2 简介 RaPure Kits 系列是 Magen 公司专门为快速核酸提取而设计的产品 RaPure 采用硅胶柱纯化技术, 提取过程只需简单的结合 - 洗涤 - 洗脱三个步骤就可以完成整个提取过程 RaPure Plant DNA Kit 适合于从植物叶片种子茎根块真菌等样品中快速提取总 DNA, 整个提取过程无需接触酚氯仿抽提, 只需 20 分钟就可以完成数个样品的提取工作纯化的 DNA 可直接用于 PCR 定量 PCR 等应用 RaPure Plant DNA Kit 提供两个流程, 快速提取流程适合于从小于 100mg 新鲜或冻藏植物或真菌样品或 15~30mg 干燥样品中提取 2~20µg 总 DNA; 难提取流程适合于从难提取或 DNA 含量较低的样品 ( 如干燥样品 ) 中提取 5~25µg 总 DNA 原理 RaPure 硅胶柱是采用高结合力的玻璃纤维滤膜为基质滤膜在高浓度离子化剂 ( 如盐酸胍或异硫氰酸胍 ) 条件下, 可通过氢键和静电吸附核酨, 而蛋白质或其它杂质不被吸附而去除, 吸附了核酸的滤膜经洗涤液去除蛋白质和盐, 最后可以用低盐缓冲液 ( 如 Buffer TE) 洗脱出滤膜上吸附核酸得到的核酸纯度高, 可直接用于各种下游各种实验 RaPure Plant DNA Kits 基于硅胶柱纯化方式样品经液氮或研磨仪匀浆后, 在裂解液中裂解,DNA 释放到裂解液中离心去除杂质后, 加入高盐结合液调节结合条件后, 转移至柱子中过滤,DNA 被吸附到柱子的膜上, 而蛋白质则不被퐸附而去除柱子经 Buffer GW2 洗涤去除盐分, 最后 DNA 经 Buffer AE 洗脱得到的 DNA 可直接用于 PCR, SSR, AFLP, RAPD, 以及 Southern blot 等实验第 2 页共 8 页

3 组成 RaPure Plant DNA Kit 产品编号 D D D 纯化次数 10 次 50 次 250 次 HiPure DNA Mini Columns II ml Collection Tubes Buffer PTL 30 ml 2 x 80 ml 3 x 250 ml Buffer MPB 15 ml 50 ml 250 ml Buffer GW2* 3 ml 20 ml 2 x 50 ml Buffer AE 10 ml 50 ml 250 ml 说明书 * Buffer GW2 使用前需加入 4 倍体积的无水乙醇进行稀释保质期 RaPure Plant DNA Kits 可在室温下 (15-25 ) 干燥保存 12 个月在低温下,Buffer PTL 和 Buffer MPB 可能会有沉淀析出,65 温育让沉淀完全溶解后再使用方案 1. 植物样品 DNA 快速提取第 3 页共 8 页

4 该方案适合于从小于 100mg 新鲜 / 冻藏或 30mg 干燥植物 / 真菌样品中快速提取的总 DNA, 纯化的 DNA 包括基因组和叶绿体 DNA 以下离心都在室温下进行 1. 用液氮把植物样品研磨成粉末转移 100mg 新鲜 / 冻藏植物或真菌样品或 20mg 干燥样品至 1.5 ml 离心管中除液氮研磨外, 也可以用珠磨仪 ( 如 FastPrep-24,2010 Gene Grinder) 玻璃匀浆器或机械匀浆器进行匀浆采用珠磨仪匀浆时, 我们推荐使用 2ml 植物匀浆管, 该匀浆管包含数粒钢珠和菱角锋利珠子, 能高效地对植物样品进行分散研磨由于植物样品代谢物质含量差别很大, 初次使用时, 推荐起始用量为 50mg 新鲜样品或 15mg 干燥样品, 根据结果再调整样品用量 2. 立即加入 450µl Buffer PTL 至样品中, 涡旋使样品充分分散 65ºC 处理 10 分钟 ( 可选 ) 每 ml Buffer PTL 加入 20µl 2- 疏基乙醇, 有利于提高裂解液的抗氧能力处理多酚丰富的样品时, 还可以加入 PVP-40 至 Buffer PTL 中至终浓度为 2%, 以提取裂解液的抗氧化能力 ( 可选 ) 若样品富含多糖类或蛋白类物质, 样品消化后, 可加入等倍体积氯仿至裂解液中, 涡旋混匀 30 秒再按第三步操作由于氯仿毒性较强, 建议在通风橱中进行操作转移氯仿时, 可以在氯仿中吹吸 2 次后润湿枪头后再转移, 可避免氯仿从枪头中滴液普通植物和多数的真菌样品, 特别是经济作物类样品, 不需要氯仿抽提 3. 14,000 x g 离心 3 分钟小心转移 300µl 上清液至新的离心管中若需提高产量, 样品量可提升至 200mg( 新鲜 ) 或 50mg( 干燥 ), 加入 0.8ml Buffer PTL 进行裂解, 离心后转移 600µl 的上清液 4. 加入 1.5 倍体积 Buffer MPB 至上清液中, 涡旋混匀 20 秒按离心方案或负压抽滤方案进行操作若上清液体积为 300µl, 则需加入 450µl Buffer MPB 若上清液体积为 600µl, 则需加入 900µl Buffer MPB, 此时第 5 步要分两次转移至 DNA 结合柱中离心方案 5. 把 DNA 结合柱装在收集管转移混合液至柱子中 10,000 x g 离心 30~60 秒 DNA 柱一次能装 750µl 溶液, 若样品体积超过 750µl, 分次转移至柱子中并离心过滤 6. 倒弃滤液把柱子装回收集管加入 700µl Buffer GW2( 已用无水乙醇稀释 ) 至柱子中 10,000 x g 离心 30~60 秒 Buffer GW2 在使用之前, 必须用无水乙醇进行稀释按瓶子标签进行稀释第 4 页共 8 页

