第 1 期唐兴萍, 等. 非小细胞肺癌患者外周血中生存素和血管内皮细胞生长因子的表达及临床意义 35 [Keywords] growthfactor fluorescencequantitationpcr;non smalcellungcancer;survivin;vascularendothe

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眺柏
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1 第 23 卷第 1 期 2013 年 1 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.23 No.1 Jan.2013 非小细胞肺癌患者外周血中生存素和血管内皮细胞生长因子的表达及临床意义唐兴萍 1, 李坚 1 2, 汪毅 ( 江苏大学附属医院 1. 呼吸科 ;2. 中心实验室, 江苏镇江 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨非小细胞肺癌患者外周血中生存素和血管内皮细胞生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor, VEGF) 的表达及临床意义方法 : 应用荧光定量 PCR 法检测 42 例非小细胞肺癌 (non smalcellungcancer,nsclc) 患者及 20 例肺部良性疾病患者外周血中生存素 mrna 和 VEGFmRNA 的表达结果 :NSCLC 患者外周血中生存素 mrna 和 VEGFmRNA 的表达水平明显高于肺部良性疾病患者 (P=0.006;P=0.001) NSCLC 患者外周血中生存素 mrna 的阳性表达率为 59.5%,VEGFmRNA 的阳性表达率为 57.1%, 两者联合检测阳性率可提高至 76.2% 肺部良性疾病患者生存素 mrna 阳性表达率为 5%,VEGFmRNA 均为阴性, 明显低于 NSCLC 患者 (P 均 <0.001) NSCLC 患者外周血中生存素 mrna 和 VEGFmRNA 的表达与肿瘤的 TNM 分期显著相关 (P<0.001;P=0.008), 而与其他临床特征无明显相关性结论 : 外周血生存素 mrna 和 VEGFmRNA 表达可作为肺癌细胞的分子标志物用于临床诊断, 两者联合检测可提高 NSCLC 患者外周血癌细胞的检出率 [ 关键词 ] 荧光定量 PCR; 非小细胞肺癌 ; 生存素 ; 血管内皮细胞生长因子 [ 中图分类号 ] R734.2 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2013) ClinicalsignificanceofmRNAexpresionofsurvivinandvascular endothelialgrowthfactorinperipheralbloodfrom patientswithnon smalcellungcancer TANGXing ping 1,LIJian 1,WANGYi 2 (1.DepartmentofRespiratory,2.CentralLaboratory,theAfiliatedHospitalofJiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212001,China) [Abstract] Objective:ToevaluatetheclinicalsignificanceofmRNAexpresionofsurvivinandvascular endothelialgrowthfactor(vegf)intheperipheralbloodfrom patientswithnon smalcellungcancer (NSCLC).Methods:Real timefluorescencequantitationpolymerasechainreaction(rt PCR)wasused todetectmrnaexpresionofsurvivinandvegfinperipheralbloodsamplesfrom42patientswithnsclc and20patientswithbenignlungdisease.results:themrnaexpresionofsurvivinandvegfinnsclc patientsweresignificantlyhigherthanthoseinbenignlungdiseasepatients(p=0.006;p=0.001,re