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讪珊来
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1 :21 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2014, 36(12): DOI: /cjcb 利用 CRISPR/Cas9 系统和 TALEN 技术干预 XIST 基因的表达剌婷 1 马健阳 1 沈南 1,2 唐元家 1,2* ( 1 上海交通大学医学院 / 中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所, 分子风湿病学研究组, 上海 ; 2 上海交通大学医学院附属仁济医院, 上海市风湿病研究所, 上海 ) 摘要 XIST 是维持雌性哺乳动物 X 染色体稳定失活的重要长链非编码基因 X 染色体失活异常导致 X 连锁基因的过量表达从而参与了癌症等疾病的发生干预 XIST 的表达在 XIST 的生物学功能和相关疾病发生的研究中是必不可少的该研究利用 CRISPR/Cas9 系统和 TALEN 技术在 293T 细胞中对已知的 XIST 的核心启动子进行编辑, 建立了通过酶切测序等鉴定突变效率的方法, 并且结合极限稀释法片段分析和 TA 克隆测序得到基因型确定的 XIST 低表达的单克隆细胞系结果显示, CRISPR/Cas9 和 TALEN 对 XIST 核心启动子的突变可以有效地抑制 XIST 的表达该研究表明, 针对 XIST 核心启动子的基因组编辑可以干预 XIST 的表达, 这为长链非编码 RNA 基因的敲低提供了新的思路关键词 XIST; CRISPR/Cas9; TALEN; 基因敲低 ; 长链非编码 RNA Interfering XIST expression by CRISPR/Cas9 and TALEN La Ting 1, Ma Jianyang 1, Shen Nan 1,2, Tang Yuanjia 1,2 * ( 1 Laboratory of Molecular Rheumatology of Institute of Health Sciences, Shanghai Jiaotong University School of Medicine (SJTUSM)& Shanghai Institutes for Biological Science (SIBS), Chinese Academy of Sciences (CAS), Shanghai , China; 2 Shanghai Institute of Rheumatology, Shanghai Jiaotong University School of Medicine Affiliated Renji Hospital, Shanghai , China) Abstract XIST is one of the long noncoding genes which could help to keep X chromosome silenced in mammals. The abnormity of X chromosome in activation increases the expression of X-linked genes, which is thought to represent a key event in oncogenesis and the occurrence of other diseases. Interfering XIST expression is necessary to study functions of XIST and associated diseases. In this study, we edited the known core promoter of XIST by CRISPR/Cas9 and TALEN in 293T cells. T7E1 assay and sequencing were used to detect the efficiency of mutation. Limiting dilution, fragment analysis and TA cloning were used to get the monoclonal cell lines expressing low XIST and identify their genotypes. Results showed that compared with the control group, both CRISPR/Cas9 and TALEN could mutate the core promoter and knock down the expression of XIST. In conclusion, the edited core promoter of XIST could knock down its expression. The results may contribute to new