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鸠弓
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1 第 25 卷第 6 期 2010 年 12 月天津科技大学学报 Journal of Tianjin University of Science & Technology Vol.25 No. 6 Dec 解淀粉芽孢杆菌 BI 2 的鉴定及其对黄曲霉的抑制作用王德培 1,2, 孟慧 1,3, 管叙龙 1,3, 罗学刚 (1. 天津科技大学生物工程学院, 天津 ;2. 工业微生物教育部重点实验室, 天津 ; 3. 天津市工业微生物重点实验室, 天津 ) 1,2 摘要 : 菌株 BI 2 是从青贮玉米秸秆饲料中分离得到的一株革兰氏阳性芽孢杆菌. 经 16S rdna 序列分析, 发现该菌株与解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens(nc_009725) 的相似性达到 99.6%; 进一步结合 Biolog 及生理生化分析, 将该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌. 以番茄叶霉病菌黄瓜枯萎病菌等 12 种植物病原菌及部分霉菌酵母食品乳酸菌和人类致病细菌为指示菌进行抑菌实验. 结果表明 :BI 2 主要抑制丝状真菌, 而对细菌无拮抗作用 ;BI 2 菌株生长 36 h 的上清液能明显抑制黄曲霉孢子萌发及其菌丝生长, 抑制率分别达到 67.4% 和 74.8%; 而且该上清液经 120 高温处理 20 min 后对黄曲霉的抑制效果基本没有影响. 关键词 : 解淀粉芽孢杆菌 ; 菌株鉴定 ; 黄曲霉 ; 抑菌活性中图分类号 :Q 文献标志码 :A 文章编号 : (2010) Identification of Bacillus amyloliquefaciens BI 2 and Its Antagonistic Activity Against Aspergillus flavus WANG De-pei 1,2,MENG Hui 1,3,GUAN Xu-long 1,3,LUO Xue-gang 1,2 (1. College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin ,China; 2. Key Laboratory of Industrial Microbiology,Ministry of Education,Tianjin ,China; 3. Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,Tianjin ,China) Abstract:The strain BI 2 isolated from corn stalk of silage was G + bacillus. By means of 16S rdna sequence analysis, morphological observation,physiological examinatio and Biolog assay,bi 2 was identified as Bacillus amyloliquefaciens. Its 16S rdna sequence was 99.6% to B.amyloliquefaciens in similarity. Its antagonistic experiments were conducted with 12 plant pathogens including Fulvia fulva,fusarium oxysporum,yeasts,mold fungi,food lactobacilla and pathogenic bacteria. The results show that BI 2 possessed evident inhibitory activity to filamentous fungi,but had no evident effect on bacteria. It was further found that the supernatant of its broth after 36 h fermentation significantly inhibited the conidial germination and hyphal growth of Aspergillus flavus with the inhibition ratios of 67.4% and 74.8% respectively. It was also found that its antagonistic activity of the supernatant was not decreased although it was treated even at 120 for 20 min. Keywords:Bacillus amyloliquefaciens;strain identification;aspergillus flavus;antagonistic activity 我国是一个农业大国, 由于农作物病虫害发生普遍和危害严重, 每年因病虫害造成的粮食损失约 1,500 万吨 [1], 其中 80% 以上的农作物病害是由真菌侵染引起的 [2]. 黄曲霉 (Aspergillus flavus) 是一种常见的霉菌, 不仅污染食品和饲料, 而且可引起人类和动物的多种疾病. 黄曲霉的次生代谢产物黄曲霉毒素 (aflatoxins,afts) 具有很强的毒性, 被认为有致癌性致突变致畸性抑制免疫力, 并可引起肝部损伤 [3] 等危害. 近年的研究表明, 某些乳酸杆菌可抑制霉菌的生长及其产毒.Gourama 和 Bullerman [4] 还发现, 嗜酸乳酸杆菌保加利亚乳酸杆菌和植物乳酸杆菌可 [5] 抑制寄生曲霉的孢子萌发. 徐进等报道乳杆菌收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家高技术研究发展计划 863 计划资助项目 (2008AA10Z336) 作者简介 : 王德培 (1972 ), 女, 天津人, 副教授, 硕士生导师,wangdp@tust.edu.cn.

