2 简介 AllPure Tissue Kit 是从动物组织样品中提取 RNA 小分子 RNA DNA 和蛋白质最为快速和简单的方法试剂盒采用硅胶柱纯化技术, 抽提过程中无需用到危险的酚氯仿抽提, 也无需用到耗时的醇类沉淀试剂盒适合从 5~50mg 动物组织样品中提取得总 RNA, 小分子 RNA DNA 和蛋白质得到的 RNA 可直接用于 RT-PCR Northern Blot 核酸保护和体外翻译等实验得到的 DNA 可直接用于 PCR Southern 杂交等得到的 Protein 可直接用于 SDS-PAGE 电泳 Western 杂交等原理 HiPure 硅胶柱以高结合力的玻璃纤维滤膜为基质滤膜在高浓度离子化剂 ( 如盐酸胍或异硫氰酸胍 ) 条件下, 可通过氢键和静电等物理化学作用吸附核酸, 而蛋白质和其它杂质则不被吸附而去除吸附了核酸的滤膜经洗涤去除残留的蛋白质和盐, 最后可以用低盐缓冲液 ( 如 Buffer TE) 或水, 洗脱出滤膜上吸附的核酸得到的核酸纯度高, 可直接用于各种下游实验 AllPure Tissue Kit 基于硅胶柱纯化方式细胞在含高浓度异硫氰酸胍裂解液中匀浆裂解,RNA 和 DNA 释放到裂解液中由于裂解液中含有高浓度异硫氰酸胍, 内源性或外源性的核酸酶变性而失活,RNA 和 DNA 被保护起来转移至 DNA 结合柱吸附 DNA, 滤液经酚氯仿抽提, 分别得到上清液 ( 含 RNA) 和下层有机相 ( 含酚氯仿 ) 上清加入乙醇调节结合条件, 转移至 RNA 柱子吸附 RNA DNA 和 RNA 柱子经 Buffer Buffer RWC 洗涤蛋白质和其它杂质, 经 Buffer RW2 洗涤去除盐分,RNA 被 RNase-Free Water (DEPC 处理水 ) 洗脱 DNA 被灭菌水洗脱收集有机相溶液, 加入异丙醇沉淀回收蛋白质, 最后加入合适的缓冲液溶解蛋白质第 2 页共 16 页

3 组成 AllPure Tissue Kit 产品编号 R R R 纯化次数 10 次 50 次 250 次 HiPure RNA Mini Columns HiPure DNA Mini Columns II ml Collection Tubes Buffer RL 10 ml 40 ml 180 ml Buffer PHC 10 ml 40 ml 180 ml Buffer PWB 2 ml 10 ml 2 x 25 ml Buffer DW1 6 ml 30 ml 150 ml Buffer RW2 10 ml 2 x 20 ml 3 x 50 ml RNase-Free Water 2 ml 20 ml 50 ml Buffer AE 2 ml 10 ml 50 ml 说明书保质期 AllPure Tissue Kit 除 Buffer PHC 外, 其余组分可在室温下 (15-25 ) 干燥保存 12 个月 Buffer PHB 需置于 2-8 保存低温下,Buffer RL 可能会有沉淀形成, 需 55 水浴让沉淀完全溶解后使用因 RNase Free Water 处理水中不含任何抑菌因子, 室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染我们推荐分装 RNase Free Water 并保存于 -20, 以减少污染若 RNase Free Water 受到污染, 请重新制配 RNase Free Water 的配制 : 在试剂瓶中装入适量去离子水, 加入 0.1% DEPC, 磁力搅拌器搅拌过夜, 于 120 灭菌分钟处理后, 分装保存于 2-8 或 -20 灭菌后 DEPC 处理水有乙醇气味, 属于正常现象第 3 页共 16 页