strategy about silencing long noncoding genes. Key words XIST; CRISPR/Cas9; TALEN; gene knockdown; long noncoding RNA 收稿日期 : 接受日期 : 国家自然科学基金 ( 批准号 : ), 国家重点基础研究发展计划 (973 计划 )( 批准号 : 2014CB541901), 上海市自然科学基金 ( 批准号 : 12ZR ) 资助的课题 * 通讯作者 Tel: , tangyuanjia028@163.com This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No ), the National Key Basic Research and Development Program of China (973 Program) (Grant No.2014CB541901) and the Shanghai Natural Science Fundation (Grant No.12ZR ) Received: August 19, 2014 Accepted: September 20, 2014 *Corresponding author. Tel: , tangyuanjia028@163.com

2 2 研究论文大多数哺乳动物的细胞都是二倍体一般雌性哺乳动物有两条 X 性染色体, 雄性性染色体为一条 X 染色体和一条 Y 染色体雌性为了避免基因过剩表达, 其中一条 X 染色体在发育早期将失活, 以异染色质化的方式存在, 该染色体上大多数基因都不能 [1-3] 表达 XIST(X-inactive specific transcript) 是特异表达在失活 X 染色体上的非编码基因, 转录加工后, 其 RNA 转录本会从 X 染色体失活中心 (X inactivation center, XIC) 的位置开始, 逐渐将要失活的 X 染色体包裹起来, 同时在其他 RNA 和蛋白的共同作用下, 促 [4-5] 使基因沉默, 使得该条 X 染色体失活近年来, 科学家对 XIST 基因的进一步研究发现, XIST 对于稳定 [6-7] X 染色体的失活沉默非常重要此外, 越来越多的证据表明, XIST 基因的表达水平与一些癌症的发生密切相关失活的 X 染色体在细胞核中浓缩成染色较深的染色质体称为巴氏小 [8-10] 体, 乳腺癌和卵巢癌细胞中通常没有巴氏小体, [11] 睾丸瘤的产生一般依赖于异常增多的 X 染色体 [12] Yildirim 等通过研究发现, 在造血干细胞中敲除 XIST 可导致小鼠高侵略性骨髓增生性肿瘤和骨髓增生异常综合症 XIST 的缺失会导致细胞内基因转录 [13] 谱的变化, 癌症相关基因表达上调这说明 XIST 作为一个长链非编码基因在癌症发生中发挥了重要的生物学作用 XIST 低表达或者不表达在 XIST 的功能研究中非常重要, 在不同细胞系或者动物模型中干预其表达可为生物学和疾病研究提供便利 XIST 在人类细胞中的转录本长达 19 Kb( bp, GRCh38/hg38), 且存在另外一个转录本 TSIX 与 XIST 尾对尾重叠小鼠基因组上 XIST 基因也与 TSIX 基因重叠目前人们已经在小鼠 ES 细胞中进行了 XIST 的敲除, 采用 Cre 酶同 [14-16] 源重组的方式进行大片段的敲除或者替换由于 XIST 与 TSIX 重叠, 传统的敲除方法只针对 XIST 全长进行敲除, 难免在基因组上破坏 TSIX 基因 ; 或者针对 XIST 的启动子和第一个外显子进行敲除, 如此针对 XIST 的序列敲除是不完全的此外, 这种大片段敲除的方法操作复杂且成本高效率低针对基因组的敲除, 基因型一般会随着细胞的增殖得到保留除了这种针对基因组的操作之外, 科学家们还尝试 [17] 了不改变基因组的 sirna 的干预方式 CRISPR/Cas9 系统是基于细菌和古细菌的免疫 [18-20] 防御机制而改造的一种基因组修饰技术与基因组特异互补配对的 RNA 引导核酸酶 Cas9 对双链 DNA 进行剪切, 从而引发非同源末端连接或者同源重组这两类修复在没有同源模板存在的情况下容易发生非同源末端连接修复, 这是一种倾向于错误的修复机制修复之后的 DNA 序列往往会有突变或者部分碱基的缺失或者插入这些突变非常容易引起编码基因功能的丧失 Hendrich 等 [21] 利用荧光素酶报告基因系统对 XIST 的启动子进行的研究表明, XIST 上游有一段序列对于 XIST 的转录启动非常重要, 为 XIST 的核心启动子区域本研究使用 CRISPR/Cas9 系统针对已报道的 XIST 核心启动子及周围区域进行突变, 同时针对该位点将 TALEN 和 CRISPR/Cas9 系统进行了比较, 发现这两种技术对 XIST 的表达均有一定的影响相对于传统的针对基因组编辑的敲除方法, 该方法成本低, 操作更加简便 1 材料与方法 1.1 实验材料人胚肾细胞 293T(human embryonic kidney 293T, HEK293T) 购自中国科学院上海细胞库 ; 大肠杆菌菌株 DH-5α 和普通 DNA 