spectively).thepositiveratesofmrnaexpresionofsurvivinandvegfinperipheralbloodfrompatients withnsclcwere59.5%(25/42)and57.1%(24/42),respectively.combinedwiththetwomrnaex presionmadethepositiverateraiseto76.2%,whilethepositiveratesofmrnaexpresionofsurvivinand VEGFinperipheralbloodfrompatientswithbenignlungdiseasewere5%(1/20)and0%,respectively, whichweremarkedlylowerthanthoseofpatientswithnsclc (bothp<0.001).forpatientswith NSCLC,thetumorTNM stagewassignificantlycorelatedwithmrnaexpresionofsurvivinandvegf(p <0.001;P=0.008,respectively),whereastherewerenocorelationbetweenmRNAexpresionofsurvivin andvegfandotherpathologiccharacteristics.conclusion:themrnaexpresionofsurvivinandvegfin peripheralbloodcouldbeusedasthemolecularmarkersfordiagnosisofnsclc;combinedwiththetwomr NAexpresioninperipheralbloodcouldraisethedetectionrateofcancercelinperipheralblood. [ 作者简介 ] 唐兴萍 (1986 ), 女, 硕士研究生 ; 李坚 ( 通讯作者 ), 教授, 博士生导师,E mail:lijian541226@163.com

2 第 1 期唐兴萍, 等. 非小细胞肺癌患者外周血中生存素和血管内皮细胞生长因子的表达及临床意义 35 [Keywords] growthfactor fluorescencequantitationpcr;non smalcellungcancer;survivin;vascularendothelial 在全球范围内, 肺癌的发病率和病死率居高不下, 虽然近年来诊疗技术有很大的进步, 但是肺癌患者的 5 年生存率并没有明显升高临床上诊断为早期肺癌的患者在获得肿瘤的根治性切除后,5 年生存率约 60% ~70%, 许多患者仍然死于肿瘤的复发和转移这可能与肿瘤早期癌细胞经血液循环或淋巴结循环播散到远处脏器有关实时荧光定量 PCR(RT PCR) 技术的发展使得检测外周血中微量癌细胞成为可能, 其检测敏感性达 70% ~80% 然而, 在肺癌微转移的检测中, 仍缺少公认的特异分子标志物 [1] 因此, 我们迫切需要寻找高敏感和高特异的分子标志物, 从而建立一种有效的检测肺癌患者外周血微转移的方法本实验采用 RT PCR 技术检测 42 例非小细胞肺癌 (non smalcellungcancer, NSCLC) 患者外周血中生存素 mrna 和血管内皮细胞生长因子 (vascularendothelialgrowth factor, VEGF)mRNA 的表达, 以探讨其诊断 NSCLC 患者血循环中肿瘤细胞播散的临床价值 1 对象和方法 1.1 病例本研究为前瞻性研究将 2011 年 11 月至 2012 年 8 月期间在本院就诊, 经病理组织学检查确诊为 NSCLC 的患者 42 例, 作为研究对象 (NSCLC 组 ), 其中男 26 例, 女 16 例, 年龄 42~88 岁, 平均年龄 68.5 岁根据国际抗癌协会 2009 年修订的肺癌 TNM 分期标准, 符合 Ⅰ +Ⅱ 期 14 例,Ⅲ +Ⅳ 期 28 例 ; 病理类型为鳞癌 23 例, 腺癌 19 例 ; 低分化癌 9 例, 中高分化癌 33 例选择同期诊断为肺部良性疾病患者 20 例作为对照 ( 肺部良性疾病组 ), 其中男 14 例, 女 6 例, 年龄 18~75 岁, 平均年龄 57 岁, 该组患者均同时排除合并有其他部位恶性肿瘤, 其中肺炎 9 例, 慢性支气管炎 4 例, 结核性胸膜炎 2 例, 硅肺气胸间质性肺病脓胸肺结节病各 1 例所有受试患者均在确诊后未进行任何治疗前抽取外周血作为检测标本所有患者皆有完整的临床资料 1.2 方法主要试剂和仪器淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司,Trizol 购自上海普飞生物公司, 