. 视网膜神经节细胞和视神经保护 : 青光眼性 RGC 凋亡与神经营养因子剥夺相关如向玻璃体腔注射神经营养因子, 如脑源性神经营养因子 (BDNF) 睫状神经营养因子 (CNTF) 等, 可抑制动物模型视神经切断后 RGC 凋亡 BDNF 是 RGC 的一种重要保护因子腺病毒载体介导 BDNF 基因治疗可选择性转导 Müller 细胞并表达 BDNF, 对大鼠视神经切断后 RGC 有保护作用 [4] 腺相关病毒介导 BDNF 在鼠青光眼模型眼中表达, 对 RGC 神经保护作用明显优于对照组 [14] BDNF 的受体 TrkB 在视神经切断后表达水平下降由腺相关病毒介导的 TrkB 基因转导和外源性的 BDNF 配合使用可增加神经细胞的存活 [15] 最近的研究表明, 细胞外信号调节激酶 ERK 和 PI3K 可调节 BDNF 的功能, ErK1/2 对成年鼠 RGC 存活和轴 [16] 突再生有一定的作用 Pernet 等使用腺相关病毒转导大鼠视神经切断后的 RGC, 发现 ErK1/2 途径在 RGC 保护中发挥重要作用同时证实, 腺相关病毒载体转导基因编码产物持续表现活性或激活 MEK1,MEK1 是 ErK1/2 上游的效应子, 将 MEK1 基因导入 RGC 显著提高了 RGC 存活率 ErK1/2 途径在高眼压青光眼模型中同样起到保护 RGC 作用 [17] [18] Martinou 等报道转基因小鼠表达凋亡抑制基因 Bcl-2, 可保护小鼠神经元线粒体膜的完整性, 增加 RGC 数目及内丛状层的厚度此外, 凋亡还与半胱氨酸蛋白酶 caspase 的激 [19] 活有关因此, 通过转基因导入 caspase 抑制剂有利于保护 RGC Mckinnon 等应用腺相关病毒 - 鸡 ß- 肌动蛋白载体介导 caspase 抑制剂 BIRC4 眼内表达, 促进了鼠青光眼模型神经元轴突的存活进一步研究证实, 用 BIRC4 抑制视网膜 caspase-3 活性, 减少了 caspase-3 介导的细胞骨架成分 α-fodrin 的破坏三青光眼基因治疗的动物模型目前通过激光高渗盐水及血管结扎等方法诱导的高眼压动物模型与真正青光眼在小梁网病理改变方面有较大差异, 不能作为研究改善房水流出阻力药物的理想模型将目的基因导入小梁组织, 通过该基因表达增加小梁通道对房水外流的阻力而使眼压增高是一种较理想的造模方法在神经功能保护方面, 目前大鼠青光眼模型已经用于腺相关病毒载体介导脑源性神经营养因子的表达此外, 该青光眼模型在腺相关病毒介导的 caspase 抑制剂表达抑制 RGC 凋亡已显示治疗前景 [19] Martinou 等成功培育出神经元中表达凋亡抑制基因 Bcl-2 的转基因小鼠, 使 RGC 数量增加 50%, 内丛状层厚度亦增加 [18] 最近, 经玻璃体腔内注射腺相关病毒的大鼠青光眼模型显示 RGC 中高效率转染 [14] 此外, 成年猫 RGC 轴突损伤模型为研究 RGC 在青光眼等疾病中死亡机制提供了基础四存在的问题与挑战 1. 组织特异性启动子 : 尽管可以将转基因载体注入眼内某一部位, 但转基因表达尚缺乏组织和细胞的特异性是目前存在的主要问题之一目前基因治疗研究多采用人类巨细胞病毒 (CMV) 作为启动子, 缺乏组织表达特异性小梁组织特异性启动子将明显提高小梁基因转导效率而不会引起眼部其他组织副作用新近研究已发现一些小梁特异性启动子从基质 Gla 蛋白基因分离的启动子片段可在小梁细胞特异性表达报告基因, 而不能在邻近细胞如角膜内皮细胞和巩膜突以后的细胞表达 [20] 最近研制腺相关病毒载体, 采用鸡 ß- 肌动蛋白作为启动子, 在 RGC 光感受器和色素上皮细胞中高效表达 [21] Ch3L1 启动子对培养的小梁细胞和灌注眼前房小梁组织亦有特异性表达活性 [22] 2. 长时间基因表达 : 青光眼是一种慢性或终身疾病因此, 转基因长时间表达尤其重要许多因素影响了基因的长时表达转基因表达水平及持续时间与启动子选择密切相关研究表明,CMV 启动子关闭很可能与 NF k B 反应元件有关, 因为一些细胞可通过 NF k B 的激活作用再刺激该启动子表达 [23], 是否可通过持续激活 NF k B 以保持 CMV 启动子活性有待于深入研究小梁组织中转基因的长时表达尚未实现脂质体腺病毒腺相关病毒和单疱病毒等载体均有表达时间短炎症反应或缺乏靶向性等不足

4 3. 副作用 : 非病毒载体表达时间短, 载体 DNA 在细胞核中不稳定腺病毒载体主要的副作用是导入后诱导的炎症反应及由此引起的细胞毒性免疫反应, 其可导致被转导细胞的死亡同样, 严重炎症反应和高滴度中和抗体在腺相关病毒载体亦有报道因此, 如何控制这些载体的副作用仍有待于进一步研究总之, 小梁网睫状体视网膜等可作为青光眼基因治疗的靶组织要达到基因治疗青光眼的目的, 首先需更深入地从分子水平了解这些组织与青光眼发病的关系, 如小梁的细胞连接细胞外基质细胞骨架重排及相关信号转导途径 ; 房水的产生和调节, 以及睫状体内皮所释放的因子是否可调节小梁的功能 ; 在各种刺激及眼压升高及不升高的状态下,RGC 死亡的机制等同时还需要有与人病理性眼压升高相似的青光眼动物模型尽管基因治疗仍存在不少有待解决的问题, 但它具有普通治疗所难以达到的优越性基因治疗是否能够成功地应用于青光眼或其他疾病治疗还有赖于转基因载体的改进, 使其在毒副作用降低的同时提高转导效率 ; 同时组织特异性表达也十分重要, 可增加疗效而减少副作用参考文献 [1] Liu X, Cai S, Glasser A, et al. Effect of H-7 on