第 35 卷绵阳师范学院学报 ( 自然科学版 ) 试验引物根据 Genbank 提供的副猪嗜血杆菌 16SrRNA 基因序列设计引物 (P1:5 -GTGAT GAGGAAGGGTGGTGT-3,P2:5 -GGCTTCGTCACCCTCTGT-3 ), 扩增 822bbp 特异性片

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1 第 5卷 第 8期 年 8月 绵阳师范学院学报 J o o fm y gt c Co g Vo 5 No 8 A g 副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏分析 陈希文 尹 苗 赖守勋 汪 谦 李 莲 韦剑锋 叶兆美 绵阳师范学院动物应用技术研究所 四川绵阳 四川省彭州市畜牧局 四川彭州 9 四川铁骑力士集团冯光德实验室 四川绵阳 摘 要 采用常规细菌分离鉴定方法和分子生物学技术对四川某规模化猪场疑似副猪嗜血杆菌 H mo HPS 感染的病猪关节液 心包液 肺脏等病料进行了致病菌的分离与鉴定 经细菌分离培养特性 生化试 验以及 S DNA序列 PCR扩增 确定分离菌株为 HPS 动物致病性试验结果表明 分离菌株具有较强致病性 药 敏试验表明 该 HPS菌株对青霉素 链霉素 磺胺甲唑 林可霉素 苄唑西林等多数抗生素耐受 而对新霉素 头孢噻 肟等较敏感 关键词 副猪嗜血杆菌 分离鉴定 药敏试验 中图分类号 S 8 5 文献标志码 A 文章编号 7 x 8 5 引言 副猪嗜血杆菌 H mo HPS 是巴斯德菌科 嗜血杆菌属的一种革兰氏阴性细小杆菌 5个血清型 但各地流行的血清型不尽相同 该菌在特定的条 也是猪群上呼吸道的一种常见菌 目前已知 件下可以侵入猪机体 引发一种以脑膜炎 关节炎 多发性浆膜炎等为主要特征的传染病 又称为猪革拉斯 D 严重危害着养猪业的发展 该菌主要影响 周龄到 4月龄的猪 以 周龄 氏病 G 5 左右 但严重时该病可造成 5 以上的猪死亡 4 该病的主要临床 保育猪尤为明显 通常发病率在 症状表现为呼吸困难 消瘦 咳嗽 被毛粗乱 全身发红 尖叫 卧行 体温高达 4 4 败血症 急性肺炎 等 5 主要剖检变化为关节炎 脑膜炎 淋巴结肿大 心包炎 纤维素性胸膜炎等 随着养猪设备的升级和 劳动力成本的提高 养猪业逐步走向高度的密集化和规模化 从而导致猪群呼吸道问题更加突出 诱发副 猪嗜血杆菌病发生的几率也越来越大 对整个养猪业的经济损失也日趋严重 近年来 各地已相继报道多 起由副猪嗜血杆菌引起的断奶仔猪关节炎 脑膜炎和多发性浆膜炎等疫情 特别是在集约化程度高 而蓝 耳病和圆环病毒病又不稳定的猪场 一旦继发副猪嗜血杆菌病 造成的经济损失非常严重 7 当前 由副 猪嗜血杆菌引起的疾病已逐渐成为危害世界养猪业的重要疾病 已引起了业界的广泛关注 由于副猪嗜血 杆菌血清型多 产生耐药性快 致使临床疫苗免疫和用药效果不理想 给该病的预防和治疗带来很大的困 难 8 本研究对四川某规模化猪场出现疑似 HPS感染症状的保育猪病料进行了病原分离鉴定和药敏试 验 为副猪嗜血杆菌病临床选择敏感有效的药物提供科学依据 材料和方法 材料 试验样品 无菌采集于四川某规模化猪场发生纤维素性心包炎 浆膜炎 关节炎及脑膜炎症状的 保育猪肺脏 心包积液 关节液及脑组织等 8 g 只 四川实验动物中心提供 试验动物 只昆明小白鼠 收稿日期 基金项目 四川省科技厅和重点实验室项目 J Y7 ESP5 5 四川省教育厅自然科学研究项目 ZA 作者简介 陈希文 97 7 男 四川宜宾人 博士 副教授 研究方向 动物疾病防控

2 第 35 卷绵阳师范学院学报 ( 自然科学版 ) 试验引物根据 Genbank 提供的副猪嗜血杆菌 16SrRNA 基因序列设计引物 (P1:5 -GTGAT GAGGAAGGGTGGTGT-3,P2:5 -GGCTTCGTCACCCTCTGT-3 ), 扩增 822bbp 特异性片段, 由大连宝生物公司合成 主要试剂及培养基新生小牛血清 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) PCR 反应试剂盒, 胰蛋白大豆琼脂 (TSA) 胰蛋白大豆肉汤 (TSB); 微量生化发酵管 药敏纸片 ( 购自杭州微生物试剂有限公司 ) 主要仪器电子天平 (JT12001), 高压灭菌锅 (SANYO), 无菌操作台 (SP-DJ), 光学显微镜 (SA3000), 恒温培养箱 (PYX-DHS), 恒温摇床 (HZ-9311K) 1.2 方法 采样无菌采集最近 3d 内未使用抗生素治疗并且在采样 4h 内的病猪肺脏 心包积液 关节液及脑组织等病料 HPS 的分离纯化将采集的样品立即接种到含 NAD 和 