产物纯化试剂盒购自天根生物科技有限公司大肠杆菌 stble3 购自 GeneCopoeia 公司 ; pemt 载体购自南京诺唯赞生物科技有限公司 ; px260(addgene 编号 42229) 质粒由华东师范大学李大力老师馈赠 ; 快速构建 TALEN 试剂盒购自斯丹赛生物技术有限公司 ; BbsI 内切酶和 T7 核酸内切酶 I(T7E1) 购自美国 NEB 公司 ; T4 DNA ligase 购自美国 Promega 公司 ; 逆转录 PrimeScript RT reagent Kit SYBR Premix Ex Taq II 50 bp DNA ladder marker proteinase K 和 La Taq 聚合酶购自 TaKaRa 公司 ; Annealing Buffer for DNA Oligos(5 ) 购自碧云天生物技术研究所 ; ssdna Oligo 和引物由上海生工生物科技有限公司合成 ; TransDirect Animal Tissue PCR Kit 购自北京全式金生物技术有限公司 ; 转染试剂 Lipofectamine 2000 Trizol Opti-MEM 胎牛血清高糖 DMEM 购自 Life Technology 公司 1.2 实验方法 sgrna 表达载体的构建与 sgrna 的设计构建 pemt/sgrna 质粒 : 设计引物 U6 forward primer: 5 -GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3 和 Bbs I sgrna primer:5 -AAA AAA AGC ACC GAC TCG

3 剌婷等 : 利用 CRISPR/Cas9 系统和 TALEN 技术干预 XIST 基因的表达 3 GTG CCA CTT TTT CAA GTT GAT AAC GAC TAG CCT TAT TTT AAC TTG CTA TTT CTA GCT CTA AAA CAG GTC TTC TCG AAG ACC CGG TGT TTC GTC CTT TCC ACC AAG-3 以 px260 质粒为模板进行 PCR, 得到含有 U6 启动子和 BbsI 酶切位点的 sgrna 表达序列的片段, 序列如下 : 5 -GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CCT TCA TAT TTG CAT ATA CGA TAC AAG GCT GTT AGA GAG ATA ATT GGA ATT AAT TTG ACT GTA AAC ACA AAG ATA TTA GTA CAA AAT ACG TGA CGT AGA AAG TAA TAA TTT CTT GGG TAG TTT GCA GTT TTA AAA TTA TGT TTT AAA ATG GAC TAT CAT ATG CTT ACC GTA ACT TGA AAG TAT TTC GAT TTC TTG GCT TTA TAT ATC TTG TGG AAA GGA CGA AAC ACC GGG TCT TCG AGA AGA CCT GTT TTA GAG CTA GAA ATA GCA AGT TAA AAT AAG GCT AGT CCG TTA TCA ACT TGA AAA AGT GGC ACC GAG TCG GTG CTT TTT T-3 纯化该 PCR 产物后连接到 pemt 骨架质粒上, 得到可插入 20 bp sgrna 的表达载体 ( 图 1A), 命名为 pemt/sgrna 利用在线软件 Optimized CRISPR Design( crispr.mit.edu/) 针对 XIST promoter 设计 sgrna 序列为 : XIST sgrna-1-top: 5 -CAC CGT GTC CGG CTT TCA ATC TTC T-3 ; XIST sgrna -1-bottom: 5 -AAA CAG AAG ATT GAA AGC CGG ACA C-3 ; XIST sgrna-2-top: 5 - CAC CGC GGA GAG AGC ATA AGA GGC G-3 ; XIST sgrna -2-bottom: 5 - AAA CCG CCT CTT ATG CTC TCT CCG C-3 位置如图 1B 所示采用碧云天 Annealing Buffer for DNA Oligos(5 ) 将以上序列退火, 形成可连接至 BbsI 酶切之后的线性 pemt/sgrna 载体上 Cas9 表达质粒使用 px TALEN 质粒的构建针对 XIST 启动子区域由斯丹赛公司设计 TALEN 序列, 共设计 5 条 TALEN 序列, 左臂 3 条, 右臂 2 条自由组合成 6 对 TALEN 打靶序列, 如图 1B 所示, 左臂骨架质粒均为嘌呤霉素 N- 乙酰转移酶 (PAC) 基因标记, 右臂骨架质粒均为 egfp 标记细胞培养和转染 HEK293T 用含有 10% 胎牛血清的高糖 DMEM 培养液置于 37 C 5% CO 2 温箱中培养转染前 12~16 h, 以 / 每孔 HEK293T 