cultured human trabecular meshwork cells. Molecular Vision, 2001, 7: [2] Borras T, Gabelt BT, Klintworth GK, et al. Non-invasive observation of repeated adenoviral GFP gene delivery to the anterior segment of the monkey eye in vivo. J Gene Med, 2001, 3: [3] Liu X, Brandt CR, Gabelt BT, et al. Herpes simplex virus mediated gene transfer to primate ocular tissues. Exp Eye Res, 1999, 69: [4] Di Polo A, Aigner LJ, Dunn RJ, et al. Prolonged delivery of brain-derived neurotrophic factor by adenovirus-infected Muller cells temporarily rescues injured retinal ganglion cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95: [5] Perkins TW, Faha B, Ni M, et al. Adenovirus-mediated gene therapy using human p21waf-1/cip-1 to prevent wound healing in a rabbit model of glaucoma filtration surgery. Arch Ophthalmol, 2002, 120: [6] Rao PV, Deng P, Maddala R, et al. Expression of dominant negative rho-binding domain of rho-kinase in organ cultured human eye anterior segments increases aqueous humor outflow. Mol Vis, 2005, 11: [7] Liu X, Hu Y, Filla MS, et al. The effect of C3 transgene expression on actin and cell adhesions in cultured HTM cells and on outflow facility in organ cultured monkey eye. Mol Vis, 2005, 11: [8] Tian B, Kaufman PL. Effects of the rho kinase inhibitor Y and the phosphatase inhibitor calyculin-a on outflow facility in monkeys. Exp Eye Res, 2005, 80: [9] Mettu PS, Deng PF, Misra UK, et al. Role of lysophospholipid growth factors in the modulation of aqueous humor outflow facility. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2004, 45: [10] Rao PV, Deng P, Sasaki Y, et al. Regulation of myosin light chain phosphorylation in the trabecular meshwork: role in aqueous humour outflow facility. Exp Eye Res, 2005, 80: [11] Gabelt BT, Hu Y, Vittitow JL, et al. Caldesmon transgene expression disrupts focal adhesions in HTM cells and increases outflow facility in organ-cultured human and monkey anterior segments. Exp Eye Res, 2006, 82: [12] Pintor JJ, Mediero A, Jimenez A, et al. Peral Sirna in the treatment of ocular hypertension targeting alpha and beta adrenoceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006, 47: E-Abstract

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Microsoft Word - 360145.doc 项目批准号 81273814 归口管理部门申请代码收件日期 H2716 360145 y 国家自然科学基金委员会资助项目计划书资助类别 : 面上项目亚类说明 : 非连续资助类项目附注说明 : 项目名称 : 益气养肺法拮抗 bfgf 对肺癌微环境介导化疗