2 6 天津科技大学学报第 25 卷第 6 期 (Lactobacillus spp.) 在低 ph 下能抑制黄曲霉孢子的 [6] 萌发 ;Luo 等发现柠檬醛破坏黄曲霉孢子的细胞壁和细胞膜, 最终导致黄曲霉孢子丧失萌发能力. 解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 能产生多种抑制植物病原真菌的抗菌物质, 还能很好地抑制多种食品腐败真菌和致病菌的生长 [7], 因而在生物防治中起着重要的作用 [8 9]. 菌株 BI 2 为本实验室分离得到的一株对黄曲霉具有拮抗活性的细菌. 本文对其进行了菌种鉴定和抑菌谱的测定, 并对其活性物质进行了初步研究, 为开发出能控制食品中黄曲霉生长或抑制黄曲霉毒素产生的生物制剂提供理论支持. 1 材料与方法 1.1 供试菌株及培养基菌株 BI 2 (B.amyloliquefaciens BI 2 ) 由本实验室从青贮玉米秸秆饲料中分离得到. 标准枯草芽孢杆菌 Z6531(Bacillus Subtilis) 由天津科技大学生物工程微生物实验室保存. 肉汤琼脂培养基 (g/l): 蛋白胨 10, 牛肉膏 5, NaCl 5, 琼脂 20,pH 7.0~7.2. PDA 培养基 (g/l): 马铃薯 200, 葡萄糖 20, 琼脂 20,pH 自然. 1.2 菌株 BI2 鉴定形态观察与染色将菌株 BI 2 点种到营养肉汤琼脂培养基上培养, 定期进行菌落形态观察. 参照文献 [10] 进行 Gram 染色, 在光学显微镜下观察菌体形态 S rdna 同源性分析采用试剂盒提取菌株 BI 2 基因组总 DNA. 引物设计上游 5'-AGAGTTTGATCCTGCCTCAG-3', 下游 5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3',PCR 反应体系为 :10 buffer 2.5,µL,dNTP 2.5,µL, 引物各 1.0,µL, 模板 5.0,µL,Taq DNA Polymeras 0.5,µL,ddH 2 O 12.5,µL.PCR 产物经回收纯化后连入 pmd19-t 载体, 热激法转化到 E.coli DH5α 感受态细胞, 选择转化的阳性克隆提取质粒, 由天津生物芯片技术有限责任公司进行 DNA 双向测序. 利用 DNAMAN 分析软件将测序所得芽孢杆菌 BI 2 的 16S rdna 核苷酸序列与 GenBank 上收录的代表菌株 16S rdna 基因核苷酸序列进行同源性比对 Biolog 检测将分离获得的单菌落接种到 BUG+M+T 平板 (BUG 琼脂 +0.25% 麦芽糖, 涂布 7.66% 巯基乙酸钠溶液 ),30, 培养 16~24,h. 挑取菌落制备菌悬液, 接种至鉴定板各孔内,30, 静置培养 16~24,h, 采用 Microlog 应用程序读取结果生理生化测定根据伯杰细菌手册 [11] 和常见细菌鉴定手册 [12] 中的方法测定芽孢杆菌 BI 2 的生理生化特性. 1.3 菌株 BI2 的抑菌谱测定供抑菌谱测定的菌株有 12 株植物病原真菌 4 株霉菌 2 株酵母菌 4 株人类致病菌 7 株食品乳酸杆菌, 均由中国农业科学院植物保护研究所提供, 见表 1. 表 1 抑菌谱供试菌株 Tab.1 Tested strains of antibacterial spectrum 菌种植物病原真菌霉菌酵母菌人类致病菌食品乳酸杆菌菌株名称番茄叶霉病菌 (Fulvia fulva) 黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum) 大豆根腐病菌(F.oxysporum) 小麦纹枯病菌 (Rhizoctonia cerealis) 水稻纹枯病菌(R.solani) 玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus) 番茄早疫病菌(Alternaria solani) 辣椒晚疫霉病菌(Phytophthora capsici) 瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum) 番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea) 大豆菌核病菌(Scle-rotiria sclerotiorum) 黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare) 黄曲霉 (Aspergillus flavus) 黑曲霉(A.niger) 米曲霉(A.oryzae) 根霉(Rhizopus oryzae) 白假丝酵母菌 (Candida albicans) 酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) 产气杆菌 (Eenterobacter aerogenes) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 耳葡萄球菌(S.auricularis) 大肠杆菌 (Escherichia coli) 嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus) 干酪乳杆菌(L.casei) 乳酸杆菌 (Lactobacillus sp.) 植物乳杆菌(L.plantarum) 短乳杆菌 (L.brevis) 乳酸球菌(L.lactis) 纤维二糖乳杆菌(L.cellobiosas) 1.4 不同时间 BI2 发酵上清液对黄曲霉孢子萌发及菌丝生长的影响孢子悬液的制备将黄曲霉菌接种在 PDA 斜面培养基上, 于 28, 培养 10,d, 然后加入一定量的无菌磷酸盐缓冲液冲洗斜面上的孢子, 经无菌纱布过滤除去菌丝残体, 用无菌磷酸盐缓冲液稀释至孢子浓度为 10 5,mL 1 待用.