反转录试剂盒购自 Fermentas 公司, 荧光定量试剂盒购自日本东洋纺公司, 聚合酶链反应扩增仪和 CFX96 荧光定量 PCR 仪购自美国 BioRad 公司引物设计引物序列全长选自 PubMed 基因库, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 引物序列及扩增片段, 见表 1 表 1 引物序列及其扩增片段长度 Tab1 Oligonucleotidesequemcesofprimers 引物序列 (5 3 ) 生存素 VEGF β 肌动蛋白上游 :CACCGCATCTCTACATTCAAAGA 下游 :AAGTCTGGCTCGTTCCAGTG 上游 :GAGTACATCTTCAAGCCATCCTG 下游 :TGCTCTATCTTTCTTTGGTCTGC 上游 :TGACGTGGACATCCGCAAAG 下游 :CTGGAAGGTGGACAGCGAGG 扩增片段长度 /bp 标本的收集与总 RNA 的抽提分别抽取 NSCLC 患者及肺部良性疾病患者静脉血 4mL,ED TA 抗凝用淋巴细胞分离液进行有核细胞的分离, 用 Trizol 提取总 RNA 反转录反应按照 Fermentas 试剂盒说明书提供的操作程序进行反转录反应,cDNA 于 -70 保存荧光定量 PCR 反应每份外周血标本均扩增 β 肌动蛋白生存素及 VEGF 每个反应终体积为 20μL, 其中反转录产物 2μL,10μmol/L 上下游引物各 0.5μL,SYBR10μL, 无菌水 7μL PCR 循环参数 :95 预变性 30s, 然后按 95 5s,57 30s, 72 30s, 共做 40 个循环每份标本重复 3 次进行目的基因生存素 VEGF 和内参照基因 β 肌动蛋白扩增结果分析用 2 -ΔΔCT 的方法计算基因的相对表达水平, 根据 ROC 曲线找出折点 ( 上限值 ), 对于生存素, 折点 1.48 为阳性,<1.48 为阴性对于 VEGF, 折点 1.45 为阳性,<1.45 为阴性 1.3 统计学分析用 SPSS16.0 软件进行统计学处理, 计量资料采用 t 检验, 计数资料采用 χ 2 检验,P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 生存素 mrna 和 VEGFmRNA 在外周血中的相对表达量生存素 mrna 和 VEGFmRNA 在 NSCLC 患者和肺部良性疾病患者外周血中的相对表达量, 见表 2 两

3 36 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 23 卷组间比较, 差异有统计学意义 (P=0.006;P=0.001) 表 2 生存素 mrna 和 VEGFmRNA 在两组患者外周血中的表达 Tab2 mrnaexpresionofsurvivinandvascular endothelialgrowthfactorintwogroups 组别 n 相对表达量生存素 mrna VEGFmRNA NSCLC 组 ± ± 肺部良性疾病组 ± ± t 值 P 值生存素 mrna 和 VEGFmRNA 在外周血中的阳性表达 42 例 NSCLC 患者外周血中生存素 mrna 和 VEGFmRNA 阳性表达率分别为 59.5%(25/42) 和 57.1%(24/42);20 例肺部良性疾病患者外周血中生存素 mrna 和 VEGFmRNA 阳性表达率分别为 5%(1/20) 和 0%(0/20); 两组间比较, 差异有统计学意义 (P 均 <0.001) 2.3 NSCLC 患者外周血中生存素 mrna 和 VEGF mrna 表达与临床病理特征的关系 42 例 NSCLC 患者外周血中生存素 mrna 和 VEGFmRNA 的阳性表达率与肿瘤的分期呈显著相关,Ⅲ 期 +Ⅳ 期患者外周血中生存素 mrna 和 VEGFmRNA 的阳性率明显高于 Ⅰ 期 +Ⅱ 期患者 (P <0.001;P=0.008); 与年龄性别吸烟肿瘤的组织学类型及分化程度无明显相关性见表 3 表 3 NSCLC 患者外周血中生存素 mrna 和 VEGFmRNA 表达与临床病理特征的关系 Tab3 RelationshipbetweenclinicalcharacteristicsandmRNAexpresionofsurvivinandvascularendothelialgrowth factorinpatienswithnon smalcellungcancer 病理参数 n 生存素 mrna 阳性例数 (%) χ 2 值 P 值 VEGFmRNA 阳性例数 (%) χ 2 值 P 值年龄 60 岁 26 15(57.7) <60 岁 16 10(62.5) (53.8) 10(62.5) 