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视沚席
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1 广西医科大学学报 JOURNAL OFGUANGXIMEDICAL UNIVERSITY 2018June ;35(6) 747 mir-342-3p 在鼻咽癌中的表达及意义 * 杜龙, 易翔, 何光耀, 孔令平, 唐安洲 ( 广西医科大学第一附属医院广西区域性高发肿瘤早期防治研究重点实验室, 南宁 ) 摘要目的 : 探讨 mir-342-3p 在鼻咽癌 (NPC) 中的表达及其意义方法 :mirna 芯片检测人永生化鼻咽上皮细胞系 NP69 和低分化 NPC 细胞 CNE2 中 mirna 的差异表达 ; 实时荧光定量 PCR(qPCR) 法检测 NPC 组织中 mir-342-3p 的表达 ;GOand Pathway 分析 mir-342-3p 在 NPC 发生发展中可能涉及的功能及其参与的信号通路结果 :mirna 芯片结果表明,miR-342-3p 在 NPC 细胞 CNE2 中低表达,qPCR 结果进一步证实 mir-342-3p 在 NPC 组织中低表达 ;GO 分析表明, 具有显著差异的 10 个功能中, 与 NPC 发生发展关系较为密切的是 mir-342-3p Pathway 分析显示,miR-342-3p 与丝裂原应激活化蛋白 (MAPK) 信号通路相关性较大结论 :mir-342-3p 的低表达可能与 NPC 的发生和发展相关关键词鼻咽癌 ;mir-342-3p;cne2 中图分类号 :R 文献标志码 :A 文章编号 : X(2018) DOI: /j.cnki /r TheexpresionandsignificanceofmiR-342-3pinnasopharyngealcarcinoma DuLong,YiXiang,HeGuangyao,KongLingping,TangAnzhou.(TheFirstAfiliatedHospitalofGuangxi MedicalUniversity,GuangxiKeyLaboratoryforEarlyPreventionand TreatmentofRegionalHighFrequencyTumor,Nanning530021,China) Abstract Objective:ToinvestigatetheexpressionandsignificanceofmiR-342-3pinnasopharyngealcarcinoma(NPC).Methods:miRNA microarraywasusedtodetectthediferentialexpressionofmirnasinimmortalizednasopharyngealepithelialcels NP69andpoorlydiferentiated NPC CNE2.Real-timefluorescencequantitativePCR(qPCR)wasusedtodetectmiR-342-3pexpressioninNPCtissues.GOandPathway analysiswereusedtoinvestigatetheroleofmir-342-3pintheoccurrenceanddevelopmentofnpc.results: ThemiRNA microarrayresultsdemonstratedthatmir-342-3pwaslowlyexpressedincne2cels.qpcrresultsfurtherconfirmedthatmir-342-3pwaslowlyexpressedinnpctissues.goanalysisshowedthatthe mir-342-3pwascloselyrelatedto NPC.Mitogen-activatedproteinkinase(MAPK)signalingpathway was morecorrelatedwith mir-342-3p.conclusion:low-expressionofmir-342-3pmightberelatedtotheoccurrenceanddevelopmentofnpc. Keywords nasopharyngealcarcinoma;mir-342-3p;cne2 鼻咽癌 (nasopharyngealcarcinoma,npc) 是我国南方和东南亚常见的头颈部恶性肿瘤, 局部复发和远处转移是治疗失败的两个主要因素 [1] 深入了解 NPC 发生生物学进程的分子机制有助于早期诊断 NPC 并提高 NPC 的治疗与预后微小 RNA (microrna,mirna) 是一类长约 22nt 的小分子非编码 RNA, 在转录后水平调控靶基因的表达研究表明, 在多种肿瘤中,miRNA 广泛参与肿瘤发生的 * 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No ; No ); 广西科技攻关项目 (No. 