细胞的密度接种至 6 孔板, / 每孔的密度接种至 24 孔板 6 孔板转染 TALEN 质粒, 每孔左右臂质粒各 2 µg 24 孔板转染插入 sgrna 的 pemt/sgrna 质粒, 500 ng/ 每孔, px260 质粒 1 µg/ 每孔 4~6 h 后换培养基 T7E1 酶切分析检测突变效率转染后 24 h 使用 2 µg/ml 嘌呤霉素 (puromycin) 筛选阳性转染细胞约 2~3 d 后收集经过 puromycin 筛选且生长良好的细胞, 提取基因组 DNA, 使用 La Taq 酶进行 PCR, 使用引物 : T7E1-XIST-PROMOTER-F: 5 -TCC CTT GAA GAT GGT ACT AAC CTC A-3 ; T7E1-XIST- PROMOTER-R: 5 -GGA GGA CGT GTC AAG AAG ACA CTA-3 之后使用普通 DNA 产物纯化试剂盒将 PCR 产物进行纯化纯化后的 DNA 采用以下程序进行退火 : 98 C 5 min, 一个循环 ; 98 C 30 s, 之后每 30 s 降 1 C, 60 个循环后降至 39 C 取 500 ng 退火产物进行 T7E1 酶切, 37 C 酶切 30 min 后电泳拍照极限稀释法进行单克隆的培养对经过 puromycin 筛选且生长良好的细胞进行计数, 以 0.5~0.8 细胞 / 每孔的密度接种至 96 孔板生长 7~12 d 后在 4 倍物镜下观察细胞, 将只含有一个圆滑细胞群落且群落大小适当 [ 约 (0.5~5) 10 3 细胞 ] 的孔视为单克隆细胞所在的孔直接 PCR 和片段分析将生长 7~12 d 之后的单克隆细胞从 96 孔板上转移, 一半分至 24 孔板继续培养, 另一半使用 TransDirect Animal Tissue PCR Kit 进行 PCR, 使用引物 : Xist fam -F: 5 -GAA AAC CCA TTG AAG TTG TGA C-3 (5 FAM 标记 ); Xist fam -R: 5 -AAA TAC GCC ATA AAG GGT GTT-3 PCR 产物稀释后, 使用 ABI 公司的 3730 DNA Analyzer 进行片段分析, 判断打靶位点敲除或插入的片段长度定量 PCR 经过 puromycin 筛选生长良好的细胞除抽提基因组和接种单克隆之外, 一部分用 Trizol 处理抽提 RNA, 逆转录 200 ng 成 cdna 备用使用 ABI ViiA 7 实时荧光定量 PCR 系统进行检测, RPL13A 作为内参使用引物序列如下 : RPL13A 上游引物序列 : 5 - CCT GGA GGA GAA GAG GAA AGA GA-3 ; RPL13A 下游引物序列 : 5 -TTG AGG ACC TCT GTG TAT TTG TCA A-3 XIST 上游引物序列 : 5 -CCA TTG AAG ATA CCA CGC TGC-3 ; XIST 下游引物序列 : 5 -GGT TGT TGC CCA GTG GTA GTG 统计学分析实验数据以 x _ ±s 表示, 采用 GraphPad Prism 5 软件

4 4 研究论文进行统计学数据分析, 多组间单因素比较采用 Oneway ANOVA 检验 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 sgrna 和 TALEN 质粒的设计和构建 Hendrich 等使用荧光素酶报告基因实验证明, XIST 基因上游约 20~40 bp( 图 1B 所示下划线部分 ) 处对 XIST 的转录非常重要这一段的突变和缺失可以导致荧光素酶的显著下调甚至不表达我们针对这一段序列设计 sgrna 和 TALEN 质粒 ( 图 1B) 合成 sgrna-x1 和 sgrna-x2 相关的单链寡核苷酸, 退火形成带有黏性末端的双链 DNA 后连接到经过 BbsI 酶切的 pemt/sgrna 质粒上, 得到 pemt/ sgrna-x1 和 pemt/sgrna-x2, 测序表明质粒序列正确 TALEN 质粒的构建参照斯丹赛生物技术有限公司的 FastTALE TM TALEN 试剂盒构建, 测序结果也表明质粒序列正确 2.2 转染 293T 细胞和鉴定基因组突变效率在 293T 细胞中转染相关质粒, 24 h 后加 2 µg/ml 的 puromycin 筛选未转染的细胞作为阴性对照, 待阴性细胞全部死亡后换无 puromycin 培养基, 培养 2~3 d, 待细胞生长至足够的数量且状态良好时, 一部分细胞抽提基因组 DNA 用于鉴定基因组打靶位置突变效率 T7E1 酶识别并切割不完全配对的双链 DNA 经 CRISPR/Cas9 或 TALEN 处理过的细胞, 其基因组有相当一部分发生了突变该位点突变的基因组 DNA 的 PCR 产物和野生型基因组 DNA 的 PCR 产物随机退火, 形成不完全配对的双链 DNA NEB 的 T7EI 酶可以精确识别至少一个碱基的错误匹配从而完成双链的切割, 酶切效率可以反应突变效率 T7E1 酶切分析实验检测突变效率结果如图 2 所示, 针对 XIST 