性别男 26 15(57.7) 女 16 10(62.5) (61.5) 8(50) 吸烟 600 支 17 9(52.9) <600 支 25 16(64) (64.7) 13(52) 组织学类型鳞癌 23 13(56.5) 腺癌 19 12(63.2) (60.9) 10(52.6) 分化程度低分化 9 6(66.7) 中高分化 33 19(57.8) (44.4) 20(60.6) 临床分期 Ⅰ +Ⅱ 期 14 3(21.4) Ⅲ +Ⅳ 期 28 22(78.6) (28.6) 20(71.4) 生存素 mrna 和 VEGFmRNA 联合检测的意义检测外周血生存素 mrna 和 VEGFmRNA 诊断肺癌具有较高的特异性和较好的敏感性, 联合检测 2 种基因时可显著提高诊断的敏感性见表 4 表 4 外周血生存素 mrna 和 VEGFmRNA 对 NSCLC 的诊断价值 %(n/n) Tab4 DiagnosticefectofmRNAexpresionofsurvivinandvascularendothelialgrowthfactorinperipheral bloodfrom patientswithnon smalcellungcancer 指标敏感性特异性阳性预测值阴性预测值准确性生存素 mrna 60(25/42) 95(19/20) 96(25/26) 53(19/36) 71(44/62) VEGFmRNA 57(24/42) 100(20/20) 100(24/24) 53(20/38) 71(44/62) 生存素 mrna+vegfmrna 76(32/42) 95(19/20) 97(32/33) 66(19/29) 82(51/62) 2.5 NSCLC 患者外周血中生存素 mrna 与 VEGF mrna 表达的相关性生存素 mrna 与 VEGFmRNA 在 NSCLC 患者外周血中共同表达有 16 例, 生存素 mrna 阳性组 VEGF 有 9 例阴性, 生存素 mrna 阴性组 VEGF 有 8 例阳性, 根据一致性检验, 结果表明两者之间无相关性 (P>0.05)( 表 5)

4 第 1 期唐兴萍, 等. 非小细胞肺癌患者外周血中生存素和血管内皮细胞生长因子的表达及临床意义 37 表 5 NSCLC 患者外周血生存素 mrna 与 VEGFmRNA 表达的相关性 Tab5 RelationshipbetweenmRNAexpresionofsurvivin andvascularendothelialgrowthfactorinperipheral bloodfrom patientswithnon smalcellungcancer VEGFmRNA 生存素 mrna n 阳性阴性阳性讨论阴性 χ 2 P 值 >0.05 生存素是凋亡抑制蛋白家族中的重要成员, 具有抑制细胞凋亡, 促进细胞增生, 调节细胞有丝分裂及血管生成等多种生物学功能生存素的高表达可抑制多种因素, 如 Fas(CD95) Caspase 及抗癌药物等诱导的细胞凋亡生存素在人类多种肿瘤组织中广泛表达, 也表达于人类胚胎组织, 但是在正常成人终末分化组织中不表达或呈低表达 [2-3] Velcules [4] cu 等报道, 生存素几乎在所有的人类肿瘤组织中均有不同水平的表达, 在 100 多种肿瘤特异性表达基因中, 其表达的特异性排前 4 位生存素在肿瘤组织高表达和在成人正常组织中低表达或不表达, 这使其完全有可能成为肿瘤诊断和治疗的靶基因 [5] 通过检测尿液和胸腔积液标本中的生存素 mrna 表达来诊断膀胱癌和恶性胸腔积液, 已被证明具有较高的敏感性和特异性, 是一种无创性诊断膀胱癌和恶性胸腔积液的方法 [6-9] [10] Shen 等采用荧光定量 PCR 方法测定结直肠癌患者外周血中生存素 mrna, 发现其阳性率明显高于良性结肠疾病者与健康对照者, 且阳性表达与肿瘤分期及淋巴 [11] 结转移明显相关 Cao 等研究结果显示, 食管鳞癌患者外周血中生存素 mrna 表达水平明显高于良性疾病者及健康对照者, 其阳性率与肿瘤血管侵 [12] 犯淋巴结状态和临床分期明显相关 Yie 等在对肺癌患者的研究中指出, 在接受肿瘤切除术的 NSCLC 患者中, 外周血中生存素 mrna 阳性者肿瘤复发率明显高于生存素 mrna 阴性者, 生存期明显短于生存素 mrna 阴性者本研究结果显示, NSCLC 患者外周血中生存素 mrna 阳性表达率为 59.5%, 与文献报道结直肠癌和乳腺癌患者的检测结果相似 [10,13], 但高于其他文献报道的肺癌和食管鳞癌的测定结果 [11-12], 这可能与本研究中 Ⅲ +Ⅳ 期 NSCLC 患者较多有关我们发现,NSCLC 患者外周血中生存素 mrna 阳性表达与肿瘤分期呈显著相关, 