桂科攻 ); 广西教育厅立项项目 (No.KY2016YB094) 通信作者, anzhoutang@126.com 收稿日期 : 各种生物学过程, 包括增殖凋亡侵袭转移血管生成等 [2-5] 有研究表明,miR-342-3p 在非小细胞型肺癌原发性肝细胞癌骨肉瘤等肿瘤中低表达, 参与调控肿瘤细胞增殖分化凋亡等生物学功能, 发挥抑癌基因的作用 [6-9] 但 mir-342-3p 在 NPC 中的表达及其机制尚未见报道, 本研究通过 mirna 芯片和实时荧光定量 PCR(qPCR) 证实 mir-342-3p 在 NPC 中低表达, 并通过生物信息学预测其可能参与的机制和功能, 以期为后续阐明 mir-342-3p 参与 NPC 发生发展的分子机制提供理论依据 1 材料与方法 1.1 实验材料人永生化鼻咽上皮细胞系 (NP69) NPC 细胞 CNE2 均由广西医科大学耳鼻

2 748 喉科实验室保存 ; 胎牛血清 (FBS) DMEM 培养基购自美国 Gibco 公司 ; 胰酶购自北京索莱宝公司 ; KSFM 培养基 TRIzol SYBR 购自上海英潍捷基有限公司 ;U6 上下游引物 mir-342-3p 上游引物 mirna 通用下游引物 Mir-X mirna First-Strand SynthesisKit 均购自大连宝生物工程有限公司 ; SteponeRealTimePCR 仪购自美国 AppliedBiosystems 公司 1.2 组织标本取自 2015 年 1 月至 2016 年 12 月广西医科大学第一附属医院 36 例 ( 男 21 例, 女 15 例 ) 经鼻内镜下鼻咽部活检组织, 其中病理学证实为 NPC 组织 24 例 (n =24), 鼻咽炎性组织 12 例 (n =12) 所有组织样本采集后均立即置于液氮中保存本研究获得广西医科大学伦理委员会批准 1.3 实验方法细胞培养永生化鼻咽上皮细胞系 NP69 用 KSFM 培养基 ;NPC 细胞系 CNE2 用含 10% 胎牛血清 U/L 青霉素 100 mg/l 链霉素的 DMEM 高糖培养基, 放置于 37 5% CO2 饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养总 RNA 提取及质检总 RNA 提取按 Trizol 说明书进行, 用分光光度计测量 RNA 在 260nm/280nm 下吸光度, 确认样品中 RNA 的浓度和纯度,OD260/280 值在 1.8~2.1 之间时, 则表明 RNA 纯度合适 ; 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳观察样品总 RNA28S 和 18S 的比例, 评估 RNA 纯度及完整性样品 RNA 生物素标记将 1μgRNA 样品总 RNA 加入无核酸酶 PCR 管, 以 Nuclease-free Water 补足至 8 μl, 接着加入 2 μl RNA Spike ControlOligos 轻柔混匀 ; 准备好 PCR 管, 每个样本 PCR 管加入 5μL master mix 混合液, 混匀离心 5s, 在 PCR 仪上 37 孵育 15 min, 然后离心 5s, 置于冰上, 加入 4μL5 FlashTagBiotin HSR 连接混合液后再加入 2μL T4 连接酶, 轻柔混匀后离心 5s, 在 PCR 仪上 25 孵育 30min; 离心 5s 加入 2.5μL HSRStopSolution 轻轻混匀后离心 5s 芯片杂交在 PCR 管中加入 6.6μL20 EukaryoticHyBridizationcontrols 放置在 PCR 仪上 65 孵育 5min; 然后把 21.5μL 生物素标记过的样品加入到配置的杂交液中, 混匀后离心 5s, 在 PCR 仪上孵育 99 5 min;45 5 min; 将孵育好的杂交液离心 5s, 用 200μL 移液器将 130μL 杂交液注入芯片中, 加样口用贴纸封住 ; 然后将芯片置于杂交炉架上后放进杂交炉,48 60r/min 杂交 16h 芯片洗涤和扫描结束杂交后, 弃杂交液, 加入 150μLarrayholdingbufer; 手持红外扫描设备在 AFFymetrix Gene Chip Command Console (AGCC) 上扫描芯片条形码, 注册样品信息, 生成与样品相对应的 ARR 芯片文件 ; 将芯片洗涤液 wash A B 和去离子水 (ddh2o) 置入洗涤站的对应位置, 初始化 AGCCFlutionsControl 软件 ; 准备 3 个无核酸 1.5 ml EP 管, 分别加入 600 μl stain Cocktail1 600μLstaincocktail2 和 800μLarray holdingbufer, 置于洗脱站的位置, 然后将芯片插入, 在 AGCCflutionControl 软件洗脱站 Barcode 中扫描芯片条形码以及在 ProbeArrayType 中选择相应芯片类型, 点击运行, 约 1h; 结束后, 将芯片放入 afymetrix 的扫描仪中, 跟着点击 afȳ metrixlauncher 中的 AGCCScanControl 按钮, 然后点击工具栏中的 Star, 数据生成用于分析 qpcr 提取组织总 RNA, 按照 Mir-X mirnafirst-strandsynthesiskit 说明书的操作步骤进行 cdna 逆转录, 作为荧光定量 PCR 的模板荧光定量 PCR 按照 SYBR 说明书进行, 以 U6 作内参,U6 上游引物序列 :5 -GGAACGATA- CAGAGAAGATTAGC-3,U6 下游 :5 -TG- GAACGCTTCACGAATTTGCG-3 ; mir-342-3p 上游 :5 -TCCTCGCTCTCACACAGAAATC-3, mir-342-3p 下游引物为 mirna 通用引物 PCR 反应条件 :95 预变性 2 min;95 3s, 60 30s, 共 40 个循环反应在 Stepone Real timepcr 仪进行, 所得数据经 U6 基因均一化处理, 采用 2 - Ct 方法计算目的基因相对表达量 1.4 统计学方法采用 SPSS17.0 软件进行数据分析, 呈偏态分布的计量资料用中位数 ( 四分位数间距 )[M (P25~ P75)] 表示, 组间比较采用秩和检验, 以 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 样品总 RNA 质检从 NP69 和 CNE2 细胞中提取总 RNA, 分光光度计测量 OD 值, 进一步用甲醛变性凝胶电泳证实总 RNA 中各条带清晰, 无明显降解现象质检结果表明各样品总 RNA 质量符合要求, 可以进行后续实验, 见图 NPC 细胞 mirna 差异性表达通过比较永生化鼻咽上皮细胞 NP69 与 NPC 细胞 CNE2 的基因差异分析, 得到了 177 个差异基因, 其中 mir-342-3p 显著下调, 差异表达为倍 (P= ), 见图 qpcr 检测 NPC 组织中 mir-342-3p 表达

杜龙, 等.miR-342-3p 在鼻咽癌中的表达及意义 749 鼻咽炎性组织中 mir-342-3p 的相对表达量为 0.692(0.447~1.075),NPC 组织中 mir-342-3p 的相对表达量为 0.272(0.129~0.

4 GOandPathway 分析通过 mirna 芯片, 我们发现与永生化鼻咽上皮细胞 NP69 相比,NPC 细胞 CNE2 中 mir-342-3p 呈低表达, 为了解低表达的 mir-342-3p 可能发挥的生物学功能及其机制, 我们对 mir-342-3p

05), 富集得到 33 个 GOterm 和 24 条 Pathway 图 3 和图 4 分别为 GO 富集和 Pathway 分析最显著的 10 个功能和信号通路在显著性最大的 10 个功能中与肿瘤发生的生物学功能较为相关的是血管内皮生长因子 (VEGF)

3 杜龙, 等.miR-342-3p 在鼻咽癌中的表达及意义 749 鼻咽炎性组织中 mir-342-3p 的相对表达量为 0.692(0.447~1.075),NPC 组织中 mir-342-3p 的相对表达量为 0.272(0.129~0.402), 与鼻咽炎性组织相比,NPC 组织中 mir-342-3p 的表达明显下调 (Z=-3.624,P=0.000) 2.4 GOandPathway 分析通过 mirna 芯片, 我们发现与永生化鼻咽上皮细胞 NP69 相比,NPC 细胞 CNE2 中 mir-342-3p 呈低表达, 为了解低表达的 mir-342-3p 可能发挥的生物学功能及其机制, 我们对 mir-342-3p 分别进行 GO(P<0.05,FDR<0.05) 和 Pathway 分析 (P < 0.05), 富集得到 33 个 GOterm 和 24 条 Pathway 图 3 和图 4 分别为 GO 富集和 Pathway 分析最显著的 10 个功能和信号通路在显著性最大的 10 个功能中与肿瘤发生的生物学功能较为相关的是血管内皮生长因子 (VEGF) 受体信号转导通路和细胞凋亡的执行阶段, 在肿瘤中分别参与调控肿瘤血管生成和细胞凋亡在显著性最大的 10 个信号通路中, 丝裂原应激活化蛋白 (MAPK) 信号通路与肿瘤细胞增殖分化侵袭转移和血管生成等密切相关因此, 经 GO 分析,miR-342-3p 可能通过影响 NPC 细胞的血管生成和细胞凋亡来参与 NPC 发生的生物学进程 ;Pathway 分析提示 mir-342-3p 可能通过调控 MAPK 信号通路发挥作用图 1 样本总 RNA 变性琼脂糖凝胶电泳图蓝点代表无差异基因, 橙点代表差异表达基因图 2 基因差异火山图图 4 显著性最大的 10 个功能图 5 显著性最大的 10 个信号通路