4 需要准备材料和工具 ( 可选 )14.3M β- 疏基乙醇 (β-me) 或 1M DTT: 使用前, 分装适量的 Buffer RL, 每 1ml Buffer RL 加入 20µl β- 疏基乙醇 Buffer RL/β-ME 混合液可室温稳定放置 1 个星期 β-me 有较强的气味, 可用 1 M DTT (Dithiothreitol) 代替用 DEPC 处理水或灭菌水配制 1M DTT, 分装保存于 -20 按 1ml Buffer RL 加入 20µl 1M DTT, 该混合液可于室温放置 2 天氯仿无水乙醇 (96-100%) 无 RNase 酶的 1.5ml 离心管无 RNase 酶的枪头手套按瓶子标签所示, 加入适量的无水乙醇稀释 Buffer RW2, 并于室温保存按瓶子标签所示, 加入适量的无水乙醇稀释 Buffer PWB, 并于室温保存 R 加入 38ml 无水乙醇 (100%) R 加入 190ml 无水乙醇 (100%) R 每瓶加入 475ml 无水乙醇 (100%) 第 4 页共 16 页

5 样品的打散和匀浆样品的打散及匀浆是所有 RNA 提取所必需的步骤样品的打散是让组织或细胞块快速分散细胞壁和细胞质膜破裂, 从而使核酸释放到裂解液中匀浆是指用适当的方法打断高分子量的基因组 DNA 和细胞内高分子量的物质, 以降低溶液的粘稠度打散和匀浆不充分都可能会导致 RNA 产量和纯度下降, 还有可能引起柱子的堵塞 A: 液氮处理在处理液氮的时候, 请戴上手套并小心处理切出适量的组织置于预冷的研钵中, 迅速加入液氮, 将组织研磨成粉末, 然后将粉末倒入预冷的离心管中 ( 注意预先冷却离心管, 否则样品倒入时, 液氮沸腾而损失样品 ) 称重并加入适当的 RL Buffer/β-ME, 涡旋混匀由于液氮研磨只能起到打散样品的作用, 所以最好再用注射器或机械匀浆器进行匀浆, 以减低裂解液的粘稠度 B: 机械匀浆器匀浆机械匀浆器能高效匀浆大部分的组织和细胞把样品置于合适的玻璃管或离心管中, 加入裂解液, 把探头插入裂解液中, 高速间断匀浆, 每次为秒直至样品完全匀浆使用机械匀浆器时, 一般组织都可以在一分钟内达到理想的匀浆效果大部分的机械匀浆器都带有不同大小的探头, 小体积的裂解液适合使用较小的探头 C: 玻璃匀浆器玻璃匀浆器是常用的匀浆工具能有效处理软组织如肝脏脾脏肾脑等把样品和适量的裂解液转移至玻璃匀浆器中, 上下推磨至组织块被充分打散由于破璃匀浆磨只能起到打散样品的作用, 所以最好再用注射器匀浆几次, 以减低裂解液的粘稠度 D: 注射器处理培养细胞或小量动物柔软组织, 如脑胚胎等可用小型注射器 ( 带 20# 针头 ) 进行抽打此外, 小型注射器还可以同时打断基因组 DNA 和其它高分子物质, 起到降低裂解液的粘稠度的作用注射器匀浆方式是处理细胞最常用的方法第 5 页共 16 页

