RC101 FastPure Cell Tissue Total RNA Isolation Kit PDF

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1 FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit RC101 Vazyme Biotech Co., Ltd. Web: Tel: Sales: Support: Service: Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 8.1

2 目 录 Contents 01/产品概述 本试剂盒可从动物细胞或组织中快速提取总RNA 试剂盒基于硅胶柱纯化技术 提取过程中无需 使用有毒的酚/氯仿抽提 全程仅需30 min 试剂盒中gDNA-Filter Columns能够有效地分离上清 并吸附去除gDNA RNAPure Columns能高效地结合RNA 配以优化后的Buffer溶液 使得到的 总RNA纯度高 无蛋白和其他杂质污染 可用于RT-PCR Real-Time PCR 芯片分析等多种下 游实验 02/产品组分 组分 Buffer RL1 Buffer RL2 Buffer RW1 Buffer RW2 RNase-free ddh2o Buffer RDD DNase I RNase-free gdna-filter Columns (each in a 2 ml Collection Tube) RNAPure Columns (each in a 2 ml Collection Tube) RNase-free Collection Tubes 1.5 ml RC (50 rxn) 30 ml 15 ml 60 ml 36 ml 10 ml 6 ml 250 μl Buffer RL1 提供动物组织和细胞裂解所需的环境 Buffer RL2 提供RNA特异性上柱环境 Buffer RW1 去除RNA中的蛋白质 DNA等杂质 Buffer RW2 去除RNA中的盐离子残留 RNase-free ddh2o 洗脱纯化柱膜上的总RNA Buffer RDD 提供DNase I消化所需的缓冲环境 DNase I RNase-free 去除gDNA的残留 gdna-filter Columns DNA吸附柱 并除去裂解杂质 RNAPure Columns 特异性吸附RNA 01/产品概述 /产品组分 /保存条件 /适用范围 /自备材料 /注意事项 /实验原理与流程概要 Collection Tubes 2 ml 滤液收集管 RNase-free Collection Tubes 1.5 ml RNA收集管 03/保存条件 DNase I置于-20 保存 Buffer RL1在加入β-巯基乙醇后 可在4 保存1个月 其余组分均可在常温(15-25 )干燥条件下保存 08/使用方案 /样本处理 /RNA提取 /常见问题及解决方案 / 02

3 04/适用范围 07/实验原理与流程概要 1-20 mg动物组织 <5 106 培养细胞 05/自备材料 β-巯基乙醇 无水乙醇 RNase-free枪头等 步骤一 步骤一 动物组织 mg 收集细胞 个细胞 组织匀浆 500 μl Buffer RL1 裂解细胞 500 μl Buffer RL1 06/注意事项 操作前在 Buffer RL1 中加入β- 巯基乙醇至终浓度为 1% 如每 1 ml Buffer RL1 中加入 10 μl β- 巯基乙醇 此裂解液建议现配现用 Buffer RL1 加入β- 巯基乙醇后可在 4 保 存 1 个月 若试剂盒于 2-8 保存 使用前请检查 Buffer RL1 和 Buffer RW2 中是否有晶体析出 步骤二 转移组织匀浆液或细胞裂解液转移到 gdna-filter Columns 13,000 g 离心 2 min 后收集滤液 若有晶体析出 可将 Buffer 放置室温或者 37 加热使晶体溶解 混匀后方可使用 首次 使用前 请参考瓶上标签 在 Buffer RL2 与 Buffer RW2 中加入相应的无水乙醇 标注后 室温储存 所有操作步骤 如果没有特别指出 均在常温 (15-25 ) 下进行 样品处理量控制在 mg 组织或 个细胞 样品量过多会导致基因组 DNA 残留或产量降低 并可能会导致 gdna-filter Columns 柱堵塞 使用本试剂盒时 请穿戴实验服 一次性乳胶手套 一次性口罩 使用 RNase-free 耗材 等 最大程度的避免 RNase 污染 样本的选择及保存在很大程度上会影响 RNA 的产量及质量 应尽可能的采用新鲜的动 物组织或细胞进行 RNA 提取 如果采集的样本不能及时进行提取 可以将新采集的样本 立即置于液氮中速冻后于 -70 保存 并避免反复冻融 或者将样本立即置于 Buffer RL1 裂解液中匀浆后 置于 -70 保存 为了避免 RNA 的降解 样本的采集与保存应尽可能 迅速进行 样本破碎需彻底 样本破碎不充分将影响 RNA 的产量以及进行裂解物分离操作时容易 发生离心柱堵塞 匀浆时尽量控制温度 防止因匀浆过程产生的热量导致 RNA 降解 本试剂盒可去除体系中 95% 的 DNA 污染 纯化获得的 RNA 通常无需使用 DNase I 处 理即可用于下游实验操作 如果下游实验对微量 DNA 十分敏感 可以使用本产品所提供 的 DNase I 进一步清除 DNA 污染 具体过程详见 08-2/ 第 7 步 步骤三 添加 1.6 倍体积 Buffer RL2 到收集的滤液中 步骤四 将上述混合液加到 RNAPure Columns 中 13,000 g 离心 1 min, 弃废液 步骤五 去蛋白 加入 500 μl Buffer RW1(13,000 g 离心 1 min) 弃废液 脱盐 加入 700 μl Buffer RW2(13,000 g 离心 1 min) 弃废液 步骤六 ( 可选 ) 去除 gdna 残留 向膜中央加入 70 μl 的 DNase I 反应液 室温静置 min 重复步 骤五 步骤七 加入 700 μl Buffer RW2(13,000 g 离心 1 min) 去除残留乙醇 13,000 g 空管离心 2 min 步骤八 洗脱 μl RNase-free ddh2o 室温孵 育 2-5 min 13,000 g 离心 2 min 收集 RNA 03/ 04