4 750 3 讨论 mirna 是一类内源性小分子 RNA 片段, 器官组织中广泛存在, 通过与靶基因的 3 非编码区 (3 UTR) 结合, 在转录后水平调控靶基因的表达近些年来 mirna 在肿瘤中的功能及其机制受到广泛关注, 改变 mirna 的表达与细胞增殖凋亡侵袭转移等众多的生物学过程相关 mirna 表达下调已被作为重要的肿瘤分子标志物, 应用于肿瘤诊断和提示预后 [10-11] 研究表明, 人类 mir-342-3p 由 14 号染色体编码, 在宫颈癌中 mir-342-3p 靶向调控 FOXM1 抑制宫颈癌细胞的增殖侵袭和转移 [12] 但 mir-342-3p 在 NPC 中的表达及其机制尚未见有关报道本研究结果显示,miR-342-3p 在 NPC 细胞和组织中呈低表达状态, 探讨其在 NPC 中差异表达的机制有助于了解 NPC 的发生和发展 GO 数据库依据功能参与的生物途径及细胞中的定位对基因产物进行简单注释, 然后通过 GO 富集分析可以初步了解差异基因主要富集在那些生物学功能途径或细胞定位 ; 而对差异基因进行 Pathway 分析可以大致了解实验条件下显著改变的信号通路 GOandPathway 分析在目前分析基因参与生物学功能及其机制的研究中显得尤为重要, 本研究通过 GOandPathway 分析显示,miR-342-3p 可能通过调控肿瘤血管生成和诱导细胞凋亡来参与 NPC 的发生和发展, 并且可能与 MAPK 等多种生物学信号通路相关肿瘤新血管生成是肿瘤侵袭和转移过程中一个重要的生物学事件, 这些新生血管为肿瘤组织营养并为肿瘤的血性转移提供途径新血管的生成是多种因子协同的结果, 目前已知最强的促血管内皮细胞生长因子是 VEGF, VEGF 的受体主要包括 VEGFR-1 VEGFR-2 VEGFR-33 种, 其中, 前两种主要表达于血管内皮细胞表面,VEGF 与 VEFGR-2 结合, 能促进血管内皮增殖新血管生成并增强血管通透性, 而 VEGFR- 3 在成人主要表达在淋巴管的内皮细胞, 与 VEGF 结合后主要介导淋巴管形成细胞凋亡是生物体为维持内环境稳态和组织器官的稳定性, 在生命活动过程中由多组基因共同控制的细胞自主的程序性死亡过程在恶性肿瘤中, 细胞增殖过度和凋亡受限是两个重要的特征而 MAPK 信号通路存在于众多的细胞中, 通过细胞信号转导将细胞外刺激转至细胞及其核内, 在细胞增殖凋亡血管生成等生物学过程中发挥重要作用 [13-14] 目前已知的 MAPK 信号通路家族有 7 个成员, 包括细胞外信号调节激酶 (ERK)1/2 ERK3/4 ERK5 ERK7/8,c-Jun 氨基端激酶 / 应激活化蛋白激酶 (JNK/SAPK),Nemo 样蛋白激酶 (NLK) 和 p38 丝裂原活化蛋白激酶目前研究比较清楚的 ERK1/2 p38 JNK MAPK 家族信号通路与 NPC 等多种肿瘤细胞凋亡密切相关 [15-16] ERK1/2 信号通路是最早发现的经典 Ras- Raf-MAPK 信号转导途径, 能被细胞外生长因子丝裂原及激素受体等激活, 调节肿瘤细胞的增殖凋亡等 [17] 而后续研究证实 JNK/SAPK 和 p38 MAPK 信号通路均能通过调控促凋亡基因 BAX 的表达来促进肿瘤细胞的凋亡 [18] 综上所述,miR-342-3p 在 NPC 细胞和组织中呈低表达, 低表达的 mir-342-3p 可能影响 NPC 细胞的血管生成和细胞凋亡, 并且与 MAPK 信号通路相关参考文献 : [1] LAISZ,LIW F,CHENL,etal.Howdoesintensity modulated radiotherapy versus conventionaltwo dimensionalradiotherapyinfluencethetreatmentresults innasophyryngealcarcinomapatients? [J].IntJRadiat OncolBiolPhys,2011,80(3): [2] QU R,SUN Y,LIY,etal.MicroRNA-130a-3psup- pressescelviability,proliferationandinvasioninnaso- pharyngealcarcinomabyinhibitingcxcl12[j].am