的核心启动子, CRISPR/Cas9 的效率明显高于 TALEN 也可以直接将 PCR 产物进行测序用来检测突变效率, 突变位点将有套峰出现, 但是该方法并不能准确地量化突变效率, 并且没有 T7E1 酶切分析实验灵敏, 例如图 2D 所示结果对应的样本使用测序方法检测没有显示套峰, 图 2C 所示样本可显示明显的套峰套峰形式如图 4B 所示 2.3 CRISPR/Cas9 和 TALEN 对 XIST 表达的影响经过 puromycin 筛选的细胞生长状态良好后, 取一部分细胞用 Trizol 处理, 提取 total RNA, 使用定量 U6 forward primer:5 3 BbsI sgrna primer:5 3 PCR tracrrna BbsI Direct repeat T T U6 promoter Direct repeat tracrrna Insert into pemt vector U6 chimeric RNA pemt/sgrna (B) 5 3 sgrna-x1 PAM PAM sgrna-x2 TALEN L1- TALEN R1- TALEN L2- TALEN R2- TALEN L3- A: sgrna 表达载体的构建 ; B: sgrna 和 TALEN 靶向位置示意图 A: the construction of sgrna expression vector; B: the location of the sgrnas and TALEN targets. 图 1 sgrna 和 TALEN 质粒的设计和构建 Fig.1 The design and construction of sgrna and TALEN plasmids

剌婷等 : 利用 CRISPR/Cas9 系统和 TALEN 技术干预 XIST 基因的表达 5 PCR 方法检测 CRISPR/Cas9 和 TALEN 对 XIST 表达的影响 ( 图 3) 我们发现, CRISPR/Cas9 和 TALEN 对 XIST 的表达都有一定干扰作用由于双链断裂后引发的修复是随机的, 从 T7E1 酶切分析实验结果看,

digestion A 和 C: CRISPR/Cas9 处理组泳道 1: 50 bp DNA ladder marker; 泳道 2: px260+pemt/sgrna-x1; 泳道 3: px260+pemt/sgrna-x2; 泳道 4: px260+pemt/sgrna-x1+pemt/sgrna-x2; 泳道 5: px260; B 和 D: TALEN 处理组泳道 6: 50

5 剌婷等 : 利用 CRISPR/Cas9 系统和 TALEN 技术干预 XIST 基因的表达 5 PCR 方法检测 CRISPR/Cas9 和 TALEN 对 XIST 表达的影响 ( 图 3) 我们发现, CRISPR/Cas9 和 TALEN 对 XIST 的表达都有一定干扰作用由于双链断裂后引发的修复是随机的, 从 T7E1 酶切分析实验结果看, 还有相当一部分细胞的基因组未发生突变, 且突变的细胞基因型也不尽一致因此, 这种表达水平的 CRISPR/Cas9 TALEN (B) bp 300bp (C) 600bp 300bp (D) (B) PCR product After T7/E1 enzyme digestion A 和 C: CRISPR/Cas9 处理组泳道 1: 50 bp DNA ladder marker; 泳道 2: px260+pemt/sgrna-x1; 泳道 3: px260+pemt/sgrna-x2; 泳道 4: px260+pemt/sgrna-x1+pemt/sgrna-x2; 泳道 5: px260; B 和 D: TALEN 处理组泳道 6: 50 bp DNA ladder marker; 泳道 7: TALEN L1+TALEN R1; 泳道 8: TALEN L1+TALEN R2; 泳道 9: TALEN L2+TALEN R1; 泳道 10: TALEN L2+TALEN R2; 泳道 11: TALEN L3+TALEN R1; 泳道 12: TALEN L3+TALEN R2; 泳道 13: 未转染的 293T 细胞 C 和 D: T7E1 酶切实验鉴定突变效率, 每道为 500 ng 退火产物酶切后的结果 A and C: CRISPR/Cas9 treated group. lane 1: 50 bp DNA ladder marker; lane 2: px260+pemt/sgrna-x1; lane 3: px260+pemt/sgrna-x2; lane 4: px260+pemt/sgrna-x1+pemt/sgrna-x2; lane 5: px260. B and D: TALEN treated group. lane 6: 50 bp DNA ladder marker; lane 7: TALEN L1+TALEN R1; lane 8: TALEN L1+TALEN R2; lane 9: TALEN L2+TALEN R1; lane 10: TALEN L2+TALEN R2; lane 11: TALEN L3+TALEN R1; lane 12: TALEN L3+TALEN R2; lane 13: No treat 293T cells. C and D: T7E1 assay for mutation efficiency. 