4 08/使用方案 请在实验前仔细阅读此操作说明 本试剂盒适用于动物细胞及组织总RNA提取 请严格 按照其操作流程进行 本试剂盒已经过严格的测试 请在使用过程中勿改变各试剂使用 量 操作前在Buffer RL1中加入β-巯基乙醇并使其终浓度为1% 每1 ml Buffer RL1中加 入10 μl β-巯基乙醇 此裂解液建议现配现用 08-1/样本处理 动物组织 匀浆处理 取新鲜组织每10-20 mg 加入500 μl Buffer RL1 已加入β-巯基乙醇 用玻璃匀 浆器或者电动匀浆器将组织彻底研磨均匀 液氮研磨 将液氮研磨好的粉末立即转移到Buffer RL1 已加入β-巯基乙醇 中 按照每 mg 加入500 μl Buffer RL1 用移液器吹打均匀至无明显的粉末团 使用前在Buffer RL1加入β-巯基乙醇至终浓度为1% 如1ml Buffer RL1中加入10 μl β-巯基乙醇 尽量现配现用 组织量不要超过 20 mg 肝脏 脾脏 肾脏等组织DNA/RNA含量丰富的样本请勿超过10 mg 否 则会导致Total RNA的提取质量下降 匀浆过程尽量保证温度不超过25 防止匀浆过程中因为温度升高导致的Total RNA降解 匀浆完或者液氮研磨后混合均匀的液体如不立即进行下一步操作 可以置于-70 保存 培养细胞 贴壁细胞 不需消化 可直接使用Buffer RL1 已加入β-巯基乙醇 进行消化 裂解 或用胰酶消化后离心收集细胞加入Buffer RL1 已加入β-巯基乙醇 每 个细胞 加入500 μl Buffer RL1 用移液器反复吹打混匀直至看不到细胞团为止 悬浮细胞 直接离心收集细胞 加入Buffer RL1 已加入β-巯基乙醇 每 个细 胞加入500 μl Buffer RL1 用移液器反复吹打混匀直至看不见细胞团为止 使用前在Buffer RL1加入β-巯基乙醇至终浓度为1% 如1ml Buffer RL1中加入10 μl β-巯基乙醇 尽量现配现用 每 个细胞加入500 μl Buffer RL1 2. 向收集管内上清液中加入 1.6 倍体积 Buffer RL2 已加入无水乙醇 轻柔混匀 上清液的体积一般为 500 μl 需加入 800 μl Buffer RL2 Buffer RL2 的加入量请按照实际操作过程中上清液的 体积按照相应比例进行添加 如果加入 Buffer RL2 后 溶液出现浑浊或絮状沉淀 属正常现象 吹打混匀后可直接进行下一步操作 3. 取步骤 2 混合液转移至 RNAPure Columns 中 RNAPure Columns 已放入收集管中 13,000 g 离心 1 min 吸附柱容积为 700μl 请分两次进行离心 请将步骤 2 里面出现的絮状沉淀混匀后一并转移到 RNAPure Columns 中进行离心 4. 弃掉废液后将 RNAPure Columns 吸附柱放回收集管中 将剩余的液体全部加入吸附柱中 13,000 g 离心 1 min 5. 向 RNAPure Columns 中加入 500 μl Buffer RW1 6. 向 RNAPure Columns 中加入 700 μl Buffer RW2 已加入无水乙醇 弃 废液 7. 痕量 DNA 去除 ( 可选 ) a.dnase I 反应工作液的配制 取 65 μl Buffer RDD 加入 RNase-free 离心管中 加入 5 μl 的 DNase I 轻柔混匀 b.向膜中央加入 70 μl 的 DNase I 反应工作液 室温静置 min c.向 RNAPure Columns 中加入 500 μl Buffer RW1 d.向 RNAPure Columns 中加入 700 μl Buffer RW2 8. 重复步骤 6 9. 将 RNAPure Columns 吸附柱放回收集管中 13,000 g 离心 2 min 以彻底去 RNAPure Columns 中残留的 Buffer RW2 向吸附柱中央部位悬空滴加 10. 将吸附柱转移至新的 RNase-free Collection Tubes 1.5 ml 离心管中 μl 的 RNase-free ddh2o 室温放置 2 min 13,000 g 离心 1 min 洗脱 RNA RNase-free ddh2o 的洗脱体积不应低于 50 μl 体积过小会影响洗脱效率 为提高 Total RNA 产量 可将 RNase-free ddh2o 提前 65 预热 并将 RNA 洗脱液重新加到 RNAPure Columns 纯化柱中 室温放置 2 min 13,000 g 离心 1min 弃掉 RNAPure Columns 11. 提取的 Total RNA 可直接用于下游实验或于 -70 保存 细胞裂解完后若不立即进行下一步操作 可以置于-70 保存 08-2/RNA提取 以下过程请在无RNase 污染的超净台中进行 1. 将处理好的匀浆转移到gDNA-Filter Columns中 gdna-filter Columns已放入收集管中 13,000 g 离心2 min 弃掉gDNA-Filter Columns 保留收集管内上清液 如果匀浆或研磨不彻底 组织使用量大于20 mg 先将匀浆液移至 1.5 ml离心管中 13,000 g 离心5 min后 再将上清转移到gDNA-Filter Columns中13,000 g 离心2 min 如果gDNA-Filter Columns收集管底部有沉淀产生 请将上清转移至新的RNase-free离心管中再进 行后续操作 切勿将沉淀吸入上清液中 05/ 06