10% 新生小牛血清的 TSA 固体培养基和液体培养基, 置含有 5% CO 2 的培养箱,37 恒温培养 12h, 从培养基上挑取大小约 1mm 的半透明或灰白色菌落涂抹于载玻片, 用革兰氏染色技术进行初步判断, 并将疑似 HPS 菌落接种于另一新鲜含 NAD 和 10% 新生小牛血清的 TSA 培养基进行纯化, 反复多次上述操作, 直到获得纯 HPS 菌落, 具体方法参见文献 [9] HPS 的生化鉴定挑取经上一步纯化的疑似单菌落, 接种于新鲜含 NAD 和 10% 新生小牛血清的 TSA 培养基, 经 37 培养 12h 后, 再接种于含尿酶 接触酶 氧化酶 硝酸盐还原 葡萄糖 吲哚 蔗糖 半乳糖 果糖 麦芽糖和核糖等微型生化鉴定管, 分别加入 8μL 新生小牛血清和 2μL0.05% NAD, 置 37 培养 48h, 并按试剂盒说明书进行结果判断 HPS 的 PCR 鉴定用接种环挑取 3-5 个纯培养菌落, 溶于 100μL 无菌蒸馏水中, 煮沸 10min 后置 -20 冷冻保存 40min 再室温融化, 经 8000r/min 离心 6min 后, 取上清液作为分离菌株 PCR 鉴定模板 反应体系 (50μL 体系 ):10 PCRBufer5μL,dNTPs(10mmol/L)1μL, 上游引物 (20pmol/μL)0.5μL, 下游引物 (20pmol/μL)0.5μL,DNA 模板 5μL,ddH 2 O37.5μL 反应条件 :95 预变性 5min;94 1min, 56 45s,72 1.5min,32 个循环 ; 再 72 10min 反应产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测合格后, 送宝生物公司测序 HPS 的致病性试验将已纯化的菌株接种于 TSA 平板, 置 37 培养 18-24h, 用灭菌生理盐水洗下, 制成 个 /ml 的菌悬液备用 将 10 只昆明小白鼠随机分成 2 组, 取制备的菌悬液腹腔注射 5 只小白鼠 0.2mL/ 只, 另外 5 只作为对照组注射生理盐水 0.2mL/ 只 各组小白鼠分开饲养, 每天观察和记录小白鼠的发病情况, 对死亡的小白鼠, 立即剖解, 并无菌取其心血 脾脏 肝脏等病料接种于 NAD 和 10% 新生小牛血清的 TSA 培养基进行细菌分离 HPS 的药敏试验采用美国临床实验室标准 (NationalCommiteeforClinicalStandardsNCCLS) 方法进行药敏试验, 具体方法参考文献 [10] 2 结果 2.1 菌株分离分离纯化后的菌在含有 NAD( 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 ) 的 TSA 平板上 37 培养 24-48h, 可见边缘整齐 光滑 湿润 无色 透明约针头大小的菌落 ( 图 1) 分离菌在不含 NAD 的 TSA 平板上不生长 经革兰氏染色镜检, 可见 G- 短杆菌 无芽孢和鞭毛, 菌体的形态多样, 其中以短杆状居多, 但也有长丝状 球状 弯曲丝状等形态 ( 图 2)

3 3 陈希文等 : 副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏分析第 8 期 图 1 HPS 在 TSA 的菌落形态 Fig.1 ThecolonymorphologyofHPSonTSA 图 2 HPS 革兰氏染色结果 Fig.2 Gram stainingresultsofhps 2.2 HPS 的鉴定生化鉴定结果表明, 获得的 HPS 疑似菌株能发酵乳糖 蔗糖 葡萄糖 ; 不发酵甘露醇 山梨醇 ; 氧化酶 明胶 V-P 尿素酶阴性 ; 吲哚 甲基红阳性, 详细结果见表 1 PCR 及测序结果表明, 分离菌株能扩增出约 822bp 的特异性目的片段, 大小与预期相符, 对照样品无任何条带, 详细结果见图 3 图 4 综合分离菌的培养特性 菌落形态 生理生化反应以及 PCR 鉴定结果, 可确定此分离菌为副猪嗜血杆菌 表 1 HPS 的生化反应 Tab.1 ThebiochemicalreactionsofHPS 实验项目葡萄糖乳糖蔗糖甘露醇山梨醇氧化酶明胶 V-P 吲哚甲基红尿素酶实验结果 注 : - 表示阴性, + 表示阳性 2.3 致病性试验致病性试验结果表明, 接种菌液的试验组小白鼠喜卧 精神萎靡 食欲降低 反应迟钝, 并在 48h 内先后发病或死亡 解剖结果表明, 病变主要集中在肺脏, 有出血和水肿现象 其中 3 只在接种后 24h 内死亡,2 只在 48h 内死亡, 而对照组小鼠均健康存活, 无明显症状 对死亡小白鼠剖解采集心血进行种菌回收试验表明, 都能分离到形态特征及生化特性与副猪嗜血杆菌相符合的菌, 且均能扩出大小为 821 的副猪嗜血杆菌 16SrRNA 基因特异性片段 以上结果表明, 该分离菌株确为 HPS, 且是致病性较强的菌株 2.4 药敏试验图 3 副猪嗜血杆菌 16SrRNA HPS 药敏试验结果表明, 该分离菌株对新霉素 头孢噻肟 头孢三嗪 基因的 PCR 特异性扩增结果氧氟沙星 头孢拉啶等较敏感, 对青霉素 链霉素 磺胺甲唑 林可霉素 苄 Fig.3 SpecificityofPCR 唑西林等多数抗生素耐受 详细结果见表 2 forhaemophilusparasuis

