Gene Express 基因快讯 2010 年第 2 期特殊样本的 RNA 提取 RNA 提取是分子生物学研究的基础实验之一, 在进行 RNA 芯片 cdna 测序 cdna 文库构建 qpcr Northern Blot 等研究时都需要高质量的 RNA 但是有些样本因为细胞结构特殊代谢产物极

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成苍
5 years ago
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1 特殊样本的是分子生物学研究的基础实验之一, 在进行 RNA 芯片 cdna 测序 cdna 文库构建 qpcr Northern Blot 等研究时都需要高质量的 RNA 但是有些样本因为细胞结构特殊代谢产物极其丰富本身 RNA 含量少等这些因素, 影响到的质量另外, 由于 RNA 酶的广泛存在并难以消减的顽强特性, 使得 RNA 的抽提纯化更为困难本文将针对几种特殊样本的展开介绍一. 植物样本植物组织总 RNA 的提取较动物和微生物困难, 原因是植物具有坚硬的细胞壁, 富含多种次生代谢物, 如多糖多酚蛋白质等细胞破碎后, 这些物质会以不同方式干扰 RNA 的提取, 如酚类氧化后可使 RNA 活性丧失, 多糖可形成难溶胶状物质与 RNA 一起被沉淀 1. MN(MACHEREY-NAGEL,GERMAN) 针对植物, 推出了 NucleoSpin RNA Plant Kit 该款试剂盒较市场同类产品优点如下 : (1) 包含两种优化的 Lysis Buffers,RA1(guanidinium thiocyanate) 和 RAP(guanidinium-HCl), 也可选用更强劲的 Buffer RL1, 即使是次生代谢物非常丰富的植物组织和真菌都可以充分裂解裂解液中含 RNA 酶抑制剂, 裂解的同时保护了 RNA 不被内源性的 RNA 酶降解 (2) 包含 rdnase 和两种 Wash Buffer,RNA 纯度更高 (3) 配合 NucleoSpin RNA / DNA Buffer, 一次提取可同时获得同一样本来源的 RNA 和 DNA 可更精确研究 DNA RNA 调控关系 (4)RNA 得率高, 耗时少 0mg 组织可获得多达 70μg RNA,30 min/6 samples (5) 对至少 20 种植物进行测试, 具体植物种类可见产品说明书操作步骤如下 : 新鲜的植物组织或培养的植物细胞收集后立即液氮或 -70 保存样本液氮研磨样本裂解裂解产物过滤柱子预处理 RNA 挂膜去盐降解 DNA 洗膜 3 次洗脱 RNA RNA 收集保存 2. CENTRE(U.S.A)MasterPure Plant RNA Purification Kit 该款试剂盒较市场同类产品特点 : (1) 抽提纯化的 RNA 中包含 small RNA, 并可直接用于后续实验 (2) 采用沉淀法提取,RNA 得率更高 (3) 无需酚氯仿及腐蚀性溶剂二.FFPE 样本石蜡包埋组织样本是珍贵的分子生物学研究材料, 包含了大量临床病理信息, 但是由于它们的保存时间一般都比较长, 很不容易从中提取到可以进行 RT-PCR 的 RNA, 主要原因是 RNA 的降解和脱蜡过程中样品的丢失 1. MN(MACHEREY-NAGEL,GERMAN) 针对 FFPE, 推出了 NucleoSpin FFPE RNA Kit 该款试剂盒, 较市场同类产品优点如下 : (1) 专利脱蜡技术, 无需二甲苯或其它有机试剂, 无需反复清洗, 避免脱蜡过程中 RNA 损失, 脱蜡试剂无刺激性气味 (2) 柱子内部创新的漏斗环状设计, 超小膜面积, 洗脱体积最小至 5μL, 减少膜上 RNA 残留, 提高 RNA 浓度 (3)RNA 更完整, 最佳条件下可达 00 bases (4) 方便快捷,70 min/6 samples (5) 另有 NucleoSpin FFPE RNA/DNA Kit, 可同时获得同一样本来源的 RNA 和 DNA 更精确研究 DNA RNA 调控关系操作步骤如下 : 样本脱蜡热处理样本裂解去交联处理柱子预处理 RNA 挂膜去盐降解 DNA 洗膜 3 次洗脱 RNA RNA 收集保存 2. CENTRE QuickExtract FFPE RNA Extraction Kit 该款试剂盒较市场同类产品特点 : (1) 仅需热处理融蜡 (2) 热处理 30min 后, 得到的 RNA 就可进行 RT-PCR 适合高通量应用 (3) 一次提取可同时获得同一样本来源的 RNA 和 DNA 38