6 方案 1. 动物软组织核酸和蛋白质共提取该方案适合于从 5~30mg 动物软组织, 如肝脏脾脏肾脏, 脑等样品中提取基因组 DNA 总 RNA( 含小分子 RNA) 和总蛋白质动物组织如肌肉, 结缔组织皮肤富含高分子量的肌纤维, 需按方案 2 进行操作以下离心均在室温下进行组织用量正确的组织用量是获得理想 RNA 产量和纯度的关键该试剂盒的组织用量可低至 0.1mg, 而最大的组织用量则取决于样品中 RNA 的含量蛋白质和杂质的含量肝脏含有大量蛋白质, 组织用量 20mg; 脾脏胸胰组织含大量 DNA, 裂解液非常粘稠, 组织用量能太多 15mg; 若处理的组织没有相关的信息, 我们推荐第一次起始用量为 15mg, 根据获得的结果再调整组织用量不管何种情况, 组织用量都不应超过 30mg 1. 组织的裂解和匀浆 : 5~15mg 动物软组织 : 使用 400µl RL Buffer/DTT; 15~30mg 动物软组织 : 使用 600µl RL Buffer/DTT; 选择合适的匀浆工具进行匀浆, 详细参照第 5 页的样品的打散及匀浆 2. 室温下,14,000 x g 离心 5 分钟按第 3 步进行操作提取 DNA 3. 把 HiPure DNA Mini Column II 装在 2ml 收集管中把第二步获得的上清液转移至 DNA 过滤柱中 14,000 x g 离心 1~2 分钟转移滤液至新的 2ml 离心管中, 用于 RNA 和蛋白质的抽提 4. 把 HiPure DNA Mini Column II 装回 2ml 收集管中加入 500µl Buffer DW1 至柱子中 10,000 x g 离心 30~60 秒 5. 倒弃流出液, 把柱子装回收集管中加入 500µl Buffer RW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中 10,000 x g 离心 30~60 秒 6. 倒弃流出液, 把柱子装回收集管中加入 500µl Buffer RW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中 10,000 x g 离心 30~60 秒 7. 倒弃流出液, 把柱子套回空的收集管 10,000 x g 离心空柱 1 分钟, 以甩干柱子的基质第 6 页共 16 页

7 8. 将 DNA 柱子装在 1.5ml 离心管中加入 50~100µl 预热至 70 C Buffer AE 至柱子的膜中央室温静置 5 分钟,10,000 x g 离心 1 分钟弃去 DNA 柱, 把 DNA 保存于 2~8 C 或 -20 C ( 可选 ) 若需获得更高产量 DNA, 再加入 50~100µl 预热至 70 Buffer AE 至柱子的膜中央室温静置 5 分钟 10,000 g 离心 1 分钟提取总 RNA( 含小分子 RNA) 9. 取第三步得到的滤液加入等倍体积的 Buffer PHC, 涡旋混匀 20 秒然后再加入总体积为 0.2 倍体积的氯仿, 涡旋混匀 20 秒室温下,10,000 x g 离心 5 分钟 ( 举例 ) 若滤液体积为 500µl, 则需加入 500µl 的 Buffer PHC, 混匀后再加入 200µl 的氯仿 10. 转移上清液至新的 2ml 离心管中保留下层溶液用于蛋白质抽提 11. 加入 1.5 倍体积的无水乙醇至上清液, 颠倒或涡旋混匀若需分离大分子 RNA 和小分子 RNA, 按方案 3 进行操作 12. 把 HiPure RNA Mini Column 装在 2ml 收集管中转移 700µl 混合液至柱子中 10,000 x g 离心 30~60 秒 13. 倒弃滤液, 把柱子装回收集管中转移剩余的混合液至柱子 10,000 x g 离心秒 14. 倒弃滤液, 把柱子装回收集管加入 600µl Buffer RW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱中,10,000 g 离心秒 Buffer RW2 在使用之前, 须按瓶子标签指示加入无水乙醇进行稀释 15. 倒弃滤液, 把柱子装回收集管加入 600µl Buffer RW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱中,10,000 g 离心秒 16. 倒弃流出液, 把柱子装回收集管 10,000 g 离心空柱 2 分钟, 以甩干柱子的基质 ; 这一步可彻底去除柱子中残留的乙醇 17. 将柱子转移至 1.5ml 离心管加入 30-50µl RNase Free Water 至柱子膜中央室温静置 2 分钟 10,000 g 离心 1 分钟弃去柱子, 把 RNA 保存于 -80ºC 第 7 页共 16 页