2010 年 12 月王德培, 等 : 解淀粉芽孢杆菌 BI 2 的鉴定及其对黄曲霉的抑制作用 7 1.4.2 不同时间 BI 2 发酵上清液的制备将 BI 2 经 37, 150,r/min 摇床培养 12,h 活化后, 再以 1% 的接种量接种到新鲜的营养肉汤培养基中, 于 37, 150,r/min 摇床培养.

分别接种 100,µL 黄曲霉孢子悬液, 同时以 10,mL 营养肉汤培养基代替发酵上清液为对照组, 接种 100,µL 黄曲霉孢子悬液, 于 30, 下培养,36,h 后测量菌落直径 ( 分别测量大中小 3 个单菌落直径, 取平均值 ), 并进行霉菌孢子萌发计数, 计算抑制率. 实验重复 3 次. 菌丝生长抑制率 =( 对照组菌落直径 - 实验组菌落直径 )/ 对照组菌落直径 l00%.

3 2010 年 12 月王德培, 等 : 解淀粉芽孢杆菌 BI 2 的鉴定及其对黄曲霉的抑制作用不同时间 BI 2 发酵上清液的制备将 BI 2 经 37, 150,r/min 摇床培养 12,h 活化后, 再以 1% 的接种量接种到新鲜的营养肉汤培养基中, 于 37, 150,r/min 摇床培养. 分别取 ,h 的发酵液, 经 10,000,r/min 离心 20,min 得发酵上清液抑菌实验取上述 ,h 的发酵上清液各 10,mL, 分别与 20,mL 溶化的和即将凝固的 PDA 培养基混合, 摇匀制成平板. 分别接种 100,µL 黄曲霉孢子悬液, 同时以 10,mL 营养肉汤培养基代替发酵上清液为对照组, 接种 100,µL 黄曲霉孢子悬液, 于 30, 下培养,36,h 后测量菌落直径 ( 分别测量大中小 3 个单菌落直径, 取平均值 ), 并进行霉菌孢子萌发计数, 计算抑制率. 实验重复 3 次. 菌丝生长抑制率 =( 对照组菌落直径 - 实验组菌落直径 )/ 对照组菌落直径 l00%. 孢子萌发抑制率 =( 对照组孢子萌发数 - 实验组孢子萌发数 )/ 对照组孢子萌发数 100%. 1.5 热处理对 BI2 发酵上清液抑菌活性的影响分别将培养 36,h 的发酵上清液在 , 条件下处理 20,min, 以未处理的发酵上清液为对照, 参照 1.4 方法测定抑菌活性. 2 结果与分析 2.1 菌株 BI2 的鉴定菌体和菌落特征菌体呈杆状, 革兰氏染色均匀且为阳性, 内生芽孢. 在营养肉汤琼脂培养基上呈白色不透明菌落, 表面粗糙, 菌落边缘不规则 ( 图 1). 通过 DNAMAN 软件进行对比. 结果表明 : 菌株 BI 2 与解淀粉芽孢杆菌 (NC_009725) 的序列同源性最高, 为 99.6%; 与枯草芽孢杆菌 (ABQK ) 同源性为 99.5%. 本菌株的 GenBank 注册号 GU 采用 DNAMAN 软件构建进化树, 如图 2 所示. 图 2 基于菌株 16S rdna 序列的进化树 Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on 16S,rDNA sequences of the strain BI Biolog 系统鉴定经过 Biolog 系统鉴定, 菌株 BI 2 与解淀粉芽孢杆菌的相似性为菌株 BI 2 的生理生化特性以标准枯草芽孢杆菌 (Z6531) 为对照, 对菌株 BI 2 进行生理生化的测定. 表 2 菌株 BI2 的生理生化特性 Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of the strain BI2 枯草芽枯草芽实验项目 BI2 实验项目 BI2 孢杆菌孢杆菌酪素水解实验 + + 柠檬酸盐实验 + + 硝酸盐还原实验 + + V.P. 实验 + + 淀粉水解实验 + + 厌氧生长 - - 木糖发酵 - + 蔗糖发酵 + + 乳糖发酵 - + 阿拉伯糖发酵 + + 棉子糖发酵 + + 甘露糖发酵 + + 麦芽糖发酵 + + 山梨糖发酵 - - 甘露醇发酵 + + 半乳糖发酵 - - 注 : + 代表阳性, - 代表阴性. (a) 菌落形态 (b) 菌体形态图 1 菌株 BI2 的菌落与菌体形态 Fig.1 Colony and thalli morphology of the strain BI 菌株 BI 2 的 16S rdna 序列分析以菌株 BI 2 基因组 DNA 为模板扩增其 16S rdna 序列,PCR 产物为单一条带, 经回收纯化和连接转化后测序, 序列长度为 1,512,bp. 将该序列输入 GenBank 中并搜索已登陆的相近序列, 选取相近的 7 条序列, 经过 16S,rDNA 序列分析 Biolog 鉴定生理生化分析以及菌株的形态学观察, 最终确定菌株 BI 2 为解淀粉芽孢杆菌 (B.amyloliquefaciens). 2.2 菌株 BI2 的抑菌谱解淀粉芽孢杆菌 BI 2 对 12 种供试植物病原菌均有不同程度的抑制活性, 其中对番茄早疫病菌玉米小斑病菌番茄叶霉病菌水稻纹枯病菌的抑制作用最强 ; 对黄曲霉米曲霉根霉黑曲霉 4 种霉菌和白假丝酵母菌也具有较强的拮抗作用 ; 对乳酸杆菌干酪乳杆菌纤维二糖乳杆菌有一定的拮抗作用 ; 但该菌株对产气杆菌耳葡萄球菌大肠杆菌金黄色葡萄