ArrayPure Nano-scale RNA Purification Kit( 图 1) 该试剂盒能最少从一个细胞中提取 RNA 该款试剂盒较市场同类产品优势 : 1. 从 1,000 个细胞中提取 RNA 2.

RNA XS Kit 样本上样量 tissue < 5mg,1-0,000 cultured cells, 柱子内部创新的漏斗环状设计, 超小膜面积, 洗脱体积最小至 5μL, 减少膜上 RNA 残留, 提高 RNA 浓度四.RNA 质量鉴定 1.

2 (4) 无需过柱子, 无需样本转移, 避免样本损失三. 珍贵少量样本一般的试剂盒都有最小上样量, 如果低于这个下限,RNA 的浓度和纯度都无法保证, 后续研究将无法进行因此对于临床活检显微切割等得到的非常少量的样本, 普通试剂盒是不适用的, 这就需要专门针对这类样本设计的试剂盒 CENTRE 针对这方面需求, 推出了 ArrayPure Nano-scale RNA Purification Kit( 图 1) 该试剂盒能最少从一个细胞中提取 RNA 该款试剂盒较市场同类产品优势 : 1. 从 1,000 个细胞中提取 RNA 2. 提取得到的 RNA 可直接用于后续实验, 例如 : real-time PCR 3. 含 RNase Inhibitor Proteinase K RNase-Free DNase 4. 无需过柱子, 最少 5μL 洗脱体积, 减少样本损失, 保证 RNA 浓度 5. 操作过程不涉及有毒试剂 6. 结合相应 protocol, 可用于 RNA 纯化 ( 去除 DNA) 操作步骤如下 : 细胞裂解 65 孵育冰上冷却加蛋白变性剂蛋白沉淀离心后上清转移至干净 EP 管中加异丙醇离心后去异丙醇沉淀晾干 RNA 溶解 MN 有相类似的 NucleoSpin RNA XS Kit 样本上样量 tissue < 5mg,1-0,000 cultured cells, 柱子内部创新的漏斗环状设计, 超小膜面积, 洗脱体积最小至 5μL, 减少膜上 RNA 残留, 提高 RNA 浓度四.RNA 质量鉴定 1. 紫外分光光度计检测 : 纯度 (OD260/280) OD260/OD280 <1.8 有蛋白污染 OD260/OD280 = 纯度好 OD260/OD280 >2.0 有部分降解 OD260/OD230 <2.0 有异硫氰酸胍或 β- 巯基乙醇残留得率 :Yield=OD260 稀释倍数 40ng/μL 2. 电泳检测 ( 图 2) DNA 残留蛋白残留图 2. RNA 琼脂糖电泳图 3. RNA 完整性检测 ( 图 3) Agilent20 生物分析仪及其配套 RNA 检测试剂盒 RIN(RNA 完整性指数 ) 可对 RNA 样本进行 1- 分级, 分值越高, 质量越好图 1. Array Pure(TM) Nano-scale RNA Purification Kit 提取 RNA, real-time PCR 结果展示图 3. Agilent20 检测结果图 39