J TranslRes,2017,9(8): [3] LIU C,LIG,RENS,etal.miR-185-3pregulatestheinvasionand metastasisofnasopharyngealcarcinomaby targeting WNT2Binvitro[J].OncolLet,2017,13(4): ND1-pPI3K/AKT-c-JUNfeedbackloop modulatedby [4] ZHEN Y,FANG W,ZHAO M,etal.miR-374a-CC- PDCD4suppressescelgrowth,metastasis,andsensiti- zesnasopharyngealcarcinomatocisplatin[j].onco- gene,2017,36(2): [5] CHEN H,LIL,WANGS,etal.Reduced mir-126expression facilitates angiogenesis of gastric cancer throughitsregulation on VEGF-A [J].Oncotarget, 2014,5(23): [6] GAO Y,ZHANGSG,WANGZH,etal.Down-regulationofmiR-342-3pinhepatocelularcarcinomatissues anditsprognosticsignificance[j].europeanreviewfor Medicaland PharmacologicalSciences,2017,21(9): [7] XUEX,FEIX,HOU W,etal.MiR-342-3psuppresses celproliferationand migrationbytargeting AGR2in non-smalcellung cancer[j].cancer Leters,2018 (412): [8] ZHANG S,LIU L,LV Z,etal.MicroRNA-342-3pin- hibitstheproliferation,migration,andinvasionofos- teosarcomacelsbytargetingastrocyte-elevatedgene-1 (AEG-1)[J].Oncology Research,2017,25(9):1505-

5 杜龙, 等.miR-342-3p 在鼻咽癌中的表达及意义 [9] ZHAO L,ZHANG Y.MiR-342-3pafectshepatocelularcarcinomacelproliferationviaregulating NF-kappaBpathway[J].BiochemicalandBiophysicalResearch Communications,2015,457(3): [10]REM,MAQLIULO G,GIOACCHINIF M,etal.Expressionlevelsandclinicalsignificanceof mir-21-5p, mir-let-7a,and mir-34c-5pinlaryngealsquamouscel carcinoma[j].biomed Res Int,2017,2017 (17): [11]XUETM,TAO LD,ZHANG M,etal.Clinicopatholoḡ icalsignificanceofmicrorna-20bexpressioninhepatocelular carcinoma and regulation of HIF-1α and VEGFefectoncelbiologicalbehaviour[J].Dis Markers,2015,2015(12): [12]LIXR,CHU HJ,LV T,etal.MiR-342-3psuppresses proliferation,migration and invasion by targeting FOXM1inhumancervicalcancer[J].FEBS Leters, 2014,588(17): [13] YANG X L,LIU K Y,LIN FJ,etal.CCL28promotes breastcancergrowth and metastasisthrough MAPK-mediatedcelularanti-apoptosisandpro-metastasis[J].OncolRep,2017,38(3): [14]LIMOGE M,SAFINA A,TRUSKINOVSKY A M, etal.tumorp38mapk