5 7. 倒弃滤液把柱子装回收集管加入 300µl Buffer GW2( 已用无水乙醇稀释 ) 至柱子中 10,000 g 离心 2 分钟去除柱子中残留的乙醇取出柱子要小心, 不要让柱子的底部接触到废液, 若碰到废液,10,000 x g 离心空甩 1 分钟 8. 小心取出柱子并转移至新的 1.5ml 离心管中加入 30~100µl 预热到 65ºC Buffer AE 至柱子的膜中央室温静置 2 分钟 10,000 g 离心 1 分钟 9. ( 可选, 最高产量 ) 再加入 30~100µl 预热到 65ºC Buffer AE 至柱子的膜中央室温静置 2 分钟 10,000 g 离心 1 分钟 10. 丢弃 DNA 结合柱, 把 DNA 保存于 -20 或 -80 负压抽滤方案 5. 连接好真空泵和抽滤盒, 把 DNA 柱子插到抽滤盒的接口处 6. 把第 4 步获得的混合液转移至柱子中打开真空泵进行抽滤, 把混合液转入柱子中进行抽滤 7. 溶液过滤完毕后, 加入 600µl Buffer GW2( 已用无水乙醇稀释 ) 至柱子中 ; 使用前 Buffer GW2 必须用无水乙醇稀释稀释条件请按瓶子上的标签指示 8. 溶液过滤完毕后, 再加入 600µl Buffer GW2 至柱子中过滤后关闭真空泵 9. 取下柱子并套在收集管中 10,000 x g 离心 2 分钟干燥柱子 10. 小心取出柱子并转移至新的 1.5ml 离心管中加入 30~100µl 预热到 65ºC Buffer AE 至柱子的膜中央室温静置 2 分钟 10,000 g 离心 1 分钟 11. ( 可选, 最高产量 ) 再加入 30~100µl 预热到 65ºC Buffer AE 至柱子的膜中央室温静置 2 分钟 10,000 g 离心 1 分钟 12. 丢弃 DNA 结合柱, 把 DNA 保存于 -20 或 -80 第 5 页共 8 页