8 HiPure RNA Column 最小的洗脱体积是 30µl, 小于 30µl 会导致 RNA 的洗脱效率下降若 RNA 产量超过 30µg, 推荐进行第二次洗脱提取总蛋白质 18. 取第 10 步获得的下层有机相溶液, 并转移至合适的离心管中 19. 加入 3 倍体积的异丙醇至有机相溶液中, 涡旋混匀 20. 室温静置 10 分钟 21. 4ºC,12,000 x g 离心 10 分钟沉淀蛋白质倒弃上清液 22. 加入 1.5ml Buffer PWB( 已加乙醇 ) 至蛋白沉淀中, 涡旋混匀室温静置 20 分钟 23. 4ºC,7,500 x g 离心 10 分钟沉淀蛋白质倒弃上清液 24. 重复第 22~23 步一次 25. 加入 1.5ml 无水乙醇至蛋白沉淀中, 涡旋混匀室温静置 20 分钟 26. 4ºC,7,500 x g 离心 10 分钟沉淀蛋白质倒弃上清液 27. 空气干燥 10 分钟 28. 加入适量体积的 1~5% SDS Buffer 或 SDS-PAGE Loading Buffer(100~200µl) 至沉淀物, 用移液枪反复吸打让沉淀充分分散 ( 可选 )55ºC 振荡温育 30~120 分钟让蛋白质充分溶解 29. 4ºC,10,000 x g 离心 5 分钟去除不溶解的物质 30. 转移上清至新的离心管中, 用于蛋白质分析实验第 8 页共 16 页

9 方案 2. 难裂解动物组织核酸和蛋白质共提取该方案适合于从 30~50mg 肌肉, 皮肤, 结缔组织等富含高分子量的肌纤维样品中提取核酸和蛋白质以下离心均在室温下进行 1. 称取 30~50mg 组织, 加入 500µl RL Buffer 和 500µl Buffer PHC 选择合适的匀浆工具进行匀浆, 详细参照第 6 页的样品的打散及匀浆 2. 静置 5 分钟室温下,14,000 x g 离心 3 分钟去除不溶解的物质 3. 转移上清液至新的离心管中, 加入 200µl 氯仿, 涡旋混匀室温下,14,000 x g 离心 3 分钟提取 DNA 4. 把 HiPure DNA Mini Column II 装在 2ml 收集管中把第三步获得的上清液转移至 DNA 柱中 10,000 x g 离心 1 分钟转移滤液至新的 2ml 离心管中, 用于 RNA 保留有机相溶液用于蛋白质的抽提 5. 取 HiPure DNA Mini Column II 装回 2ml 收集管中加入 500µl Buffer DW1 至柱子中 10,000 x g 离心 30~60 秒 6. 倒弃流出液, 把柱子装回收集管中加入 500µl Buffer RW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中 10,000 x g 离心 30~60 秒 7. 倒弃流出液, 把柱子装回收集管中加入 500µl Buffer RW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中 10,000 x g 离心 30~60 秒 8. 倒弃流出液, 把柱子套回空的收集管 10,000 x g 离心空柱 1 分钟, 以甩干柱子的基质 9. 将 DNA 柱子装在 1.5ml 离心管中加入 30~100µl 预热至 65 C Buffer AE 至柱子的膜中央室温静置 5 分钟,10,000 x g 离心 1 分钟弃去 DNA 柱, 把 DNA 保存于 2~8 C 或 -20 C ( 可选 ) 再加入 30~100µl 预热至 65 Buffer AE 至柱子的膜中央室温静置 3 分钟 10,000 g 离心 1 分钟第 9 页共 16 页

10 提取 RNA( 含小分子 RNA) 10. 取第 4 步得到的滤液加入 1.5 倍体积的无水乙醇至上清液, 涡旋混匀若需分离大分子 RNA 和小分子 RNA, 按方案 3 进行操作 11. 把 HiPure RNA Mini Column 装在 2ml 收集管中转移 700µl 混合液至柱子中 10,000 x g 离心 30~60 秒 12. 倒弃滤液, 把柱子装回收集管中转移剩余的混合液至柱子 10,000 x g 离心秒 13. 倒弃滤液, 把柱子装回收集管加入 600µl Buffer RW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱中,10,000 g 离心秒 Buffer RW2 在使用之前, 须按瓶子标签指示加入无水乙醇进行稀释 14. 倒弃滤液, 把柱子装回收集管加入 600µl Buffer RW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱中,10,000 g 离心秒 15. 倒弃流出液, 把柱子装回收集管 10,000 g 离心空柱 2 分钟, 以甩干柱子的基质 ; 这一步可彻底去除柱子中残留的乙醇 16. 将柱子转移至 1.5ml 离心管加入 30-50µl RNase Free Water 至柱子膜中央室温静置 2 分钟 10,000 g 离心 1 分钟弃去柱子, 把 RNA 保存于 -80ºC HiPure RNA Column 最小的洗脱体积是 30µl, 小于 30µl 会导致 RNA 的洗脱效率下降若 RNA 产量超过 30µg, 推荐进行第二次洗脱提取总蛋白质 17. 取第 4 步获得的下层有机相溶液, 并转移至合适的离心管中 18. 加入 3 倍体积的异丙醇至有机相溶液中, 涡旋混匀 19. 室温静置 10 分钟 20. 4ºC,12,000 x g 离心 10 分钟沉淀蛋白质倒弃上清液 21. 加入 1.5ml Buffer PWB( 已加乙醇 ) 至蛋白沉淀中, 涡旋混匀室温静置 20 分钟第 10 页共 16 页