与其他临床病理学特征无相关性, 这可能是由于在不同的研究中患者临床分期不同所致肿瘤血管生成是肿瘤发生和转移过程中的关键环节 VEGF 是目前所知最重要的血管生长因子, 它直接或间接地作用于血管生成的每一个环节, 促进肿瘤组织中血管生成, 肿瘤细胞的增殖黏附侵袭和转移 VEGF 在 50% ~70% 的人类肺癌乳腺癌和直肠癌组织中呈过表达, 而在造血细胞上通常不表达 [13], 故外周血中检测到 VEGFmRNA 说明循 [13] 环血液中存在肿瘤细胞 DeLuca 等测定了肺癌乳腺癌和膀胱癌患者外周血 VEGFmRNA 表达, 其阳性率分别为 57% 48% 和 73%, 且这些患者外周血 VEGFmRNA 表达与其原发肿瘤组织中 VEGF [14] 蛋白表达高度一致 Zhong 等应用 ELISA 方法测定手术治疗前肝癌患者血清中 VEGF, 结果显示, 手术后肿瘤复发患者的 VEGF 阳性率明显高于未复发患者,VEGF 阳性患者的 1 年 2 年和 3 年生存率显著低于 VEGF 阴性患者, 表明在影像学检查未发现有显性转移而可手术的患者中, 血清 VEGF 阳性是存在血循环隐匿性微转移的证据本研究结果显示,VEGFmRNA 在 NSCLC 患者中的阳性表达率明显高于肺部良性疾病组 ;Ⅲ +Ⅳ 期 NSCLC 患者 VEGFmRNA 的阳性率显著高于 Ⅰ +Ⅱ 期患者同时, 部分 Ⅰ +Ⅱ 期 NSCLC 患者外周血生存素 mrna 和 VEGFmRNA 也呈阳性表达, 提示某些无显性转移的早期可手术患者在手术之前可能已经存在肺癌的血循环转移由于本研究中 Ⅰ +Ⅱ 期患者例数少, 且研究时间短, 因而未能评估外周血生存素 mrna 和 VEGFmRNA 阳性表达对接受手术治疗患者预后的影响多数研究显示, 与检测单一肿瘤特异性标志比较, 联合检测外周血中的肿瘤标志可显著提高测定结果的敏感性, 从而改善诊断效果 [15-17] 本研究发现, 联合检测外周血中生存素 mrna 和 VEGFmR NA 的表达可提高阳性检出率综上所述, 荧光定量 PCR 技术测定外周血中生存素 mrna 和 VEGFmRNA 的表达, 对于检出血循环中的肿瘤细胞, 早期发现肺癌微转移有一定实用价值 ; 其结果对于筛选出需手术前诱导化疗的非小细胞肺癌患者, 实施个体化治疗具有重要的临床意义 [ 参考文献 ] [1]OsakiT,OyamaT,GuCD,etal.Prognosticimpactof

5 38 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 23 卷 micrometastatictumorcelsinthelymphnodesandbone marowofpatientswithcompletelyresectedstageⅠnon smal cellungcancer[j].jclinoncol,2002,20(13): [2]AmbrosiniG,AdidaC,AltieriDC.Anovelanti apoptosis gene,survivin,expresedincancerandlymphoma[j]. NatMed,1997,3(8): [3]TammI,WangY,SausvileE,etal.IAP familyprotein survivininhibitscaspaseactivityandapoptosisinducedby Fas(CD90),Bax,caspase,andanticancerdrugs[J]. CancerRes,1998,58(23): [4]VelculescuVE,MaddenSL,ZhangL,etal.Analysisof humantranscriptomes[j].natgenet,1999,23(4): [5]FukudaS,PelusLM.Survivin,acancertargetwithane mergingroleinnormaladulttisues[j].molcancert her,2006,5(5): [6]MousaO,Abol EneinH,BisadaNK,etal.Evaluation ofsurvivinreversetranscriptase polymerasechainreaction fornoninvasivedetectionofbladdercancer[j].jurol, 2006,175(6): [7]KenneyDM,GeschwindtRD,KaryMR,etal.Detection ofnewlydiagnosedbladdercancer,bladdercancerrecur renceandbladdercancerinpatientswithhematuriausing quantitativert