Microsoft Word - RNA大量制备试剂盒 ver301.doc

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肃惠
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1 AxyPrep 总 RNA 大量制备试剂盒本试剂盒用于从各种动物组织植物组织细胞细菌酵母和丝状真菌中提取总 RNA 提取的总 RNA 分子完整纯度高, 适用于 Northern Blot RT-PCR 体外翻译 Primer Extension S1 核酸酶作图 RNase 保护测定构建 cdna 文库等各种分子生物学实验一试剂盒组成贮存稳定性 Cat. No. AP-MX-MS-RNA-2 AP-MX-MS-RNA-10 AP-MX-MS-RNA-25 制备次数 2 preps 10 preps 25 preps Maxiprep RNA column Lysate Filtration column Buffer R-Ⅰ 40 ml 180 ml 450 ml Buffer R-Ⅱ 15 ml 70 ml 160 ml Buffer W1A concentrate 24 ml 120 ml 288 ml Buffer W2 concentrate 24 ml 120 ml ml Buffer TE (nuclease-free) 6 ml 30 ml 80 ml 说明书 Maxiprep RNA column: 大量制备管室温密闭贮存 Lysate Filtration column: 过滤柱, 用于 DNA 和蛋白质的去除室温密闭贮存 Buffer R-Ⅰ: 细胞裂解液室温密闭贮存 Buffer R-Ⅱ: 中和液室温密闭贮存 Buffer W1A concentrate: 洗涤液使用前, 按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇 ( 可用 100% 乙醇或 95% 乙醇 ) 混合均匀, 室温密闭贮存 Buffer W2 concentrate: 去盐液使用前, 按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇 ( 可用 100% 乙醇或 95% 乙醇 ) 混合均匀, 室温密闭贮存 Buffer TE (nuclease-free): 洗脱液 10 mm Tris-Cl,0.1 mm EDTA,pH 7.5 室温密闭贮存二注意事项 Buffer R-Ⅰ 和 Buffer W1A 含刺激性化合物, 操作时要戴乳胶手套和眼镜, 避免沾染皮肤眼睛和衣服, 谨防吸入口鼻若沾染皮肤眼睛时, 要立即用大量清水或生理盐水冲洗, 必要时寻求医疗咨询三实验准备 1. 第一次使用时, 在 Buffer W1A concentrate 和 Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定体积加入无水乙醇或 95% 乙醇 2. 所有试剂用 DEPC 处理过的溶剂配制请选用 RNase-free 枪头和离心管, 以避免提取过程中 RNA 被 RNase 降解 Page 1

2 四操作步骤不同的样品提取总 RNA 的操作中略有区别, 具体步骤分述如下 : 从动物组织中提取总 RNA 1. 取 g 组织, 转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请按下面说明使用组织的量 : RNA 丰富的组织 ( 如肝脏 ) RNA 含量低的组织 ( 如肌肉 ) 当使用的组织量小于 0.4g 时当使用的组织量大于 1.2g 时不超过 0.8 g 不超过 1.5 g R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量都减半 R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量按比例增加 * 当组织的用量比较大时, 可以先切碎再加少量 Buffer R-Ⅰ, 然后用匀浆器或组织捣碎器快速充分匀浆, 并在步骤 2 加 Buffer R-Ⅰ 时扣除匀浆时已加的 Buffer R-Ⅰ 体积 2. 加 16ml Buffer R-Ⅰ, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 50 ml 离心管中 3. 加 6ml Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,8,000 g 离心 10 min 4. 转移上清到过滤柱中, 插入注射器芯, 垂直向下缓慢推注, 使滤过液流入 50 ml 离心管中, 滤过液加 10ml 异丙醇, 混和均匀 7A. 弃滤液, 将制备管置回到 50 ml 离心管中, 制备管中加 20 ml Buffer W2,8,000 g 离心 5 min; 以同样的方法再用 10 ml Buffer W2 洗涤一次 Page 2

3 从植物组织中提取总 RNA 1. 取 g 组织, 转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请按下面说明使用组织的量 : 植物叶子植物纤维组织当植物叶组织量小于 0.4g 时当植物叶组织量大于 1.2 g 时当植物纤维组织量大于 1.5 g 时通常用量 g 通常用量 g R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量都减半 R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量按比例增加 R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量按比例增加 * 当组织的用量比较大时, 可以先切碎再加少量 Buffer R-Ⅰ, 然后用匀浆器或组织捣碎器快速充分匀浆, 并在步骤 2 加 Buffer R-Ⅰ 时扣除匀浆时已加的 Buffer R-Ⅰ 体积 2. 加 16ml Buffer R-Ⅰ, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 50 ml 离心管中 3. 加 6ml Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,8,000 g 离心 10 min 4. 转移上清到过滤柱中, 插入注射器芯, 垂直向下缓慢推注, 使滤过液流入 50 ml 离心管中, 滤过液加 10ml 异丙醇, 混和均匀 Page 3

4 7A. 弃滤液, 将制备管置回到 50 ml 离心管中, 制备管中加 20 ml Buffer W2,8,000 g 离心 5 min; 以同样的方法再用 10 ml Buffer W2 洗涤一次从细胞中提取总 RNA 本方案适用于从的细胞中提取总 RNA 收集细胞, 并进行细胞计数, 如果细胞数小于 ,R-I,R-Ⅱ 和异丙醇用量减半如果细胞数大于 ,R-I,R-Ⅱ 和异丙醇按比例增加 1. 收集的细胞,2,000 g 离心 5 min, 弃上清 2. 加 16ml Buffer R-Ⅰ, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 50 ml 离心管中 3. 加 6ml Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,8,000 g 离心 10 min 4. 转移上清到过滤柱中, 插入注射器芯, 垂直向下缓慢推注, 使滤过液流入 50 ml 离心管中, 滤过液加 10ml 异丙醇, 混和均匀 Page 4