11 22. 4ºC,7,500 x g 离心 10 分钟沉淀蛋白质倒弃上清液 23. 重复第 22~23 步一次 24. 加入 1.5ml 无水乙醇至蛋白沉淀中, 涡旋混匀室温静置 20 分钟 25. 4ºC,7,500 x g 离心 10 分钟沉淀蛋白质倒弃上清液 26. 空气干燥 10 分钟 27. 加入适量体积的 1~5% SDS Buffer(100~200µl) 至沉淀物, 用移液枪反复吸打让沉淀充分分散 55ºC 振荡温育 30~120 分钟让蛋白质充分溶解 28. 4ºC,10,000 x g 离心 5 分钟去除不溶解的物质 29. 转移上清至新的离心管中, 用于蛋白质分析实验第 11 页共 16 页

12 方案 3. 大分子和小分子 RNA 分离该方案适合于方案 1 或方案 2 中分别提取大分子 RNA 和小分子 RNA, 以下离心都在室温下进行 1. 按方案 1 的第 1~3 步方案 2 的第 1~4 步进行操作获得含 RNA 的滤液 2. 加入等倍体积的 70% 乙醇至滤液中, 用移液枪吸打 3~5 次大分子 RNA 的分离 3. 把 HiPure RNA Mini Column 装在 2ml 收集管中转移第 3 步的混合液 ( 700µl) 至 RNA 柱子中 10,000 x g 离心 1 分钟保留或收集滤液至新的离心管中, 用于小分子 RNA 的富集 4. ( 若混合液超过 700µl) 把柱子装回收集管中把剩余混合液转移至 DNA 柱子中 10,000 x g 离心秒保留或收集滤液至新的离心管中, 用于小分子 RNA 的富集 5. 倒弃滤液, 把柱子装回收集管加入 600µl Buffer RW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱中,8,000 g 离心秒 Buffer RW2 在使用之前, 须按瓶子标签指示加入无水乙醇进行稀释 6. 倒弃滤液, 把柱子装回收集管加入 600µl Buffer RW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱中,8,000 g 离心秒 7. 倒弃流出液, 把柱子装回收集管 10,000 g 离心空柱 2 分钟, 以甩干柱子的基质 ; 这一步可彻底去除柱子中残留的乙醇 8. 将柱子转移至 1.5ml 离心管加入 30-50µl RNase Free Water 至柱子膜中央室温静置 2 分钟 10,000 g 离心 1 分钟弃去柱子, 把 RNA 保存于 -80ºC HiPure RNA Column 最小的洗脱体积是 30µl, 小于 30µl 会导致 RNA 的洗脱效率下降若 RNA 产量超过 30µg, 推荐进行第二次洗脱小分子 RNA 的富集 9. 测量滤液体积 ( 第 3~4 步 ), 加入 0.65 倍体积的无水乙醇至滤液中, 用移液枪第 12 页共 16 页