signalingenhancescarcinoma vascularizationand growth by promoting expression anddepositionofpro-tumorigenicfactors[j].oncotarget,2017,8(37): [15] MIN L,HEB,HUIL.Mitogen-activatedproteinkinasesinhepatocelularcarcinomadevelopment[J].Semin CancerBiol,2011,21(1): [16] XIE M,YIX,WANG R,etal.14-Thienylmethylene matrine(yyj18),thederivativefrom matrine,induces apoptosisiofhuman nasopharyngenalcarcinomacels bytargeting MAPKandPI3K/AKTpatnwaysinvitro [J].CelPhysiolBiochem,2014,33(5): [17]ZHAO D,SUIY,ZHENG X.MiR-331-3pinhibitsproliferationandpromotesapoptosisbytargeting HER2 throughthepi3k/aktanderk1/2pathwaysincolorectalcancer[j].oncolrep,2016,35(2): [18]YUAN Z Q,FELDMAN RI,SUSSMAN G E,etal. AKT2inhibitionofcisplatin-inducedJNK/p38andBax activationbyphosphorylationofask1:implicationof AKT2in chemoresistance[j].j Biol Chem,2003, 278(26): ( 本文编辑 : 刘夕霞 ) 弹性蛋白肽对髓样树突状细胞表面共刺激分子表达及炎症因子分泌的影响 * 马婷婷, 谭彩梅, 许海光, 唐艳萍, 张慧, 张建全 ( 广西医科大学第一附属医院呼吸内科, 南宁 ) 摘要目的 : 探讨弹性蛋白肽 (EP) 对髓样树突状细胞 (mdcs) 表面共刺激分子表达及炎症因子分泌的影响方法 : 诱导小鼠骨髓来源的单个核细胞增殖分化为未成熟 mdcs, 随机分为空白对照组和 EP 组, 空白对照组不加任何刺激,EP 组加入终浓度为 1mg/LEP 分别采用流式细胞术和 qpcr 技术检测 mdcs 表面共刺激分子 CD80 和 CD86 的表达, 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 法检测细胞上清液中白介素 (IL)-6 和转化生长因子 (TGF)-β1 的浓度结果 : 流式细胞仪检测 EP 组 CD80 和 CD86 阳性表达率分别为 (53.05±2.49)% (50.05±3.90)%, 显著高于空白对照组的 (22.38±5.21)% (19.33±5.80)% (P < 0.05) EP 组 CD80 和 CD86mRNA 相对表达量及细胞上清液中 IL-6 和 TGF-β 水平均较空白对照组明显升高 (P<0.05) 结论 :EP 可促进小鼠 mdcs 的活化及相关促炎因子的释放关键词弹性蛋白肽 ; 树突状细胞 ; 表面共刺激分子中图分类号 :R392 文献标志码 :A 文章编号 : X(2018) DOI: /j.cnki /r * 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No ); 广西自然科学基金资助项目 (No.2015GXNSFAA139189) 通信作者, jqzhang2002@sina.com 收稿日期 : Differencesinexpresion ofcelsurfacecostimulatory molecules and secretion of inflammatoryfactorsbybonemarrow-derived dendriticcelsinresponsetoelastinpeptide

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杜龙, 等.miR-342-3p 在鼻咽癌中的表达及意义 751 1515. [9] ZHAO L,ZHANG Y.MiR-342-3pafectshepatocelularcarcinomacelproliferationviaregulating NF-kappaBpathway[J].BiochemicalandBiophysicalResearch Communications,2015,457(3):370-377.