PCRofurinarysurvivin[J].TumorBiol, 2007,28(2): [8]WuYK,ChenKT,KuoYB,etal.Quantitativedetection ofsurvivininmalignantpleuralefusionforthediagnosis andprognosisoflungcancer[j].cancerlet,2009,273 (2): [9]LanCC,WuYK,LeeCH,etal.IncreasedsurvivinmR NAinmalignantpleuralefusionissignificantlycorelated withsurvival[j].jpnjclinoncol,2010,40(3): [10]ShenC,HuLH,XiaL,etal.Quantitativereal timert PCRdetectionforsurvivin,CK20andCEAinperipheral bloodofcolorectalcancerpatients[j].jpnjclinoncol, 2008,38(11): [11]CaoM,YieSM,WuSM,etal.Detectionofsurvivin ex presingcirculatingcancercelsintheperipheralbloodof patientswithesophagealsquamouscelcarcinomaandits clinicalsignificance[j].clinexpmetastasis,2009,26 (7): [12]YieSM,LuoB,YeNY,etal.DetectionofSurvivin ex presingcirculatingcancercelsintheperipheralbloodof breastcancerpatientsbyart PCRELISA[J].ClinExp Metastasis,2006,23(5/6): [13]DeLucaA,PignataS,CasamasimiA,etal.Detection ofcirculatingtumorcelsincarcinomapatientsbyanovel epidermalgrowthfactorreceptorreversetranscription PCR asay[j].clincancerres,2000,6(4): [14]ZhongC,WeiW,SuXK,etal.Serumandtisuevascu larendothelialgrothfactorpredictsprognosisinhepatocel lularcarcinomapatientsafterpartialliverresection[j]. Hepatogastroenterology,2012,59(113): [15]VlemsFA,DiepstraJH,CornelisenIM,etal.Investiga tionsforamulti markerrt PCRtoimprovesensitivityof diseminatedtumorceldetection[j].anticancerres, 2003,23(1A): [16]ChenCC,ChangTW,ChenFM,etal.Combinationof multiplemrnamarkers(pttg1,survivin,ubch10and TK1)inthediagnosisofTaiwanesepatientswithbreast cancerbymembranearay[j].oncology,2006,70(4): [17]PuXY,WangZP,ChenYR,etal.Thevalueofcom bineduseofsurvivin,cytokeratin20andmucin7mrna forbladdercancerdetectioninvoidedurine[j].jcancer ResClinOncol,2008,134(6): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 刘星星

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第 1 期 唐兴萍, 等. 非小细胞肺癌患者外周血中生存素和血管内皮细胞生长因子的表达及临床意义 35 [Keywords] growthfactor fluorescencequantitationpcr;non smalcellungcancer;survivin;vascularendothe

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