13 吸打混匀 3~5 次 ( 举例 : 若滤液体积为 1ml, 则需加入 0.65ml 无水乙醇 ) 10. 把 HiPure RNA Mini Column 装在 2ml 收集管中转移 700µl 混合液至 RNA 柱子中 10,000 x g 离心 30~60 秒收集滤液并转移至合适的离心管中或倒弃滤液 11. 把柱子装在收集管中继续把混合液转移至 RNA 柱子中 10,000 x g 离心 30~60 秒收集滤液并转移至离心管或倒弃滤液重复此步直至所有混合液转移至柱子中并离心若需提取蛋白质, 把收集滤液保存起来, 按附加方案 4 进行总蛋白质的提取若不需要提取蛋白质, 倒弃滤液 12. 倒弃流出液, 把 RNA 柱子装回收集管中加入 600µl Buffer RW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中 10,000 g 离心秒 Buffer RW2 在使用之前, 必须用无水乙醇进行稀释按瓶子标签或说明书进行稀释 13. 倒弃流出液, 把 RNA 柱子装回收集管中加入 600µl Buffer RW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中,10,000 g 离心秒 14. 倒弃流出液, 把 RNA 柱子装回收集管中 10,000 g 离心空柱 3 分钟 15. 把柱子装在新的 1.5ml 离心管中加入 15~50µl DEPC 水至柱子的膜中央室温静置 2 分钟 10,000 g 离心 1 分钟 16. 弃去 RNA 柱子, 把 mirna 保存于 -80 C 第 13 页共 16 页

14 常见问题回答该列表可能有利于解决提取过程所碰到的问题 Magen 技术人员可以随时为您提供服务, 若您对试剂盒存在问题或建议, 或您在分子生物学上碰到问题, 都请您联系我们我们将竭尽所能为您排忧解难现象柱子堵塞样品匀浆不充分样品起始用量太多低温离心原因及解决方法用匀浆器进一步匀浆, 提高样品的裂解效果 ; 减少样品用量或增加裂解液 RL 的用量 ; 减少样品用量正确的样品用量是获得理想结果的先决条件 ; 过多的细胞用量反而会造成产量和纯度的下降试剂盒中除特别指明, 所有的离心操作都必须在室温 (20-25 ) 离心条件低于 20 时, 可能会导致沉淀的形成而引起柱子堵塞 RNA 产量低样品匀浆不充分样品起始用量太多 RNA 的洗脱效率低培养液没彻底去除 Buffer RW2 没有加入乙醇稀释参照上面参照上面 DEPC 水需直接加到膜上, 并静置 2 分钟后, 再离心洗脱 ; 加入 DEPC 水太少建议进行第二次或第三次洗脱从细胞中提取 RNA 时, 要把培养液彻底吸弃 Buffer RW2 使用前, 必须加入无水乙醇进行稀释 RNA 降解样品用量太多 RNA 酶污染 β- 疏基乙醇或 DTT 减少样品用量正确样品用量是获得理想结果的先决条件操作过程引入 RNA 酶的污染或溶液污染使用前, 分装适量的 Buffer RL, 每 1ml Buffer RL 加入 20µl β- 疏基乙醇或 1M DTT, 以提高裂解液的抑制能力第 14 页共 16 页

15 DNA 污染样品用量太多样品匀浆不充分减少细胞用量提高匀浆效果打断高分子量基因组 DNA, 降解裂解液的粘稠度下游实验结果不理想盐类污染乙醇污染加入 Buffer RW2 后, 静置 3 分钟再离心确保空柱离心时速度 12,000xg, 离心时间为 2 分钟膜材料脱落 A260/230 太高硅胶膜在离心过程中可能会发生脱落脱落的颗粒是不溶解的, 可通过 12,000 x g 离心 2 分钟去除由于异硫氰酸胍在 A230 中有较高的本底吸收峰当核酸浓度低于 50ng/ul 时, 较高的本底 A230 吸收峰, A260/230 有可能小于 1.0, 但不会影响抑制下游应用第 15 页共 16 页

16 Note: 第 16 页共 16 页

封面1

封面1 HiPure Plant DNA Kits 广谱性植物 DNA 抽提试剂盒从各种植物样品中提取植物 DNA 目录简介 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 原理 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

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