5 7A. 弃滤液, 将制备管置回到 50 ml 离心管中, 制备管中加 20 ml Buffer W2,8,000 g 离心 5 min; 以同样的方法再用 10 ml Buffer W2 洗涤一次从细菌中提取总 RNA 1. 收集的细菌,6,000 g 离心 10 min, 弃上清用 200 μl PBS 充分悬浮菌体并转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请进行细菌计数, 对于大肠杆菌而言, /ml 细菌的 OD 如果细菌量小于 ,R-I,R-Ⅱ 和异丙醇用量减半如果细菌量大于 ,R-I,R-Ⅱ 和异丙醇按比例增加 2. 加 16ml Buffer R-Ⅰ, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 50 ml 离心管中 3. 加 6ml Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,8,000 g 离心 10 min Page 5

6 4. 转移上清到过滤柱中, 插入注射器芯, 垂直向下缓慢推注, 使滤过液流入 50 ml 离心管中, 滤过液加 10ml 异丙醇, 混和均匀 7A. 弃滤液, 将制备管置回到 50 ml 离心管中, 制备管中加 20 ml Buffer W2,8,000 g 离心 5 min; 以同样的方法再用 10 ml Buffer W2 洗涤一次从酵母中提取总 RNA 本方案用于从的酵母细胞中提取 RNA 请进行酵母细胞计数, 也可用如下方法估 Page 6

7 算 : 对于一般酵母培养物而言, /ml 酵母细胞的 OD 如果酵母量小于 ,R-I,R- Ⅱ 和异丙醇用量减半如果酵母量大于 ,R-I,R-Ⅱ 和异丙醇按比例增加酵母的破碎和裂解方法有两种 : 机械法 ( 如下 a) 和酶法 ( 如下 b) 机械法采用加液氮研磨的方法, 酶法用 Lyticase 破壁形成原生质体步骤 1-4 根据酵母的破碎和裂解方式不同可以选择 a 或 b 两种实验方法 a. 机械法 1a. 收集的酵母细胞,6,000 g 离心 10 min, 弃上清用 200 μl PBS 充分悬浮酵母细胞并转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 2a. 加 16ml Buffer R-Ⅰ, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 50ml 离心管中 3a. 加 6ml Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,8,000 g 离心 10 min 4a. 取上清至 50ml 离心管中, 加 10ml 异丙醇, 混和均匀 b. 酶法配置 Buffer YE: 1 M 山梨糖醇 0.1 M EDTA, ph 7.5 使用前加入 0.1% (V/V) 的 β- 巯基乙醇 1b. 收集的酵母细胞到 50ml 离心管中,6,000 g 离心 10 min, 弃上清用 10ml 含有 Lyticase 的 Buffer YE 充分悬浮酵母细胞 30 C 保温 min, 并不时轻柔颠倒以形成原生质体 3,000 g 离心 5 min, 弃上清 * Lyticase 用量按每酵母细胞加 50 单位计算 2b. 加 16ml Buffer R-Ⅰ, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 50ml 离心管中 3b. 加 6ml Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,8,000 g 离心 10 min 4b. 取上清至 50ml 离心管中, 加 10ml 异丙醇, 混和均匀 7A. 弃滤液, 将制备管置回到 50 ml 离心管中, 制备管中加 20 ml Buffer W2,8,000 g 离心 5 min; 以同样的方法再用 10 ml Buffer W2 洗涤一次 Page 7

8 从丝状真菌中提取总 RNA 1. 取 g 菌丝体, 转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请按下面说明使用组织的量 : 当使用的组织量小于 0.4 g 时当使用的组织量大于 1.5 g 时 R-I,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量都减半 R-I,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量按比例增加 2. 加 16ml Buffer R-Ⅰ, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 50 ml 离心管中 3. 加 6ml Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,8,000 g 离心 5 min 4. 转移上清到过滤柱中, 插入注射器芯, 垂直向下缓慢推注, 使滤过液流入 50 ml 离心管中, 滤过液加 10ml 异丙醇, 混和均匀 Page 8

9 7A. 弃滤液, 将制备管置回到 50 ml 离心管中, 制备管中加 20 ml Buffer W2,8,000 g 离心 5 min; 以同样的方法再用 10 ml Buffer W2 洗涤一次 Page 9

10 五流程图加样品和 16ml Buffer R-I 裂解加 6ml Buffer R-Ⅱ 8,000 g 离心 10 min 中和转移上清至过滤柱中推注收集滤过液 DNA 蛋白质去除加 10ml 异丙醇结合加 15ml Buffer W1A 加 20ml Buffer W2 加 10ml Buffer W2 结合洗涤加 2ml Buffer TE (nuclease-free) ( 或 RNase-free 水 ) 洗脱 Page 10

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Microsoft Word - RNA中量制备试剂盒 ver3.doc AxyPrep 总 RNA 中量制备试剂盒本试剂盒用于从各种动物组织植物组织细胞细菌酵母和丝状真菌中提取总 RNA 提取的总 RNA 分子完整纯度高, 适用于 Northern Blot RT-PCR 体外翻译 Primer Extension S1 核酸酶作图 RNase 保护测定构建 cdna 文库等各种分子生物学实验一试剂盒组成贮存稳定性 Cat. No. AP-MD-MS-RNA-2