4 第 35 卷绵阳师范学院学报 ( 自然科学版 ) 4 图 4 副猪嗜血杆菌 16SrRNA 基因的 PCR 特异性扩增序列片段 Fig.4 SpecificitySequenceofPCRforHaemophilusparasuis 表 2 HPS 药敏试验 Tab.2 ThedrugsusceptibilitytestofHPS 抗生素 抑菌圈直径 /mm 抗生素 抑菌圈直径 /mm 抗生素 抑菌圈直径 /mm 头孢噻肟 28 林可霉素 0 氯霉素 19 头孢三嗪 23 氧氟沙星 21 青霉素 0 头孢他啶 19 四环素 11 链霉素 0 头孢唑啉 11 多粘菌素 B 0 庆大霉素 13 磺胺甲唑 / 甲氧苄啶 0 氨苄西林 / 舒巴坦 20 乙酰螺旋霉素 0 左氧氟沙星 19 头孢曲松 19 卡那霉素 17 痢特灵 18 苄唑西林 0 头孢拉啶 20 环丙沙星 17 羧苄西林 0 新霉素 31 3 讨论 随着规模化 集约化养猪的发展, 副猪嗜血杆菌病在我国各大猪场的带菌率 发病率和死亡率均呈上升趋势, 给我国的养猪业造成了巨大的经济损失 [11] 当前, 由于我国养殖环境的恶化, 猪病复杂多样, 病原错综复杂, 很难从临床症状确定病原菌 对于副猪嗜血杆菌病的鉴定, 依然主要依靠细菌的分离鉴定, 但由于副猪嗜血杆菌的培养较其它细菌营养要求高, 因而在临床实践中较难分离到菌株, 需在培养基中添加特殊的营养因子如 NAD 和小牛血清等, 才能提高分离的成功率 [12] 此外, 由于目前各养猪场在实际养殖过程中广泛使用抗生素, 这也是造成副猪嗜血杆菌分离率比较低的原因之一 [13] 本研究在分离病原菌时, 先对病猪临床症状进行初步诊断后, 要求养猪场主对患病猪停用抗生素 3d 后, 再采集患病猪的关节液 心包液等作为病料样品 同时, 在患病猪采样后 4h 内接种培养基进行病原菌的分离 通过以上几种措施, 大大提高了副猪嗜血杆菌的分离率 通过对分离菌的培养特性 菌落形态 生理生化反应以及 PCR 鉴定结果的综合分析, 可确定该分离菌为即为副猪嗜血杆菌, 为该病的临床防治和进一步的实验研究提供了科学依据 目前, 副猪嗜血杆菌存在多个血清型, 已确定的有 15 个 [14] 在已鉴定的血清型中, 强毒株有 和 14 型, 中等毒株有 型, 无毒力菌株有 和 11 型, 另有 20% 以上的菌株不能定型 [15-16] 由于副猪嗜血杆菌血清型众多, 交叉免疫保护性很弱, 各地流行菌株差异大, 因此养殖场很难使用到与本场对型的疫苗, 从而造成副猪嗜血杆菌病的疫苗免疫效果普遍不理想 因此, 在副猪嗜血杆菌病的防控方面, 采用对本场流行菌株进行分离鉴定并进行药敏试验筛选敏感药物进行保健和治疗成为防控该病的关键 同时, 由于 HPS 不仅血清型多, 而且耐药性产生也快, 因而应定期采集样品分离菌株并做药

5 5 陈希文等 : 副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏分析第 8 期 敏试验, 以便指导生产科学合理有效用药 本研究结果表明, 该发病猪场流行菌株为副猪嗜血杆菌强毒株, 该菌株对磺胺甲唑 林可霉素 苄唑西林 青霉素 链霉素等多数抗生素耐受, 而对新霉素 头孢噻肟 头孢三嗪 氧氟沙星 头孢拉啶等较敏感 因此, 在临床用药时, 应该根据药敏实验结果, 选择新霉素 头孢噻肟等敏感药物对该病进行治疗 参考文献 : [1] 赵德明, 张仲秋, 沈建忠, 等. 猪病学 [M]. 北京 : 中国农业大学出版社,2002, [2] 蔡旭旺. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究 [D]. 武汉 : 华中农业大学,2006,6. [3] 刘俊伟, 陈俊杰, 陈金山, 等. 副猪嗜血杆菌河南株的分离鉴定及药敏试验 [J]. 西北农业学报,2011,20(2): [4] 陈薄言. 兽医传染病学 [M]. 北京 : 中国农业出版社,2006, [5] 高鹏程, 储岳峰, 逯忠新, 等. 副猪嗜血杆菌病原的分离鉴定与药敏试验 [J]. 动物医学进展,2007,12(28):2729. [6] 薛国聪, 徐成刚, 涂玉蓉, 等. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验 [J]. 中国畜牧兽医,2010,37(1): [7] 李晓华, 杨小燕, 郑新添, 等. 副猪嗜血杆菌的分离与鉴定 [J]. 中国畜牧兽医,2010,37(2): [8] 高丰, 罗毅, 成军, 等. 副猪嗜血杆菌感染的诊断与防治 [J]. 动物医学进展,2002,23(6): [9] 李雪松, 陈欣, 符芳, 等. 副猪嗜血杆菌黑龙江株的分离与鉴定 [J]. 中国预防兽医学报,2011,33(3): [10] 陈希文, 郭晓萍, 王雄清, 等. 圈养猕猴志贺氏菌的分离鉴定及药敏分析 [J]. 四川动物,2012,31(2): [11] 李志勇. 海南省规模化猪场副猪嗜血杆菌病的分子流行病学调查和综合防治措施 [D]. 南宁 : 广西大学,2010,05. [12] 王丽荣, 杭柏林, 赵春梅, 等. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定 [J]. 西北农业学报,2007,16(4): [13] 王乐. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定及生物学特性研究 [D]. 洛阳 : 河南科技大学,2014,6. [14] KielsteinP,Rapp-GabrielsonVJ.Designationof15serovarsofHaemophilusparasuisonthebasisofimmunodifusionusing heat-sableantigenextracts[j].journalofclinicalmicrobiology,1992,30(4): [15] 蔡旭旺, 刘正飞, 陈焕春, 等. 副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定 [J]. 华中农业大学学报,2005,24(1): [16] 周斌, 储岳峰, 李超, 等. 华东地区副猪嗜血杆菌的分离 血清型鉴定与药敏分析 [J]. 畜牧与兽医,2009,41(11): IsolationandIdentificationofHaemophilusParasuis anditsdrugsensitivitytest CHENXiwen 1,3,YINMiao 2,LAIShouxun 3,WANG Qian 1,LILian 1,WEIJianfeng 3,YEZhaomei 3 (1.InstituteofAppliedAnimalTechnology,MianyangTeachers Colege,Mianyang,Sichuan ; 2.PengzhouBureauofAnimalHusbandry,Pengzhou,Sichuan611930; 3.FengguangdeLaboratoryofSichuanTieqilishiGroup,Mianyang,Sichuan ) Abstract:IsolationandidentificationofHaemophilusparasuis(HPS)wasconductedusingconventionalmeth odsandmolecularbiologytechniquesforasuspectedpigsinfectedlungs,pericardialefusion,synovialfluidand braintisueandothermaterials.withisolationbybacterialculturecharacteristics,biochemicaltestsandpcr amplificationof16srdnasequences,hpswasidentified.animalpathogenicitytestresultsshowedthatthehps strainswithstrongpathogenicity.susceptibilitytestshowedthatthehpsstrainstopenicilin,streptomycin,sulfa methoxazole,clindamycin,cloxacilinbenzyl,etc.andthatissensitivetoneomycin,cefotaximeandsoon. Keywords:Haemophilusparasuis(HPS),isolationandidentification,drugsensitivitytest ( 责任编辑 : 陈桂芳 )

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