500 ng annealing product digested by T7E1 enzyme per lane. 图 2 CRISPR/Cas9 或 TALEN 针对 XIST 核心启动子的突变效率 Fig.2 The indel (insert and deletion) of XIST core promoter after treated by CRISPR/Cas9 or TALEN Relative RNA expression XIST *** (B) Relative RNA expression XIST *** ** 0.0 L1+R1 L1+R2 293T-TALEN L2+R1 L2+R2 L3+R1 L3+R2 no treat 0.0 Cas9+sgRNA X1 Cas9+sgRNA X2 Cas9+sgRNA X1+X2 Cas9 定量 PCR 检测不同处理组 XIST 的表达水平 ***P<0.0001, **P< T-Cas9 XIST expression was detected by Q-PCR. ***P<0.0001, **P<0.01. 图 3 CRISPR/Cas9 和 TALEN 对 XIST 表达的影响 Fig.3 The XIST expression interfered by CRISPR/Cas9 and TALEN

6 6 研究论文 (C) Wild type (B) (D) Mutation A: 未处理的 293T 细胞测序结果 ; B: 突变后的单克隆测序结果 ; C 和 D: 片段分析显示靶位点的缺失, 其中 D 为野生型 A: the sequence of no treat 293T cell; B: the sequence of mutation monoclone; C and D: the fragment analysis shows monoclone with various sizes of mutation, and D means wild type. 图 4 测序和片段分析技术鉴定单克隆基因型 Fig.4 Sequencing and fragment analysis for the genotype identification 改变反映的是 CRISPR/Cas9 和 TALEN 系统对 XIST 表达的细胞群体水平的改变结合 T7E1 酶切分析实验和定量 PCR 的结果, 我们发现 CRISPR/Cas9 处理的细胞整体突变效率高, px260+pemt/sgrna-x1 组合有更高的敲低效果 ; TALEN 整体突变效率低, TALEN L1+TALEN R2 和 TALEN L3+TALEN R1 组合突变效率极低, TALEN L2+TALEN R2 组合整体敲低效率高 2.4 极限稀释法获得单克隆细胞和单克隆细胞的鉴定由于 CRISPR/Cas9 和 TALEN 是针对基因组的修饰, 它们对基因组碱基的突变可以通过 DNA 复制稳定遗传, 即敲低作用也可以随着细胞的增殖和 DNA 的复制得到保留因此我们可以挑选单克隆, 得到基因型确定的细胞株将 px260+pemt/sgrna-x1+pemt/sgrna-x2 处理过的细胞使用极限稀释法获取基因型确定的单克隆细胞如实验方法所示, 待细胞生长 7~12 d 之后挑选只含有一个圆滑细胞群落且群落大小适当 [ 约 (0.5~5) 10 3 细胞 ] 的细胞群落视作单克隆将细胞吹打下来之后取一半使用 TransDirect Animal Tissue PCR Kit 裂解进行直接 PCR, 另一半继续培养, 留待后续使用 PCR 产物可直接测序, 因为得到等位基因序列一致的突变体纯合子是小概率事件, 出现测序套峰可以表示该细胞基因组发生突变 ( 图 4B), 无套峰的单克隆细胞则根据序列判断是否为野生型使用 FAM 标记的引物进行 PCR 所得产物, 可以使用 ABI 公司的 3730 DNA Analyzer 对其进行毛细管电泳, 毛细管电泳可以依赖 PCR 产物分子量与泳动位移的正比关系得到 PCR 产物的相对大小, 从而判断各个单克隆细胞株的目标位点是否缺失或者插入碱基 ( 图 4C 和图 4D), 这种鉴定单克隆细胞基因型的方法可以检测出 1~2 bp 的缺失或者插入我们使用上述提到的鉴定单克隆的两种方法对所得的一部分单克隆细胞进行了鉴定, 鉴定结果表明, 和 T7E1 酶切分析实验结果一致, 针对 XIST 的核心启动子区域, CRISPR/Cas9 有更高的切割突变效率除以上两种方法之外, 还可以使用 TA 克隆测序的方法鉴定单克隆细胞的基因型, 这是一种较以上两种方法成本高但是更准确的方法将 PCR 所得片段插入到 T 载体上, 转化后每一种单克隆细胞挑选 12 个单克隆细菌抽质粒进行测序, 理论上认为每种单克隆细胞的等位基因同位点的各种基因型都可以被检测到 2.5 单克隆细胞 XIST 的表达从经过 px260+pemt/sgrna-x1+pemt/sgrna- X2 组合处理后的单克隆细胞中挑选生长状态良好的单克隆细胞抽提 RNA, 使用定量 PCR 检测 XIST 表达如图 5A 所示, 9 和 11 号单克隆表达量最低同时通过 TA 克隆得到各单克隆细胞具体的基因型如图 5B 所示, 每种单克隆测序 12 个连接产物, 8 号克