8 天津科技大学学报第 25 卷第 6 期球菌及植物乳杆菌嗜酸乳杆菌乳酸球菌短乳杆菌等多数乳酸菌没有抑制作用. 结果表明 :BI 2 主要抑制丝状真菌, 具有较强的抗植物病原真菌性能, 但对细菌的拮抗作用不明显. 图 3 菌株 BI2 的抑菌谱 Fig.3 Antibacterial spectrum of the strain BI2 2.

4 8 天津科技大学学报第 25 卷第 6 期球菌及植物乳杆菌嗜酸乳杆菌乳酸球菌短乳杆菌等多数乳酸菌没有抑制作用. 结果表明 :BI 2 主要抑制丝状真菌, 具有较强的抗植物病原真菌性能, 但对细菌的拮抗作用不明显. 图 3 菌株 BI2 的抑菌谱 Fig.3 Antibacterial spectrum of the strain BI2 2.3 不同发酵时间的 BI2 发酵上清液对黄曲霉孢子萌发和菌丝生长的影响实验结果表明,BI 2 发酵上清液能明显抑制黄曲霉的孢子萌发和菌丝生长, 明显使黄曲霉菌的生长速度减慢, 孢子萌发数减少. 发酵 36,h 的发酵上清液对黄曲霉孢子萌发和菌丝生长的抑制率最高, 分别达到 67.4% 和 74.8%( 见表 3). 表 3 BI2 发酵上清液对黄曲霉的抑菌效果 Tab.3 Inhibiting effect of BI2 fermentation supernatant on Aspergillus flavus 发酵时间 /h 孢子萌发抑制率 /% 菌丝生长抑制率 /% ± ± ± ± ± ± ± ±2.6 注 : 抑制率数值为平均值 ± 标准差. 2.4 热处理对 BI2 发酵上清液抑菌活性的影响 BI 2 发酵 36,h 的上清液经过 , 热处理 20,min 后, 对黄曲霉孢子萌发和菌丝生长的抑制率基本没有影响 ( 见表 4). 表 4 热处理对 BI2 发酵上清液抑菌活性的影响 Tab.4 Effect of heat treatment on antagonistic activity of BI2 fermentation supernatant 温度 / 孢子萌发抑制率 /% 菌丝生长抑制率 /% 未处理 65.2± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±2.1 注 : 抑制率数值为平均值 ± 标准差. 3 讨论通过 16S,rDNA 序列和生理生化特性分析形态观察及 Biolog 验证, 将菌株 BI 2 鉴定为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens), 为该菌株深入研究和应用提供了理论依据. 细菌 16S,rDNA 序列长度一般在 1,500,bp 左右 [13], 本实验测得菌株 BI 2 的 16S,rDNA 长度为 1,512,bp, 基本一致. 另外, 通过 Biolog 微生物鉴定系统研究表明, 菌株 BI 2 与 Biolog 数据库中解淀粉芽孢杆菌的相似性达到 0.692(SIM 0.50 表示鉴定结果良好 [14] ), 可以认为是同一种类. 通过多项分析, 将菌株 BI 2 鉴定为解淀粉芽孢杆菌是可靠的. 在农业生产上, 由植物病原真菌引起的病害造成的经济损失是巨大的. 为了防治这些病害, 在生产上通常喷施大量化学农药, 虽然控制了植物病害的发生与发展, 但同时可能对环境造成污染, 甚至长期使用会使某些病原真菌的抗性增加, 根本达不到病害防治效果 ; 因此, 开发生物农药具有非常现实的研究意义. 本实验以拮抗菌 BI 2 为研究对象, 选择 12 种植物病原真菌 4 种霉菌 2 种酵母菌 7 种食品乳酸菌和 4 种人类致病细菌为指示菌, 进行了抑菌谱测定. 结果表明 :BI 2 对丝状真菌具有明显的抑制作用, 而对其他细菌的拮抗作用不明显 ; 说明 BI 2 对植物病原真菌具有特异的拮抗活性, 可在农作物病害的生物防治和食品保鲜中进行开发和利用. 另外, 解淀粉芽孢杆菌是一种对人畜安全的细菌, 已被越来越多地应用于饲料填加剂和饲用微生态制剂. 研究发现,BI 2 发酵上清