5 09/常见问题分析 gdna-filter Columns堵塞问题 gdna-filter Column 堵塞通常会有以下原因造成 超量的组织 1. 样品用量太多 本试剂盒适用于提取 mg 动物组织或者 个细胞 会降低产量以及纯度 操作时应减少样本使用量 2. 样品富含肌纤维 肌肉 心脏以及皮肤等富含肌纤维 肌纤维的分子量大 会引起柱子堵塞 提取的RNA影响下游实验 1. 洗脱后 RNA 中有盐离子残留 纯化柱需要进行两次 Buffer RW2 洗涤 如果两次洗涤后还存 在盐离子残留 则在加入 Buffer RW2 后 室温放置 5 min 再进行离心操作 以最大程度上去除 盐离子污染 2. 洗脱后 RNA 有乙醇残留 确认 Buffer RW2 洗涤后 按操作说明所需的离心转速进行空管离 心操作 如果还有乙醇残留 可在空管离心后在室温放置 5 min 以最大程度上去除乙醇残留 样本处理时采用液氮研磨方式会降低堵柱现象 3. 组织研磨或者匀浆不充分 研磨或者匀浆不充分时 碎片有可能导致柱堵塞 将裂解后的液体 先进行 13,000 g 离心 5 min 取上清再加入 gdna-filter Columns 提取的RNA有基因组DNA污染 不同种类组织细胞 DNA RNA 含量相差很大 请勿超过 20 mg 组织和 细胞 如肝脏 脾 脏和肾脏 DNA 含量丰富 请勿超过 10 mg 否则会导致基因组残留过多 gdna-filter Columns 提取不到RNA或者RNA产量低 能够有效的去除体系中大部分 DNA 污染 如果下游实验对微量 DNA 十分敏感 可根据具体情 况选择选择使用以下方案 Total RNA 的提取过程中回收效率低通常会有以下原因造成 1. 用试剂盒提供的 DNase I 进行膜上消化清除 DNA 污染 具体过程详见 08-2/ 第 7 步 1. 样本保存不当或者样本保存时间过久 样本保存不当或者保存时间过长都有可能导致 2. 逆转录时选择含有基因组去除模块的逆转录试剂 推荐使用 HiScript II Q RT SuperMix for RNA 的降解 采集新鲜样本或经过液氮速冻后保存于 -70 或液氮中的样本 2. 匀浆或者液氮研磨不充分 匀浆或者液氮研磨不充分 裂解不充分 导致 RNA 的释放 qpcr (+gdna wiper) Vazyme #R 设计引物时选用跨内含子的引物 从而避免基因组 DNA 模板参与扩增反应 不充分 3. 洗脱不充分 RNase-free ddh2o 滴加到纯化柱膜中央 纯化柱的洗脱体积为 μl 若洗脱效果不理想 可以加入在 65 预热的 RNase-free ddh2o 后 延长室温放置时间 离心后进行第二次洗脱 RNA降解 纯化后的RNA降解与样本质量 是否被RNase 污染 操作方式等因素有关 1. 样本因为没有及时保存 导致RNA降解 组织样本或者细胞在收集后若不及时进行后 续实验 液氮速冻后于-70 保存 2. 样本反复冻融 组织样本保存时 分小块保存 避免因反复冻融导致的降解 3. 电泳原因 常见的RNA降解现象部分因为电泳过程引起的 电泳前将电泳槽用3 双 氧水浸泡20 min 然后用RNase-free ddh2o进行冲洗 电泳缓冲液用RNase-free ddh2o 配置 4. 确保提取过程中使用的枪头和离心管均为RNase-free 07/ 08

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