6 方案 2. 植物样品 DNA 高产量提取方案该方案适合于从 DNA 含量较低的植物样品中提取高产量的 DNA, 样品量可达到 0.5g 新鲜 / 冻藏样品或 0.1g 干燥样品纯化的 DNA 包括基因组 DNA 和叶绿体 DNA 以下离心都在室温下进行 1. 用液氮把植物样品研磨成粉末转移 250~500mg 新鲜 / 冻藏植物或真菌样品或 50~100mg 干燥样品至 15ml 离心管中除液氮研磨外, 也可以将用珠磨仪 ( 如 FastPrep-24,2010 Gene Grinder) 或机械匀浆器进行匀浆 HiPure DNA Mini Column II 最大结合力 30µg, 富含 DNA 的植物样品进行该方案时其产量也不会明显提高 2. 立即加入 2.5ml Buffer PTL 至样品中, 涡旋 30~60 秒使样品充分分散 65ºC 处理 10 分钟 ( 可选 ) 每 ml Buffer PTL 加入 10µl 2- 疏基乙醇, 有利于提高裂解液的抗氧能力处理多酚类丰富的植物样品, 可加入 PVP-40 至 Buffer PTL 中至终浓度为 2%, 以进一步提取裂解液的抗氧化能力处理干燥样品时, 延长 65ºC 处理时间至 1 小时有利于提高产量 3. 加入 2.5ml 氯仿或氯仿 / 异戊醇 (24:1) 至裂解液中, 涡旋混匀 30 秒 3,000~5,000 x g 离心 15 分钟由于氯仿毒性较强, 建议在通风橱中进行操作转移氯仿时, 可以在氯仿中吹吸 2 次后润湿枪头后再转移, 可避免氯仿从枪头中滴液 4. 小心转移上清液至新的 15ml 离心管中加入 0.7 倍体积的异丙醇至上清液中颠倒混匀 30~50 次,3,000~5,000 x g 离心 5 分钟 5. 小心倒弃上清液短暂离心, 用移液枪彻底吸弃残留的溶液 6. 加入 300µl Buffer AE 至 DNA 沉淀团中,65ºC 振荡温育 30~60 分钟让 DNA 充分溶解有些样品 DNA 可能很难溶解, 可延长溶解时间至过夜振荡有利于加速 DNA 的溶解速度用其它方法抽提 DNA, 也可以按以下流程进行纯化取 50~300µl 粗制 DNA(<30µg) 至 1.5ml 离心管中, 然后按第七步进行操作 7. 加入 450µl Buffer MPB 至 DNA 溶液中, 颠倒混匀 30~50 次加入 Buffer AE 温育后仍可能有不溶解的物质, 加入 Buffer MPB 混匀后, 室温放置 10~30 分第 6 页共 8 页

7 钟可能有利于提高 DNA 的产量若有明显不溶解的物质,10,000 x g 离心 1 分钟去除杂质 8. 把 DNA 结合柱装在收集管中转移混合液至柱子中 10,000 x g 离心 30~60 秒 9. 倒弃滤液把柱子装回收集管加入 700µl Buffer GW2( 已用无水乙醇稀释 ) 至柱子中 10,000 x g 离心 30~60 秒 Buffer GW2 在使用之前, 必须用无水乙醇进行稀释按瓶子标签进行稀释 10. 倒弃滤液把柱子装回收集管加入 300µl Buffer GW2( 已用无水乙醇稀释 ) 至柱子中 10,000 g 离心 2 分钟去除柱子中残留的乙醇取出柱子要小心, 不要让柱子的底部接触到废液, 若碰到废液,10,000 x g 离心空甩 1 分钟 11. 小心取出柱子并转移至新的 1.5ml 离心管中加入 30~100µl 预热到 65ºC Buffer AE 至柱子的膜中央室温静置 2 分钟 10,000 g 离心 1 分钟 12. ( 可选, 最高产量 ) 再加入 30~100µl 预热到 65ºC Buffer AE 至柱子的膜中央室温静置 2 分钟 10,000 g 离心 1 分钟 13. 丢弃 DNA 结合柱, 把 DNA 保存于 -20 或 -80 第 7 页共 8 页

8 常见问题解答该列表可能有利于解决提取过程所碰到的问题 Magen 技术人员可以随时为您提供服务, 若您对试剂盒存在问题或建议, 或您在分子生物学碰到问题, 都请您联系我们我们将竭尽能力为您排扰解难现象柱子堵塞转移上清液时带有太多沉淀裂解液非常粘稠离心速度太低 DNA 产量低样品匀浆不充分样品裂解不充分不正确的结合条件样品的 DNA 含量太低 DNA 上柱前没有充分溶解洗脱效率不够 Buffer GW2 中乙醇没有加入或加入量不够柱子没有空甩原因及解决方法在下一次提取过程中, 转移上清液时不要吸到沉淀物若吸到沉淀物, 可把上清液再离心一次某些植物样品中含有丰富的粘液和高分子多糖, 会让裂解液变得非常粘稠减少样品用量或加入 Buffer PTL 的用量提高离心速度用液氮将样品研磨细小的粉末状或延长珠磨仪的研磨时间和速度加入 Buffer PTL 后, 没有让植物样品充分分散而涡旋无法让样品充分分散, 可用移液枪吸打几次计算上清液的体积, 加入正确的 Buffer MPB 推荐使用方案 2 进行抽提使用方案 2 时,DNA 在 Buffer AE 中没有充分溶解, 延长 DNA 溶液时间至过夜洗脱时 Buffer AE 预热至 65, 并加到膜中央, 室温放置 3 分钟 Buffer AE 的洗脱体积不够按说明书或瓶子标签所示, 加入正确的乙醇柱子必须空甩 2-3 分钟以去除膜上残留的乙醇第 8 页共 8 页

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