5 2010 年 12 月王德培, 等 : 解淀粉芽孢杆菌 BI 2 的鉴定及其对黄曲霉的抑制作用 9 液能明显抑制黄曲霉的孢子萌发和菌丝生长,120, 的高温热处理 20,min 对其抑菌活性也没有影响, 这些特性对促进防病和促进生长都具有重要作用. 菌株 BI 2 营养要求简单, 环境适应能力强, 能抑制多种植物病原真菌和一些霉菌, 目前已由天津卫生防病控制中心进行了 LD 50 急性毒性实验测定, 不产生任何有毒物质, 可用于生物农药. 本文只对 BI 2 的抑菌谱进行了初步研究, 探讨其对黄曲霉的抑制作用. 参考文献 : [1] 霍治国, 刘万才, 邵振润, 等. 试论开展中国农作物病虫害危害流行的长期气象预测研究 [J]. 自然灾害学报, 2000,9(1): [2] 崔星明, 吴晨, 杨竹平. 植物抗真菌和细菌病害基因工程育种策略 [J]. 上海农业学报,1999,15(2): [3] 张柏林, 张若鸿, 吴风亮, 等. 乳酸菌抗真菌活性及其抑制真菌毒素的效果 [J]. 中国乳品工业,2005,33(6): [4] Gourama H,Bullerman L B. Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus:aflatoxigenic fungi of concern in foods and feed:a review[j]. Journal of Food Protection, 1995,58(12): [5] 徐进, 冉陆, 杨宝兰, 等. 乳杆菌抑制黄曲霉孢子萌发的研究 [J]. 卫生研究,2002,31(1): [6] LUO Man,JIANG Li-ke,,HUANG Yao-xiong,et al. Effects of citral on Aspergillus flavus spores by quasi- elastic light scattering and multiplex microanalysis techniques[j]. Acta Biochinica et Biophysica Siniea,2004, 36(4): [7] 潘恩霖. 微生物作为天然防腐剂的应用和展望 [J]. 南平师专学报,2001,20(2): [8] Swinbume T R. The potential value of bacterial antagonists for the control of apple canker[j]. Ann Appl Biol, 1978,89: [9] Utkhede R S,Smith E M. Promotion of apple tree growth and fruit production by the EBW-4 strain of Bacillus subtilis in apple replant disease soil[j]. Can J Microbiol, 1992,38(12): [10] 周德庆. 微生物学实验手册 [M]. 上海 : 上海科学技术出版社,1986:65-70,178-l80. [11] 布坎南 R E, 吉本斯 N E. 伯杰细菌鉴定手册 [M]. 北京 : 科学出版社,1984: [12] 东秀珠, 蔡妙英, 等. 常见细菌系统鉴定手册 [M]. 北京 : 科学出版社,2001: [13] Wisotzkey J D,Jurtshuk P Jr,Fox G E,et al. Comparative sequence analyses on the 16S rrna(rdna)of Bacillus acidocaldarius,bacillus acidoterrestris,and Bacillus cycloheptanicus and proposal for creation of a new genus,alicyclobacillus gen[j]. Journal of Systematic Bacteriology,1992,42(2): [14] 李金霞, 程池, 姚粟, 等. Biolog 微生物自动分析系统 : 酵母菌鉴定操作规程的研究 [J]. 食品与发酵工业,2006, 32(7):50-53.

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