3 五.Trouble Shooting Problem Possible cause Suggestions RNA 降解或没有 RNA RNA 质量差或得率低基因组 DNA 污染下游实验受干扰存在 RNA 酶污染试剂操作不当试剂保存不当样本保存不当样本前处理不完全充分研磨样本样本上样量太大裂解不充分柱子堵塞 DNA 酶失活或未添加 DNA 酶 RNA 中残留乙醇或盐 RNA 保存不当六. 产品订购信息注意操作台枪头等去 RNA 酶处理, 戴口罩手套确认实验前, 相应的试剂中已加入乙醇 RNA 酶抑制剂 DNA 酶等, 确认试剂没有过期或出现沉淀各试剂严格按照说明书保存样本需保存在液氮 -70 或保护试剂中, 避免内源性和外源性 RNA 酶污染减少样本上样量减少样本上样量或增加裂解液减少样本上样量, 上柱前样本均相化处理确认 DNA 酶活性, 可重新配置 DNA 酶溶液可增加洗涤液量或增加洗涤次数, 洗涤液温度过低, 洗涤不充分 -70 保存或立即逆转录成 cdna 保存, 避免 RNA 酶污染, 避免冻融应用厂家货号产品名规格植物样本 FFPE 样本珍贵样本 NucleoSpin RNA Plant Kit MPR090 MasterPure Plant RNA MPR090 Purification Kit NucleoSpin FFPE RNA/ DNA Kit NucleoSpin FFPE RNA Kit QFR82805 QuickExtract FFPE 5 QFR820 RNA Extraction Kit NucleoSpin RNA XS Kit MPS040 ArrayPure Nano-scale RNA Purification Kit 2. FUJIFILM QuickGene RNA blood cell Kit QuickGene RNA tissue Kit II QuickGene RNA cultured cell Kit QuickGene RNA cultured HC Kit 配合 QuickGene 8/mini80 仪器操作, 减少外源性 RNA 酶污染, 更方便快捷并配有不同物种不同组织优化的 protocol, 详情可参见 nucleic_acid_isolation/guides/category/rna.html 3. CENTRE MasterPure RNA Purification Kit ExactSTART Small RNA Cloning Kit ExactSTART Eukaryotic mrna 5 - & 3 -RACE Kit ExactSTART Full-Length cdna Library Cloning Kit mrna-only Prokaryotic mrna Isolation Kit with Poly(A)-Tailing mrna-only Prokaryotic mrna Isolation Kit mrna-only Eukaryotic mrna Isolation Kit 详情可参见 h t t p : / / w w w. e p i b i o. c o m / c a t e g o r y. asp?catid=74 参考文献 [1] Mol Vis Oct 2;12: [2] Cancer Res Jan;8(1): [3] Clin Immunol Mar;1(3): Review. [4] 中华肝脏病杂志 ;2006 年 02 期 [5] 细胞与分子免疫学杂志,2007,23(9): [6] J Immunol Methods Aug 1;254(1-2):9-18. [7] Anticancer Res May-Jun;26(3A): [8] Am J Transplant Jan;7(1): [9] Blood Mar 1;5(5): 七. 其它特色 RNA 相关产品 1. MN NucleoBond RNA/DNA Kit NucleoSpin mirna Kit NucleoSpin TriPrep Kit NucleoSpin RNA/Protein Kit NucleoSpin RNA Clean-up/XS Kit NucleoTrap mrna Kit 详情可参见 40

2004级研究生现代免疫学实验技术结业报告

2004级研究生现代免疫学实验技术结业报告 PCR PCR PCR RT-PCR PCR (Polymerase Chain Reaction,PCR) 80 DNA, DNA PCR PCR PCR DNA PCR -- -- DNA DNA 93 DNA PCR DNA DNA ( ) DNA 55 DNA DNA -- TaqDNA dntp DNA -- -- PCR PCR DNA DNA Y (1 X) n Y DNA X (Y)

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