7 剌婷等 : 利用 CRISPR/Cas9 系统和 TALEN 技术干预 XIST 基因的表达 7 XIST (B) Relative RNA expression *** *** *** 9 11 Cas9 no treat A: 单克隆和对照组 (Cas9 和 no treat) XIST 的相对表达量 ***P<0.0001, 与 Cas9 组比较 A: the relative expressions of XIST of the monoclones and control groups (Cas9 and no treat). ***P< compared with Cas9 group. 图 5 单克隆细胞中 XIST 的表达 Fig.5 The XIST expression of monoclones 隆有一条 X 染色体是野生型, 其整个细胞系 XIST 的表达和野生型相当 Hendrich 等发表的 XIST 核心启动子如图 5B 灰色部分所示, 该 18 个碱基在荧光素酶报告系统中显示了非常重要的调节转录的能力如图 5 所示, 在 293T 细胞中, 针对 XIST 核心启动子敲低 XIST 的表达, 有一个等位基因是野生型的杂合子敲低作用并不明显, 如 8 号克隆而敲低作用明显的 9 号和 11 号克隆, 其等位基因都在核心启动子的中间位置有较长片段的缺失 3 讨论 XIST 是雌性哺乳动物细胞中维持 X 染色体失活的最主要的基因 XIST 的异常会引发发育异常或者癌症等疾病的发生目前, 科学家们对 XIST 在 X 染色体沉默过程当中的行为做了一些研究, 但是针对 XIST 与其他分子的相互作用 XIST 在疾病发生中的具体行为还有待研究, 本文为这些工作的开展奠定了一定的技术基础此外, 本文结果表明 XIST 核心启动子区域的突变可干预其表达, 这提示我们在其他长链非编码 RNA 基因功能的研究工作中, 也可以根据实际需要在准确定位关键调控序列后对启动子进行编辑来操控长链非编码 RNA 的表达水平继锌指酶之后, TALEN 和 CRISPR/Cas9 技术使得基因组修饰技术的效率大大提高, 更加易于操作, 并且很大程度上降低了基因组修饰的成本与 TALEN 相比, 从切割位点和特异性来看, CRISPR/ Cas9 更易脱靶决定 TALEN 切割位点的序列比 CRISPR/Cas9 长, 因此更加特异 CRISPR/Cas9 由于与靶基因结合的序列只有 20 个碱基, 并且在远离 PAM 结构的 5 端碱基与靶基因不完全互补的情况下 [22-24] 也可引起靶点的切割, 使得其脱靶的概率增加科学家们尝试了许多新的方法用来改善 CRISPR/ [25-26] Cas9 的脱靶问题, 这些方法针对 Cas9 进行了修饰, 都取得了良好的效果, 使得 CRISPR/Cas9 在基因组上的操作更精确此外, 一些文章还从全基因组层次对 CRISPR/Cas9 技术的特异性进行了研究, 全 [27-28] 基因组测序证明该技术引起的脱靶是有限的, 基因组编辑主要针对目标位点基因组编辑的效率决定基因组编辑的成功与否检测靶点位置的突变效率, 可以采用多种方法 T7E1 酶切分析是最常用且较灵敏的一种方法除此之外, 还有 PCR 产物直接测序的方法, 这种方法对于突变效率较高的细胞群体会显示套峰, 既可以用来检测突变效率, 也可用来指标单克隆细胞的基因型是否为野生型但是套峰的多少和高低并不能量化指标突变效率的高低与此同时, 该方法不能检

8 8 研究论文出突变效率较低的样本另一方面, 当测序样本纯化不理想时, 主峰下方也会出现较低的杂峰片段分析目前还没有被大家广泛用到, 该方法主要用于检测片段缺失和插入的大小, 它既可以检测本文提到的单克隆细胞的靶点缺失或插入, 也可以检测群体细胞靶点位置缺失或插入的情况, 片段分析峰值的高低可以用来评估该基因型在总样本中的频率如果实验目的是为了得到一定长度序列缺失的细胞, 可以使用该方法检测整体突变效率以及所得目的片段缺失的细胞的多少片段分析只需要极少量的样本就可以检测样本在毛细管中电泳之后, 微量的荧光信号就可以被捕捉到, 因此该方法对 PCR 引物的特异性要求很高, 即使少量的非特异性扩增也可以被检测到所以该方法必须使用特异性非常好的引物, 否则易出现假阳性相比 TALEN 复杂的模块组合, CRISPR/Cas9 更容易操作 CRISPR/Cas9 只需设计一段毗邻 -NGG 结构的 20 个碱基的 sgrna 即可与此同时, 包括本文在内, 还有其他文献证实, 针对某些具体的位点, CRISPR/Cas9 的效率高于 TALEN [29-31] 但是如本文图 3 所示, TALEN 的干预效率高于 CRISPR/Cas9, 这一结果与突变效率不一致这部分检测的 RNA 来自于 puromycin 处理后大约生长 2~3 d 的细胞, 较生长后的单克隆细胞, 该细胞内相关质粒的表达产物有更多的富集 ( 曾使用 PAC 基因的引物检测过 ) 我们猜测除了基因组突变导致的敲低作用以外, TALEN 和 CRISPR/Cas9 质粒在细胞内所转录出的结合基团或者核酸酶特异结合在 XIST 核心启动子区, 阻碍 RNA 转录相关的酶和蛋白复合物, 从而抑制了 RNA 的表达对于单克隆细胞基因型的鉴定, 我们使用了直接 PCR 的方法因为单克隆细胞生长较慢, 我们要从一个细胞增殖得到足够抽提基因组 DNA 的细胞需要很长的时间直接 PCR 将少量细胞裂解处理, 使用裂解液为模板进行 PCR 根据我们的经验, 大约个细胞就可以使用直接 PCR 的方法得到可检测到的目的片段的 PCR 产物基本上所有的单克隆都可以在 12 d 内生长至这个数量直接 PCR 为我们节省了工作时间和细胞传代所耗费的成本本文并没有挑选到 XIST 表达量特别低的单克隆细胞系图 3 中部分 XIST 的整体下调程度也超过了单克隆所示的结果, 我们在实验中观察到, 与针对其他基因突变的细胞相比, 针对 XIST 核心启动子突变的细胞生长速度明显低于其他细胞我们猜测 XIST 明显下调的细胞系在挑选单克隆的过程中由于生长缓慢或者增殖能力的欠缺无法长成相应的单克隆, 从而导致我们无法得到 XIST 明显下调的单克隆细胞系敲除 XIST 可影响 X 染色体的失活, 导致一系列 X 染色体上的基因表达异常 XIST 敲除小鼠会死于原肠胚形成期针对 293T 细胞而言, 敲除 XIST 是否会影响细胞增殖和生长, 还有待后续研究对于检测单克隆基因型的 TA 克隆测序实验, 由于所测样本数量限制, 没有得到 XIST 表达量和具体基因型的对应关系如果突变位点有更重要的意义, 可以参考本文所示方法进行测序检测, 例如遗传学上功能重要的多态性位点此外, 还可以在转染本文所示的质粒的基础上共转同源臂, 同源臂的设计根据自己的需求, 从而获得各种基因型确定的细胞, 但是这种方法的效率较低针对 XIST 的敲除, 传统的方法是利用 Cre-LoxP 重组酶系统进行大片段的缺失, 相对来说难度大, 效率低本文的方法无法像 Cre-LoxP 重组酶系统一样使得 XIST 完全不表达, 但是其操作更容易 Matoba [17] [32] 等和 Oikawa 等使用 sirna 针对小鼠的 XIST 进行了敲低, 这种方法会在某一时期敲低 XIST, 但并非如针对基因组的编辑可以使 XIST 长期低表达对于需要大量使用某种敲低或者敲除的细胞进行实验的情况, 采用 CRISPR/Cas9 技术所建立的相应的细胞系是更好的选择参考文献 (References) 1 Lyon M. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L.). Nature 1961; 190: BEUTLER E, YEH M, FAIRBANKS VF. The normal human female as a mosaic of X-chromosome activity: Studies using the gene for C-6-PD-deficiency as a marker. Proc Natl Acad Sci USA 1962; 48: OHNO S, KAPLAN WD, KINOSITA R. Formation of the sex chromatin by a single X-chromosome in liver cells of Rattus norvegicus. Exp Cell Res 1959; 18: Clemson CM, McNeil JA, Willard HF, Lawrence JB. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol 1996; 132(3): Jeon Y, Lee Jeannie T. YY1 tethers XIST RNA to the inactive X nucleation center. Cell 2011; 146(1): Kalantry S, Purushothaman S, Bowen RB, Starmer J, Magnuson T. Evidence of XIST RNA-independent initiation of mouse imprinted X-chromosome inactivation. Nature 2009; 460(7255):

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分子生物学实验专题手册.ai >> 2002 Piscataway CRO OptimumGene TM CloneEZ ONE-HOUR Western TM THE TM Epitope Tag 36 36 39 40 41 41 41 45........................ 47 47 47 47 48............... 19 19 20 21 22............... 23 23 24